全 文 ：罗凤霞，李玉萍，王春彦，等． 豹斑百合组织培养体系研究［J］． 江苏农业科学，2011，39(6) :54 － 57．
豹斑百合组织培养体系研究
罗凤霞，李玉萍，王春彦，张 翔
(金陵科技学院园艺系，江苏南京 210038)
摘要:为了获得豹斑百合(Lilium pardalinum)的组培快繁体系，以来自美洲 2 个地区的豹斑百合种子为材料进行
研究。结果表明，不同种源的种子和胚均可诱导出苗，但俄勒冈州种源优于内华达州种源，胚培养可以提前 3 个月出
苗，诱导培养基以 MS + IBA 0． 3 mg /L +谷氨酰胺 100 mg /L平均诱导率最高为 58． 35%。不同种源苗继代培养时，在
最初的 2 代内继代增殖倍数差异较大，俄勒冈州种源增殖倍数大于内华达州种源，但继代培养 3 次后，增殖倍数均大
幅提高，2 个种源增殖倍数差异不大，基本稳定，以 MS + 6 － BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 15 mg /L 增殖倍数最高，平均为
3． 75 倍 /45 d。不同种源苗生根率和生根数差异不大，生根培养基以 MS + IBA 0． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L为佳，30 d生
根率可以达到 99%，平均根数 5． 7 条 /株。
关键词:豹斑百合;种子;种源;组织培养;快速繁殖
中图分类号:S682． 2 + 65． 03 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2011)06 － 0054 － 03
收稿日期:2011 － 01 － 12
基金项目:江苏省农业科技自主创新资金［编号:CX(09)608］;北京
市重点花卉项目(编号:ylhh2008001)。
作者简介:罗凤霞(1958—) ，女，内蒙古敖汉旗人，硕士，教授，主要从
事园林植物育种研究。E － mail:luofx@ 126． com。
豹斑百合(Lilium pardalinum)为百合科百合属多年生具
鳞茎草本植物。为美洲特产，主产于美国太平洋沿岸的加利
福尼亚州、内华达州和俄勒冈州，株高 120 ～ 210 cm，叶片轮
生，总状花序着花 10 余朵，下垂，橙红色，具绯红棕色斑点，无
香味，具有一定的观赏价值，同时又是可食用百合，是美洲百
合中最耐寒和最容易栽培的一种，并与美洲原产的汉博百合
(L． humboldtii)、华盛顿百合(L． washingtonianum)以及帕里
百合(L． parryi)杂交获得了很多杂交百合新品种［1］。豹斑百
合常规繁殖方法为分球繁殖，但种质资源数量有限。虽可用
鳞片扦插繁殖，但往往容易腐烂。组织培养可保持百合的优
良种质特性，又可在较短时间内快速繁殖获得大量种苗。豹
斑百合在我国未见引种栽培报道，组织培养体系研究国内外
均未见报道，涉及到豹斑百合组培的报道仅见于日本的 Shiro
Mori等的研究［2］。研究百合的转基因体系利用百合属植物
的各种外植体诱导愈伤组织，并未涉及快繁。本研究以 2 个
种源的豹斑百合种子为试材，参照其他种类的百合种子组培
研究方法［3 － 5］，得到了豹斑百合的组培体系。
1 材料与方法
1． 1 材料
试验材料为来自于美国的 2 个种源的豹斑百合种子，种
子于 2008 年 11 月到货，俄勒冈州约瑟芬县种源(以下简称
b1)400 粒;内华达草原区种源(以下简称 b2)400 粒。为当年
新采收种子。试验于 2009 年在金陵科技学院园艺系植物组
织培养实验室进行。
1． 2 初代诱导培养方法
1． 2． 1 培养基的设计 初代诱导阶段设计了如下 4 种培养
基，A1:MS;A2:MS + 谷氨酰胺 100 mg /L;A3:MS + IBA
0． 3 mg /L;A4:MS + IBA 0． 3 mg /L +谷氨酰胺 100 mg /L。以
上培养基蔗糖均为 30 g /L，琼脂 6 g，pH值 6． 0，121 ℃高压灭
菌 20 min。
1． 2． 2 接种和培养方法 (1)种子接种。b1 和 b2 种源种子
各 200 粒，在超净工作台上用 0． 1% HgCl2 消毒 10 min，无菌
水清洗 5 次，接种到 4 种培养基中。种子接种后放入 4 ℃冷
库休眠 3 个月后，再放入培养室培养。(2)胚接种。b1 和 b2
种源种子各 200 粒，用 0． 1% HgCl2 消毒 10 min，无菌水清洗
5 次，然后浸泡在无菌水中 24 h 后剥胚，接种到 4 种培养基
中。(3)培养方法。培养室温度(23 ± 2)℃，光照强度 1 000
～ 1 200 lx，光照时间 14 h /d。
1． 2． 3 统计方法 剥胚培养当天分别对不同种源进行计数
和统计出胚率，出胚率 =播出胚数 /种子数 × 100%。放入培
养室培养 45 d后，调查不同种源、不同外植体类型和不同培
养基的成活率，成活率 =成活种子(胚)数 /(接种数 －污染
数)× 100%。并对数据做 Excel图进行比较分析。
1． 3 继代扩繁方法
1． 3． 1 继代培养基的设计 继代培养设计了如下 3 种培养
基，B1:MS + 6 － BA 0． 5 mg /L + IBA 0． 05 mg /L;B2:MS +
6 － BA 1． 0 mg /L + IBA 0． 1 mg /L;B3:MS +6 － BA 1． 5 mg /L +
IBA 0． 15 mg /L。培养基的蔗糖、琼脂和灭菌方法同“1． 2． 1”。
1． 3． 2 接种和培养方法 将芽苗分 b1、b2 分别接种在 4 种
培养基中，连续培养 4 次。培养方法同“1． 2． 2”。
1． 3． 3 数据处理方法 4 次接种 45 d后分别种源和培养基，
调查增殖倍数，增殖倍数 = 45 d 繁殖苗数 /接种苗数。并对
数据做 Excel图进行比较分析。
1． 4 生根培养方法
1． 4． 1 生根培养基的设计 生根培养设计了如下 4 种培养
基，C1:MS;C2:MS + IBA 1． 0 mg /L;C3:MS + NAA 1． 0 mg /L;
C4:MS + IBA 0． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L。培养基的蔗糖、琼
脂和灭菌方法同“1． 2． 1”。
1． 4． 2 接种和培养方法 将芽苗分 b1、b2 分别接种，每种培
—45— 江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2011.06.205
养基各接种 20 瓶 × 3 株 /瓶 = 60 株。接种后直接入培养室培
养。培养方法同“1． 2． 2”。
1． 4． 3 数据处理方法 接种 30 d后，分别种源和培养基，调
查生根率和根数 /苗，生根率 =生根苗数 /接种苗数 × 100%，
根数 /苗 =总生根数 /接种苗数。并对数据做 Excel 图进行比
较分析。
2 结果与分析
2． 1 初代培养
2． 1． 1 不同种源种子的出胚率 不同种源的出胚率结果见
表 1。从表 1 看出:不同种源的种子出胚率不同，来自于俄勒
冈州约瑟芬县种源出胚率为 66． 0%，高于来自于内华达草原
区种源出胚率 48． 5%。
表 1 不同种源种子的出胚率
种源 种子数(粒) 剥出胚数(个) 出胚率(%)
b1 200 132 66． 0
b2 200 97 48． 5
2． 1． 2 诱导培养 胚和种子接种成活情况见图 1，2 个种源
的 2 种外植体在不同培养基上的成活率见表 2。
表 2 不同种源种子诱导培养状况
种源 外植体 培养基
接种数
(个)
成活数
(个)
污染数
(个)
成活率
(%)
b1 胚 A1 33 10 5 35． 7
A2 33 11 7 42． 3
A3 33 11 8 44． 0
A4 33 18 6 66． 7
种子 A1 50 8 11 20． 5
A2 50 8 15 22． 9
A3 50 10 9 24． 4
A4 50 15 10 37． 5
b2 胚 A1 24 3 4 15． 0
A2 24 5 8 31． 3
A3 24 6 7 35． 3
A4 25 8 9 50． 0
种子 A1 50 3 10 7． 5
A2 50 3 15 8． 6
A3 50 5 10 12． 5
A4 50 8 13 21． 6
对表 2 数据分别作种源、外植体相对与 4 种培养基的成
活率的 Excel折线图，结果见图 2 和图 3。
从表 2 和图 2、图 3 可看出:b1 种源的成活率明显高于 b2
种源，总平均诱导成活率 b1 为 36． 8%，b2 为 22． 7%，胚培养
的成活率平均为 40． 04%，优于种子培养的平均成活率
19． 44%，胚培养没有进行冷藏处理，得到种子后直接进行培
养，比种子培养提前 3 个月成苗;无论是胚还是种子培养，在
4 种培养基中呈现为递增趋势，从 A1 到 A4 平均成活率依次
为:19． 68%、26． 28%、29． 00%、43． 95%。
2． 2 继代培养
2 个种源的芽苗在 3 种不同继代培养基上的增殖倍数见
表 3，继代苗生长状况见图 1 － c。
—55—罗凤霞等:豹斑百合组织培养体系研究
表 3 不同种源豹斑百合继代培养增殖倍数
种源 培养基
增殖倍数
第 1 次 第 2 次 第 3 次 第 4 次 均值
b1 B1 1． 25 1． 95 2． 51 2． 44 2． 04
B2 1． 31 2． 30 2． 98 2． 66 2． 31
B3 1． 94 2． 75 3． 29 3． 44 2． 86
b2 B1 1． 14 1． 56 2． 31 2． 23 1． 81
B2 1． 29 1． 78 2． 69 2． 60 2． 09
B3 1． 43 2． 00 3． 38 3． 70 2． 63
对表 3 数据分别作培养基与继代次数、种源与继代次数
相对于增殖倍数的 Excel折线图，结果见图 4 和图 5。
从表 3 和图 4、图 5 中可以看出:随着继代次数的增多，
增殖倍数提高，到第 3 次后趋于稳定，接种在 B3 培养基上增
殖倍数最大，平均为 2． 75 倍，以稳定增殖的第 3 次与第 4 次
的均值为例，培养基 B1 的增殖倍数为 2． 37，B2 的增殖倍数
为 2． 73，B3 的增殖倍数为 3． 15。b1 种源在继代前 2 次增殖
倍数平均为 1． 92 大于 b2 种源的 1． 53。但继代 3 次后 2 个种
源的增殖倍数趋于一致，b1 种源的 3、4 次继代增殖倍数平均
为 2． 89，b2 种源 3、4 次的继代增殖倍数平均为 2． 82。
2． 3 生根培养
2 个种源的芽苗在 4 种不同生根培养基上的生根率和生
根数量见表 4，生根状态见图 1 － d。
对表 4 数据分别进行种源相对于不同培养基的生根率、
根数 /苗的 Excel折线图，结果见图 6 和图 7。
从表 4 和图 6、图 7 中可以看出:不同种源间生根率和生
根数差异不大，但生根培养基种类对生根有显著影响，从差到
到优依次为:C1 ＜ C3 ＜ C2 ＜ C4，平均生根率分别为:82%、
89%、95%、99%，每苗平均生根数分别为:3． 4 条、4． 1 条、
4． 9 条和 5． 7 条。
3 讨论
不同种源的种子离体培养成活率不同。俄勒冈州约瑟芬
表 4 不同种源豹斑百合生根状况
种源 培养基
接种
苗数
生根苗
数(苗)
生根数
(根)
生根率
(%) 根数 /苗
b1 C1 50 42 152 84． 0 3． 6
C2 50 47 221 94． 0 4． 7
C3 50 45 189 90． 0 4． 2
C4 50 49 284 98． 0 5． 8
b2 C1 50 40 128 80． 0 3． 2
C2 50 48 240 96． 0 5． 0
C3 50 44 176 88． 0 4． 0
C4 50 50 275 100． 0 5． 5
县种源明显优于内华达草原区种源，俄勒冈州种源的出胚率
为 66． 0%，内华达种源的出胚率仅为 48． 5%，诱导成活率俄
勒冈州种源为 36． 75%，内华达种源仅为 22． 73%。不同地区
种源成活率的差异原因可能是:不同地区豹斑百合生长发育
状态、种子的发育成熟度、出胚率不同，即使有胚形成，发育不
良的胚离体培养过程中死亡率也大。
外植体类型对诱导培养成活率有显著影响。研究结果表
明，胚培养明显优于种子培养，胚培养平均成活率为40． 04%，
优于种子培养的平均成活率 19． 44%。胚培养能提前 3 个月
成苗。2 个种源的豹斑百合很多种子尽管有完整的胚乳，但
是没有胚或胚细小、剥胚时碎裂，不能剥出，因此胚的成活率
高于种子。以剥胚和种子培养的起始数量各 200 粒统计，胚
培养共成活 71 粒，种子培养共成活 60 粒，胚培养也要优于种
子培养，原因有待于进一步研究。
诱导培养基类型对诱导成活率有显著影响。研究结果表
明，培养基中同时添加细胞分裂素和谷氨酰胺效果好，较佳培
(下转第 57 页)
—65— 江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期
孙正海，唐军荣，辛培尧，等． 三七几种后熟处理方式和 DNA提取方式比较［J］． 江苏农业科学，2011，39(6) :57 － 59．
三七几种后熟处理方式和 DNA提取方式比较
孙正海1，2，唐军荣2，辛培尧1，2，黎林梅1
(1．西南林业大学西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南昆明 650224;
2．西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南昆明 650224)
摘要:为建立三七种子后熟处理和 DNA提取技术体系，分别以种子活性、DNA纯度、浓度和提取时间为指标，比
较了三七 3 种后熟处理方式(昆明冬季常温处理、4 ℃冰箱内低温处理和昆明冬季沙埋处理)和 4 种 DNA 提取方式
(改良 CTAB法Ⅰ、改良 CTAB法Ⅱ、改良 CTAB法Ⅲ和改良 SDS法)的效果。结果发现，3 种后熟处理方式中昆明冬季
沙埋处理效果最好，处理后具有活力种子占 90%;4 种 DNA 提取方式都可以提取三七基因组 DNA，其中，改良 CTAB
法Ⅰ提取三七 DNA纯度较好，浓度较高，所需时间最短，在 4 种方式中综合效果最好。
关键词:三七;种子后熟;基因组 DNA提取
中图分类号:Q781 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2011)
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
06 － 0057 － 03
(上接第 56 页)
养基为:MS + IBA 0． 3 mg /L +谷氨酰胺 100 mg /L，平均诱导
成活率为 43． 95%，比 MS培养基的 19． 68%高出 24． 27%。
继代培养基类型对继代增殖率有显著影响。豹斑百合转
入继代培养基后，前 2 代生长缓慢，但到了第 3 代可形成丛生
芽，不同种源的芽苗继代增殖率差异不显著，都以 B3 培养基
MS +6 － BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 15 mg /L 的效果最好，45 d 平
均增殖率为 3． 75 倍。但比较 B2 和 B3 培养基，B3 中的苗较
B2 中的细弱，多次应用较高浓度激素培养，继代苗是否出现
玻璃化现象还有待进一步研究。
生根培养基类型对生根有显著影响。研究结果表明，不
同种源间生根率和生根数差异不大，生根培养基对生根率有
影响。IBA和 NAA混合使用高于单一的 IBA或 NAA;IBA对
豹斑百合生根的效果优于 NAA。
参考文献:
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出版社，1999:91 － 93
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［4］孙晓梅，付 强，曹 萍，等． 王百合的组织培养研究［J］． 辽宁
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［5］罗凤霞，徐桂华，金丽丽，等． 新铁炮百合微繁的研究［J］． 沈阳
农业大学学报，2000，31(3) :254 － 257．
三七(Panax pseudo － ginseng var． notoginseng)是五加科
人参属植物，是我国珍贵特产药材、著名传统中药，味甘、微
苦、性温、归肝、肾经，具止血、散瘀、消肿、止痛等功效。三七
分布范围十分狭窄，仅局限于北纬 23°30附近中高海拔地
区［1 － 2］。随着三七系列产品开发深度增加和应用范围拓宽，
三七社会需求量和种植面积呈较快增长，三七种子生产用量
也随之大幅增加，然而，三七种子存放过程中经常出现劣变现
象，从而造成品质下降。三七种子生物学特性研究较少，现已
确定三七为顽坳性种子，需经后熟完成种子成熟过程。化感
收稿日期:2011 － 08 － 31
基金项目:云南省应用基础研究项目(编号:2010ZC089) ;西南林业
大学校基金(编号:200611M) ;西南林业大学森林保护学云南省重
点学科资助项目(编号:XKZ200905) ;西南林业大学森林培育学云
南省重点学科资助项目(编号:XKZ200906) ;西南林业大学林木遗
传育种学校级重点学科资助项目(编号:XKX200904)。
作者简介:孙正海(1978—) ，男，山东昌邑人，博士，讲师，主要从事
植物种质资源评价、采后保鲜及生物技术辅助育种研究。Tel:
(0871)3863025;E － mail:sunzhenghai1978@ 163． com。
通信作者:辛培尧，博士，副教授，主要从事植物遗传育种方面的教学
与研究工作。Tel:(0871)3863022;E － mail:xpylt@ yahoo． cn。
物质、连作土壤组成、种子包衣剂组成、土壤消毒技术等对三
七种子贮藏及萌发的影响研究进展显著［3 － 8］，但不同后熟处
理方式对三七种子活力的影响研究甚少。三七分子生物学研
究进展显著，如指纹图谱构建、三七根皂苷合成相关基因差减
cDNA文库构建和 EST － SSR 标记辅助育种等［9 － 12］，但目前
还未见三七 DNA提取系统研究报道。为解决上述问题，本试
验研究和分析了 3 种后熟处理技术、4 种 DNA 提取技术的效
果，旨在为三七种子科学贮藏和快速、有效提取三七基因组
DNA提供技术支持。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
试验所需三七种子来自于云南省文山州麻栗坡县试验
田，为三年生三七当年新种子。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 三七种子处理方式 试验采用 3 种后熟处理方式:后
熟处理方式Ⅰ(昆明冬季常温处理，平均温度 12 ℃)、后熟处
理方式Ⅱ(4 ℃冰箱内低温处理)、后熟处理方式Ⅲ(昆明冬
季沙埋处理，平均温度 10 ℃)。
1． 2． 2 三七种子活力检测 从经过 3 种低温方法处理后的
—75—江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期