全 文 ：微生物学通报 AUG 20, 2012, 39(8): 11121119
Microbiology China © 2012 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：云南省自然科学基金面上项目资助(No. 2009CD073); 国家林业局 948项目竹子重要性状的基因工程研
究技术引进项目(No. 2008-4-30); 云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目(No. 2010CI016);
研究西南林业大学大学生创新基金项目(No. 1138); 西南林业大学大型仪器设备共享平台资助
*通讯作者： : zhix65.swfc@gmail.com
收稿日期：2011-12-08; 接受日期：2012-03-14
研究报告
一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定
刘绍雄 王娟 王金华 朱丽丽 熊智*
(西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室 云南 昆明 650224)


摘 要: 【目的】对一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定。【方法】采用改
良的 NA 培养基分离纯化菌株, 并通过菌体的形态结构观察、生理生化试验及其 16S
rDNA序列同源性分析对其进行鉴定。【结果】菌株 SWFU01的形态特征及生理生化试验
结果与解淀粉芽孢杆菌[Bacillus amyloliquefaciens (Fukumoto) Priest et al.]的描述基本相
同; 16S rDNA序列分析表明, 该菌株与解淀粉芽孢杆菌 JS在同一系统发育分支, 其同源
性为 99.28%。【结论】综合形态学特征、生理生化特征以及 16S rDNA序列分析的研究结
果, 菌株 SWFU01被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
关键词: 牡竹属, 解淀粉芽孢杆菌, 组织培养, 16S rDNA, 污染
Isolation and identification of pollution endophyte during
tissue culture of Dendrocalamus aspera
LIU Shao-Xiong WANG Juan WANG Jin-Hua ZHU Li-Li XIONG Zhi*
(Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,
Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650224, China)
Abstract: [Objective] To isolate and identify the endogenous bacteria, which caused tissue
culture contamination of Dendrocalamus aspera. [Methods] Using the improved NA culture
medium to isolate and identify the strain, then identify the bacterial species by morphology
observation, physiological and biochemical tests and the sequence analysis of the 16S rDNA.
刘绍雄等: 一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定 1113

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[Results] The morphological characteristics of the strain SWFU01, together with related phy-
siological and biochemical tests, match the descriptions of Bacillus amyloliquefaciens (Fuku-
moto) Priest et al.. The sequence analysis of 16SrDNA indicates that this strain has the same
embranchment with the Bacillus amyloliquefaciens JS in the Phylogenetic tree, the homology
is 99.28%. [Conclusion] By combining the traditional morphology observation and physio-
logical and biochemical tests, the SWFU01 strain is identified as Bacillus amylolique-
faciens.
Keywords: Dendrocalamus, Bacillus amyloliquefaciens, Tissue culture, 16S rDNA, Pollution
马来甜龙竹[Dendrocalamus aspera (J. A. et J.
H. Schult.) Backer ex Heyhe]原产亚热带地区, 属
禾本科(Gramineae)牡竹属(Dendrocalamus)大型
丛生竹类, 一般高 15 m−20 m, 胸径 10 cm−15 cm,
茎圆满通直, 质地坚韧[1−2], 是良好的建筑材料,
且竹笋甘甜味美, 糖分和谷氨酸含量高, 有较高
的国际贸易潜力[3], 此外, 竹笋还具清肺、化热、
消疾、爽胃、助消化、除积食、防便秘的功效, 对
于浮肿、腹水、急性肾炎、哮喘以及糖尿病、高
血压等也有一定的疗效。马来甜龙竹是南方地区
发展竹产业的速生、优良的生态竹种, 适应性广,
耐寒性强 , 生长迅速 , 繁殖能力强 , 生态效益
显著, 是江河流域保护堤岸、涵养水源的理想
竹种[4]。传统的竹子育苗方法(如埋杆、埋节等)
成本高、效率低, 不能满足山区笋用竹林发展的
需求[5]。近年来, 随着国内外科研工作者对竹子
组织培养广泛的研究, 为马来甜龙竹的快速繁殖
育种提供了科学的依据。因此, 利用组织培养方
法对其进行快速繁殖, 对发展马来甜龙竹及其产
业化生产具有重要的意义。
植物内生菌(Endophyte)是指存活于健康植物
组织内部, 而又不引发宿主植物表现出明显感染
症状的微生物类群, 主要包括真菌、细菌和放线
菌[6−7]。由于植物组织中普遍存在内生菌, 传统的
表面消毒方法无法完全杀死这些微生物, 因此在
植物组织培养中, 这些内生细菌的生长常引起程
度不一的污染, 对组培苗产生不同程度的危害。
内生细菌污染是普遍的, 如金线莲(Anoectochilus
roxburghii)组培中污染率达到 50%[8], 仙客来
(Cyclamen persicum)的块茎组织内生细菌污染率
达 83.0%[9], 地黄(Rehmanniaglutinosa)由于有内
生细菌的存在污染率达 100%等[10]。从已有的报
道看 , 被鉴定的种类主要有 : 黄单胞菌属
(Xanthomonas)[11]、芽孢杆菌属(Bacillus)、萄球菌
属 (Staphylococcus)[12] 、 假 单 胞 属
(Pseudomonas)[13] 、 土 壤 杆 菌 属
(Agrobacterium)[14]、葡肠杆菌属(Enterobacter)、
棒杆状菌属 (Corynebacterium)、沙雷氏菌属
(Serratia)、短小杆菌属(Curtobacterium)[15]、欧文
氏菌属(Erwinia)[16]等。内生菌污染是马来甜龙竹
外植体培养体系构建过程中的极大障碍, 至今尚
未有相关研究的报道。本研究通过对该菌株培养
基的改良、菌体的形态特征观察及其 16S rDNA
序列分析等, 对一株引起马来甜龙竹外植体培养
污染的内生菌进行了分离与鉴定, 为后期马来甜
龙竹培养基的优化、建立快速无性繁殖技术体系
提供重要的科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料: 马来甜龙竹采自西南林业大学
格林温室大棚。
1.1.2 试剂 : 蛋白胨、CMC-Na、Na2HPO4、
KH2PO4、琼脂、细菌基因组 DNA快速提取试剂
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盒(溶液型)、2×Taq PCR MasterMix等, 以上试剂
均由昆明硕阳科技有限公司提供。16S 通用引物
(27F-1492R)由上海生物工程技术服务有限公司
提供。
1.2 培养基改良
该菌株在普通牛肉膏蛋白胨培养基(NA)上
不能生长, 考虑到该株菌的内生微环境, 参照文
献[17]在 NA培养基中加入该竹子水提液。
马来甜龙竹茎叶水浸液的制备: 取健康植株
茎、叶(随机选取)分别打碎后等重量混合, 称取
80 g 加入 200 mL 水, 1×105 Pa灭菌 20 min 后无
菌纱布过滤。
改良牛肉膏蛋白胨培养基(NA): 1 000 mL
NA 培养基中含 20 mL 无菌马来甜龙竹茎叶水
浸液。
1.3 菌株的分离纯化及保藏
马来甜龙竹内生菌菌株SWFU01分离自被污
染的马来甜龙竹的外植体。该菌株在马来甜龙竹
的外植体(或继代)培养至 10−15 d 时引起严重污
染(图 1A)。内生菌菌株接于改良的 NA培养基中
进行分离纯化, 挑取单菌落于试管斜面中存于
4 °C 备用。
1.4 形态观察及生理生化试验
在光学显微镜下观察个体形态并测量菌体大
小, 参照文献[18]进行革兰氏染色和芽孢染色方
法进行形态结构观察及生理生化试验。通过糖发
酵试验、硫化氢产生试验、吲哚反应试验、硝酸
盐还原试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、V-P
试验、接触酶试验、生长温度、生长 pH及对氯化
钠和溶菌酶耐受性测试等对菌株的生理生化指标
进行测定, 以《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细
菌系统鉴定手册》为依据对菌株进行初步鉴定。
1.5 DNA提取和 16S rDNA扩增
菌株DNA的提取采用细菌基因组DNA快速
提取试剂盒(溶液型)。提取菌株基因组 DNA 后,
PCR 扩增 16S rDNA。正向引物: 5′-AGAGTTT
GATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′; 反向引
物 : 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCC
C-3′[19]。
PCR采用 50 μL反应体系: 2×Taq PCR Mas-
terMix 25 μL, Each primer (10 μmol/L) 2.5 μL,
1 μL DNA (20 ng左右), 补足灭菌双蒸水至50 μL。
16S rDNA-PCR 扩增条件: 95 °C 5 min; 95 °C
30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 3 min, 共 30个循环; 72 °C
10 min; 4 °C 30 min。PCR产物检测: 经质量分数
为 0.8%琼脂糖凝胶电泳后 EB染色观察, 用凝胶
成像仪照相。
1.6 16S rDNA序列分析
扩增的 PCR 产物送上海美吉生物医药科技
有限公司纯化并测序。从 GenBank中获取与该菌
株序列同源性较高的部分菌株序列(表 1), 用
ClustalX 按照最大同源性的原则进行排序, 并用
BioEdit 5.0.9进行序列对齐, 最后用MEGA 4软
件进行系统发育树构建, 以确定该菌株的系统发
育地位。
2 结果与分析
2.1 形态特征观察
菌株 SWFU01 (图 1)在改良的NA 培养基上呈
白色不透明菌落, 表面粗糙有隆起, 菌落边缘不规
则; 菌体革兰氏染色阳性, 直杆状, (0.5−2.5) μm×
(1.2−10) μm, 常以成对或链状排列, 具圆端或方
端, 具运动性, 形成芽孢, 芽孢囊膨大, 呈卵圆
形; 兼性厌氧。
2.2 生理生化试验
主要的生理生化测试结果(表 2), 与《伯杰氏
细菌鉴定手册》[20]及《常见细菌系统鉴定手册》[21]
描述的解淀粉芽孢杆菌[Bacillus amyloliquefaciens
(Fukumoto) Priest et al.]的生理生化特征基本相
同, 初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
刘绍雄等: 一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定 1115

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表 1 用于建树菌株相关信息
Table 1 Used for related information builds strains
菌株名称
Strain name
菌株编号
Strains numbers
登录号
Accession number
国家
Country
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum Nt1-7 HQ831418.1 China
Bacillus amyloliquefaciens A3-11 JF496342.1 China
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum Ns3-4 HQ831407.1 China
Bacillus subtilis T429 HQ441254.1 China
Bacillus licheniformis M2-3 EU882848.1 China
Bacillus methylotrophicus Kt9-27 JF460756.1 China
Bacillus amyloliquefaciens WA3-10 JF496478.1 China
Bacillus amyloliquefaciens R8 HQ259953.1 China
Bacillus tequilensis HLJKXC34 HQ844467.1 China
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum Nk10-22 HQ831402.1 China
Bacillus amyloliquefacien JS HM055608.1 China
Bacillus vallismortis / JF912890.1 China
Bacillus amyloliquefaciens SWFU01 JQ082511.1 China


图 1 菌株 SWFU01的形态特征
Fig. 1 The morphology of the strain SWFU01
注: A: 受菌株 SWFU01污染的马来甜龙竹组培苗; B: 在改良 NA培养基的菌落形态; C: 菌体的革兰氏染色; D: 菌体的芽孢
染色.
Note: A: Dendrocalamus aspera’s cultivation seedling polluted by the strain SWFU01; B: Colony morphologies of strain on im-
proved NA culture medium; C: Gram-stained images of strain under light microscopy (magnification, 1 000×); D: Spore morpholo-
gies of strain under light microscopy (magnification, 1 000×).


2.3 16Sr DNA序列测定及系统进化分析
将菌株SWFU01的 16S rDNA (GenBank登录
号 JQ082511.1)与从 GenBank 中获取与该菌株序
列同源性较高的部分菌株序列, 以 16S rDNA 序
列同源性为基础构建系统发育树, 确定该菌株的
系统发育地位。一般来讲, 在种分类等级上, 如
果两个分类单位间的 16S rDNA序列同源性大于
97.5%, 可视为与模式菌株同种[22−23]。系统发育
树状图(图 2)表明该菌株与解淀粉芽孢杆菌、枯
草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、死谷芽孢杆菌
(Bacillus vallismortis)聚在同一系统发育分支 ,
与解淀粉芽孢杆菌 JS 进化关系最为密切, 同源
性达到了 99.28%, 说明菌株 SWFU01 为解淀粉
芽孢杆菌。
1116 微生物学通报 2012, Vol.39, No.8

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表 2 菌株 SWFU01的部分生理生化性质
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain SWFU01
测定项目
Determination project
结果
Results
测定项目
Determination project
结果
Results
测定项目
Determination project
结果
Results
D-葡萄糖
D-dextrose
+ 山梨糖
Sorbose
−
硫化氢产生试验
The hydrogen sulfide produced
test
−
麦芽糖
Maltose
+ D-木糖
D-xylose
+ 吲哚反应试验
Indole reaction experiment
+
乳糖
Lactobiose
+ 鼠李糖
Rhamnose
− 硝酸盐还原试验
Nitrate reduction test
−
蔗糖
Cane sugar
+ L-阿拉伯糖
L-Arabia candy
− 明胶液化试验
Gelatinliquefactiontest
+
果糖
Fructose
+ 海藻糖
Trehalose
+ 淀粉水解试验
Starch hydrolysis test
+
半乳糖
Galactose
− 棉籽糖
Raffinose
+ V-P试验
The diacetyl test
+
甘露糖
Mannose
+ 有溶菌酶时生长
Lysozyme growth
+ 接触酶
Catalase
+
生长 NaCl
NaCl growth
2% +
生长温度
Growth
temperature
10 °C −
pH值
pH value
6.8营养肉汤
6.8 Nutrient
Broth
+
5% + 30 °C +
7% + 40 °C + 5.7营养肉汤
5.7 Nutrient
broth
+
10% − 50 °C −
注: +: 阳性反应; −: 阴性反应.
Note: +: Positive reaction; −: Negative reaction.


图 2 基于 16S rDNA序列的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences
注: 括号中的序号为 GenBank登录号; 分支点上的数字为自展值百分比; 线段 0.000 5为核苷酸替换率.
Note: GenBank accession numbers are shown in the parentheses. The number at each branch point is the percentage supported by
bootstrap. Bar: 0.000 5 substitutions per nucleotide position.
刘绍雄等: 一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定 1117

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综合形态学特征、生理生化特征以及 16S
rDNA 序列分析的研究结果, 菌株 SWFU01 被鉴
定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefa-
ciens)。
3 讨论
解淀粉芽孢杆菌作为植物内生菌见于红树[24]、
马尾松[25]、梨树[26]等, 但未见其在竹子中的分布,
本试验的结果表明解淀粉芽孢杆菌是马来甜龙
竹的内生菌, 为竹子内生菌的相关研究积累了资
料。目前有关植物内生细菌的来源有两种假说:
一种是认为内生细菌来源于植物的表面; 另一种
认为内生细菌来源于根际, 并由此进入植物组织
内部[27], 直接或间接促进植物生长, 协助植物抵
抗不利环境。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis)亲缘性很高的一类菌株[28],
其自身的生长过程中产生一系列有益于植物生
长的代谢产物, 这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆
菌具有抑制多种植物病原真菌的作用, 且具有促
进植物生根和地上部分生长的功能, 尹昭勇等[29]
研究表明, 解淀粉芽孢杆菌对竹子根系的生长有
一定的促进作用。表明了解淀粉芽孢杆菌作为竹
子的内生菌, 可能是竹子根系的生长过程中, 土
壤的解淀粉芽孢杆菌吸附于根际, 并由此进入
竹子根的组织内部促进其生长, 而解淀粉芽孢
杆菌在植物体内不同部位转移 [30], 内生于竹子
体内。
植物外植体培养过程中往往由于内生菌的生
长而导致污染, 对组织培养提出了严峻的考验。
然而, 由于传统的竹子育苗方法不能满足林业发
展的需求, 如何解决竹子组培污染, 提高组培育
苗的效率显得尤为重要。在组培内生菌污染防治
的相关报道中, 多采用对外植体进行预处理[31],
如: 黄化处理、热击[32]、多次消毒、灼烧等; 酸
化培养基或在培养基中加入抗生素也是常用的
方法, 特别是抗生素的使用具有较好的效果。因
此, 导致外植体污染的内生菌的分离与鉴定对抗
生素的选择起到了辅助作用, 可以根据菌株的生
理特征进行组培培养基的优化等有针对性地防
治组培中的污染菌。
本研究基于 16S rRNA基因序列对马来甜龙
竹内生细菌菌株 SWFU01进行了系统发育分析。
研究发现, SWFU01 菌株与芽孢杆菌属中的解淀
粉芽孢杆菌 JS、枯草芽孢杆菌 T429、死谷芽孢
杆菌形成相对独立的分支, 同源性均达到了 98%
以上, 并与解淀粉芽孢杆菌 JS进化关系最为密切,
同源性达到了 99.28%, 因此初步确定 SWFU01菌
株为解淀粉芽孢杆菌。由此可见, 基于 16S rRNA
基因序列分析的系统发育学研究有一定的局限
性, 在某些近缘种的鉴定中, 如芽孢杆菌属中解
淀粉芽孢杆菌近缘种, 很难精确确定它们的分类
地位。目前已有多种基因, 如 gyrA、gyrB、cheA
等[33−34], 已经用于解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆
菌的分类研究。虽然特异性基因在分布上不如
16S rRNA 基因普遍, 却可作为一些近缘种的分
类研究, 以弥补单个基因对细菌分类准确性的限
制。因此, 只有有效地将细菌经典分类学和现代
分子分类学进行结合, 将表型鉴定和分子生物学鉴
定综合分析才能得出更为可靠的结论。
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征订启事
2012 年中科院微生物所期刊联合编辑部联合征订

《微生物学通报》月刊(每月 20 日出版), 单价 58.00 元, 年价 696 元。刊号：ISSN 0253-2654; CODEN
WSWPDI。国内邮发代号：2-817; 国外邮发代号：BM413。

《微生物学报》月刊(每月 4 日出版), 单价 55.00 元, 全年定价 660 元。刊号：ISSN 0001-6209; CODEN
WSHPA8。国内邮发代号：2-504; 国外邮发代号：BM67。

《生物工程学报》月刊(每月 25日出版), 单价 65.00元, 全年定价 780元。刊号：ISSN 1000-3061; CODEN
SGXUED。国内邮发代号：82-13; 国外邮发代号：BM5608。

《菌物学报》双月刊(单月 15 日出版), 单价 80 元, 全年定价 480 元。刊号：ISSN 1672-6472; CODEN
JXUUAE。国内邮发代号：2-499; 国外邮发代号：Q723。
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