全 文 ：香子含笑中的杀线虫活性成分及其毒力测定
李国红 , 洪林军 , 李可琴 , 张克勤
(云南大学生物资源保护与利用重点实验室 , 昆明 650091)
摘要:根据活性追踪分离 ,从香子含笑叶的乙酸乙酯提取物中分离纯化到一个杀线虫的倍半
萜。通过质谱 、核磁共振的光谱数据 ,鉴定该化合物为小白菊内酯。生物活性测定结果表明小
白菊内酯对所测试的松材线虫和全齿复活线虫具有毒杀作用 ,浓度 200μg/ml对两种线虫进行
处理 ,48h的死亡率分别为 70.4%和 100%。
关　键　词:香子含笑;小白菊内酯;松材线虫;全齿复活线虫;杀线虫活性
中图分类号:S763.18.24;S767.37　文献标识码:A　文章编号:1005-9261(2007)03-0260-04
Nematicidal Active Component from Michelia hedyosperma
LI Guo-hong , HONG Lin-jun , LI Ke-qin , ZHANG Ke-qin
(Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resource , Yunnan University , Kunming 650091 , China)
Abstract:A nematicidal sesquiterpene was isolated from the ethyl acetate extract of Michelia hedyosper-
ma Law according to bioassay-guided fractionation.The compound was identified as parthenolide based on
the MS and NMR spectral data.The bioassay results showed that parthenolide had nematicidal activity a-
gainst tested nematode Bursaphelenchus xylophilus and Panagrellus redivivus , and their death rate at 200
μg/ml within 48 h were 70.4% and 100% respectively.
Key words:Michelia hedyosperma;parthenolide;Bursaphelenchus xylophilus;Panagrellus redivivus;
nematicidal activity
收稿日期:2006-11-07
基金项目:云南省自然科学基金(2004C0003Q)
作者简介:李国红(1974-),女 ,博士 ,助理研究员 , E-mail:ghli1223@hotmail.com。
　　由松材线虫(Bursaphelencus xylophilus)引起的松材线虫病 ,是松树的一种毁灭性病害 ,也是
我国第一大森林病害[ 1] 。植物寄生线虫的防治一直以化学药剂为主 ,随着长期使用各种化学
农药所带来的环境污染问题的日趋严重 ,部分化学杀线剂被禁用 ,给线虫的防治造成了更大的
障碍 。因此人们在探索高效 、低毒 、低残留 、高选择性的杀线剂时 ,线虫生防制剂的研发越来越
受到重视。尽管生物杀线虫农药的研究和开发取得了显著进展 ,但目前开发的生防菌剂都是
利用生物体本身 。由于土壤是一个十分复杂的生态系统 ,土壤抑菌作用的存在及土壤中其他
微生物的竞争等因素导致该类菌剂防效不稳定 ,从而严重阻碍了这类菌剂的广泛使用[ 2] ,因此
利用生物次级代谢产物研发第二代线虫生防制剂备受关注 。
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23(3)260-263　　　　　　中国生物防治　Chinese Journal of Biological Control　　　　　　　 2007年 8 月
DOI :10.16409/j.cnki.2095-039x.2007.03.002
木兰科植物是最古老的一类高等生物 ,分部范围广 。该属植物不仅是重要的绿化观赏树
种和用材树种 ,还是重要的药用植物。近年来木兰属的部分植物被报道具有抗肿瘤活性 ,抗氧
化活性 ,治疗牙周病及其他抗炎活性 ,对中枢神经系统的作用 ,在美容护肤化妆品中的应用等
等[ 3] 。香子含笑(Michelia hedyosperma Law)为该科的含笑属(Michelia)植物 ,作者在筛选试验
中 ,发现其叶的乙酸乙酯提取物对线虫具有毒杀活性。因此我们对该植物的杀线虫活性成分
的分离鉴定和活性测定进行了研究 。
1　材料与方法
1.1　供试植物和仪器
香子含笑采自中国科学院昆明植物研究所植物园内。正相柱层析硅胶(200 ～ 300目)为青
岛海洋化工厂产品;柱层析凝胶:Sephedax LH-20为Amersham 公司产品;硅胶 G板为青岛海
洋化工厂产品;分离所用的溶剂均为重蒸的工业纯试剂;仪器:ESI-MS , VG Auto Spec-3000质
谱仪 ,Bruker DRX-500超导核磁共振仪。
1.2　供试线虫的培养及制备
松材线虫和全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)保存于云南大学生物资源保护与利用重点
实验室 。接种灰葡萄孢(Botrytis cinerea)于 PDA平板 ,25℃培养至菌丝长满平板 ,接入松材线
虫 ,25℃培养至菌丝消失 ,线虫长满平板 ,冰箱中 4℃保存。全齿复活线虫在燕麦片培养基上
25℃培养 10d 后放入冰箱中备用 。使用时将载有线虫的培养基挑出置培养皿中 ,加入适量无
菌水 ,将线虫洗出 ,制备成线虫悬液 。其浓度约为 300条/ml。
1.3　化合物提取与分离
将采集到的香子含笑叶用自来水冲洗 ,于 50℃烘箱中烘干 。取样品(350g)用丙酮提取 3
次 ,合并浓缩回收溶剂后 ,提取物浓缩得浸膏 13.3g 。用乙酸乙酯提取 , 得乙酸乙酯提取物
7.6g 。活性测定表明乙酸乙酯的提取物具有杀线虫活性 。该部位提取物经硅胶柱层析(90g),
用石油醚-丙酮溶剂系统梯度洗脱 ,根据 TLC 合并得 16个组分(Fraction 1-16)。活性检测证明
组分 8和 9具有杀线虫活性 ,将这两部分合并(Fr8-9)后重 750mg 。活性部位 Fr8-9经硅胶柱
(10g)层析 ,用石油醚-丙酮(9∶1)洗脱 ,再经凝胶 Sephedax LH-20柱(10g)纯化 ,丙酮洗脱得化合
物1(220mg)。
1.4　活性测定
取线虫悬浮液和丙酮溶解的样品加到直径为 6cm的培养皿中。样品浓度配制成 50 、100 、
200μg/ml ,但丙酮含量不超过 5%(体积分数)。将样品和线虫(约 600条)轻轻混匀后将培养皿
于室温下静置。在解剖镜下随机选择 5 ～ 7个视野 ,于 24 和 48h分别进行观察 ,计数死虫数
(用针尖挑刺 ,以线虫僵直不动为死亡)和总线虫数。每处理 2个重复 ,以含 5%丙酮(体积分
数)的线虫悬浮液为对照 。计算测试样品对线虫的平均致死率。
1.5　化合物的理化性质
化合物1为白色粉末;mp114-115°;[ α] 22D 80°(c0.56);ESI-MS m/z 249[M +H] ;5%硫酸
显紫红色。1H-NMR(CDCl3 , 500MHz)δ:6.34(1H , d , J=3.7 ,H-13),5.63(1H , d , J=3.3 ,H-13),
5.22(1H ,br , d , J=12.4 ,H-1),3.88(1H , t , J=8.7 ,H-6),2.80(2H , d , J=6.0 ,H-5 ,H-7),2.36-
2.42(2H , m ,H-2β ,H-9β), 2.13-2.20(4H , m ,H-2α,H-3β ,H-8α,H-9α), 1.77(1H , m ,H-8β),1.71
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　第 3 期 　　 　　　　　李国红等:香子含笑中的杀线虫活性成分及其毒力测定　　 　　　　　　　　　　
(3H , s , H-14), 1.30(3H , s , H-15), 1.26(1H , m ,H-3α,);13C-NMR(CDCl3 , 125MHz)δ:169.2(C-
12), 139.4(C-11), 134.6(C-10),125.4(C-1), 121.1(C-13),82.5(C-6), 66.5(C-5), 61.5(C-4),
47.8(C-7),41.3(C-9),36.4(C-3),30.9(C-8),24.2(C-2),17.3(C-15),17.0(C-14)。
2　结果与分析
2.1　化合物1的结构鉴定
　　根据13C及 DEPT ,发现化合物 1有十五个碳信号 ,包括两个双键
(δ:139.4 ,134.6 ,125.4 ,121.1),其中一个双键为端基双键 ,一个羰基
(成酯)(δ:169.2)以及两个甲基 ,是一个明显的倍半萜内酯的骨架
信号(图)。根据 1H-NMR ,发现有两个甲基为单峰(δ:1.71 ,1.30),
两个单峰为端基双键的氢(δ:6.34 , 5.63)。根据质谱所给的分子量
m/z 249[M +H] + ,结合 DEPT 及1H 信号 ,得出分子式为 C15H20O3 。
参照文献[ 4]鉴定化合物 1为小白菊内酯(parthenolide)。 图　小白菊内酯的结构
2.2　杀线虫活性
生物活性测定结果表明 ,小白菊内酯对测试的两种线虫具有毒杀活性(表),且对全齿复活
线虫的毒杀活性明显高于松材线虫 ,而对照仅有微弱活性。
表　化合物 parthenolide 对松材线虫和全齿复活线虫的致死率(%)
处理 浓度 全齿复活线虫 松材线虫(μg/ml) 24h 48h 24h 48h
小白菊内酯 200 100 100 61.5 70.4
100 79.4 91.2 38.1 51.2
50 48.7 64.8 16.7 29.6
对照 1.5 2.0 1.2 1.8
3　讨论
植物是寻找活性天然产物的主要来源之一。但目前植物杀线虫活性成分的研究主要是停
留在植物粗提物对线虫的活性测定 ,仅有少部分植物报道了活性成分 ,如从马缨丹(Lantana
camara)中分离的化合物 lantaniside 、linaroside 、camarinic acid对根结线虫(Meloidogyne spp.)有活
性[ 5] ,从苦豆草(Sophora alopecuroides)中分离的苦豆碱具有毒杀松材线虫的作用[ 6]等。小白菊
内酯在木兰科植物中曾被分离到 ,根据文献报道 ,小白菊内酯具有抗菌作用[ 7] 、抗肿瘤作用[ 8] 、
消炎作用[ 9] ,但还未有该化合物毒杀线虫的报道 。本研究首次报道从植物香子含笑中分离到
该化合物。说明用不同的生物活性模型对植物次生代谢产物进行筛选 ,将会发现植物及其次
生物更多的生物学功能。
参 考 文 献
[ 1] 　程瑚瑞.松材线虫萎蔫病的发生和研究进展[ J] .植物检疫 , 1988 , 2:11-17.
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 生 物 防 治　　　　　　　　　　　　　　　第 23 卷
实验技术
苏云金杆菌 HBF-1菌株在土壤中
毒蛋白含量的 ELISA检测
吴瑞华1 , 2 , 李国勋3 , 王容燕2 , 王金耀2 , 冯书亮2＊
(1.河北农业大学植物保护学院 , 保定 071001;2.河北省农林科学院植保所 , 保定 071000;3.莱阳农学院 , 青岛 266109)
摘要:以苏云金芽孢杆菌HBF-1菌株中分离纯化的高特异性杀虫蛋白作为抗原 ,免疫新西兰
白兔制备出多克隆抗体 ,其效价可达到 16000。应用制备的特异性抗体建立了间接酶联免疫
吸附测定法(ELISA),检测不同土壤样品中 Bt毒蛋白含量 。初步结果表明 ,该方法能够检测土
壤中 Bt毒蛋白的含量 ,因土壤理化特性及组成成分的不同 ,检测到的毒蛋白含量也略有不同 ,
河沙中的蛋白检测量最低 ,只有12.53%;另一种沙壤混合物中检测量达到 76.16%。
关　键　词:HBF-1菌株;毒蛋白;多克隆抗体;间接 ELISA;土壤
中图分类号:S476.12　　文献标识码:A　　文章编号:1005-9261(2007)03-0263-06
Detection of Bacillus thuringiensis Strain HBF-1 Protoxin in Soil
by Enzyme-linked Immunosorbent Assay
WU Rui-hua , LI Guo-xun , WANG Rong-yan , WANG Jin-yao , FENG Shu-liang
(College of Plant Protection , Agricultural University of Hebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:With the SDS-PAGE preparation electrophoresis , high quality insecticidal protein was purified
收稿日期:2006-09-26
基金项目:国家 863计划(2006AA02Z189);河北省自然科学基金项目(C20050006420);河北省农科院青年基金项目
(A06050101)
作者简介:吴瑞华(1981-),女 ,硕士生;＊通讯作者 , E-mail:f shliang@heinfo.net。
[ 5] 　Begum S , Wahab A , Sidddiqui B S.Nematicidal constituents of the aerial parts of Lantana camara[ J] .Journal of Natural Product ,
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263
23(3)263-268　　　　　　中国生物防治　Chinese Journal of Biological Control　　　　　　　 2007年 8 月