全 文 ：收稿日期:2002-10-26
修订日期:2003-03-09
作者简介:仲山民(1963-),男 , 江苏泰兴人 ,副教授 , 在读博
士生 ,从事经济林方面的教学与科研工作
常山胡柚优良无性系的 RAPD分析
仲山民1 , 胡芳名2 , 谭晓风2 , 郑勇平3 , 何照斌4 , 杜红亮4
(1.浙江林学院 , 浙江 临安　311300;　2.中南林学院 , 湖南 株洲　412006;
3.浙江省林业局 , 浙江 杭州　310006;　4.常山县林业局 , 浙江 常山　324200)
摘　要:采用改良的 CTAB 法成功提取到常山胡柚叶片 DNA ,并对常山胡柚的12个优良无性系及 7 个优株之间进行
了 RAPD分析。从初选的 Operon公司的 60个随机引物中又筛选出 12 个扩增效果较好的引物 ,共产生随机扩增位点
103 个 , 平均每个引物产生 8.6 个识别位点 ,但都没有发现多态性位点。由此表明 , 目前所选的常山胡柚优良无性系
及优株之间在分子水平上并无什么差异 ,其经济性状方面的差异可能主要受生长发育阶段 、生态环境条件及经营管
理水平等因素的影响。
关键词:常山胡柚;无性系;RAPD;分子标记
中图分类号:S 666.3　　　文献标识码:B　　　文章编号:1003-5710(2003)02-0004-03
The RAPD analysis on fine clone of Citrus changshan-huyou
ZHONG Shan-min1 , HU Fang-ming2 , TAN Xiao-feng2 ,
ZHENG Yong-ping3 , HE Zhao-bin4 , DU Hong-liang4
(1.Zhejiang Forestry University , Lin an 311300 , China;　2.Central South Forestry University ,
Zhuzhou 412006 , China;　3.Forestry Department of Zhejiang Province , Hangzhou 310006 , China;
4.Forestry Bureau of Changshan County , Changshan 324200 , China)
Abstract:Using the CTAB way to extract the DNA of Citrus changshan-huyou , and analysits the 12 fine clone types and 7 fine plants by RAPD
way , and picked up 12 better primers from 60 random primers of the Operon Company.There are 103 increase locations in those ways and aver-
age 8.6 distinguish location in each primer , and there is no diversify location in increase locations.The results showed that there is no difference
in molecular level among the fine plants , the difference in economic character was influenced by growth period , eco-environment and levels of
management.
Key words:Citrus changshan-huyou;clone;RAPD;molecular mark
　　常山胡柚(Citrus changshan-huyou Y.B.Chang , sp.nov)为
中国柑桔属植物的一新种[ 1] ,是浙江省常山县特有的柑桔地
方品种 ,国外尚无此种。其栽培历史已近百年。 由于它是一
个天然杂交种的实生后代 , 因而实生繁殖后必然出现分离 ,
造成个体间变异较大 ,特别是在果实的经济性状上表现良莠
不一 ,差异明显。为此 , 有关科技人员于 1982 年开始对常山
胡柚进行单株选优工作 ,经过几年的努力 , 于 1988年从当时
的5 629 株投产树中确定了 12 个优株 , 并由此进行无性繁
殖 ,从而产生了现在所谓的 12 个优良无性系。虽然这 12 个
优良无性系在表型上有一定的差异 ,但它们在分子水平上到
底有无差异 ,还不清楚。 为此 , 我们利用现代的分子标记技
术—RAPD[ 2 ～ 4]对其进行了分析 , 旨在找出各无性系之间的
真正差异 ,为常山胡柚的无性系品种鉴别以及进一步的选育
提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　分析材料
用于本次分析的试样有:常山胡柚优良无性系 12 个及
优株 7 个 , 共计 19个 , 各自的名称与产地见表 1。
　　分析所用的叶片材料于 2000年 11 月 26日～ 27 日采集 ,
保鲜及时带回实验室 ,置于-76 ℃的低温冰箱中保存备用。
1.2　常用胡柚叶片 DNA 的提取与纯化
常山胡柚叶片 DNA 的抽提国内外均未见报道。 根据对
其他植物叶片 DNA提取的方法 、经验[ 5] , 结合常山胡柚叶片
中含有较多芳香成份的情况 , 我们经过反复实验 , 最后确定
第 3 0 卷第 2 期
2003年 6 月
湖 南 林 业 科 技
Hunan Forestry Science & Technology Vol.30 No.2Jun.2003
表 1　常山胡柚分析样品的名称与产地
序号 代号 产　地 序号 代号 产　地
1 无性系 1 浙江常山狮子口 11 无性系 11 浙江常山狮子口
2 无性系 2 浙江常山狮子口 12 无性系 12 浙江常山狮子口
3 无性系 3 浙江常山狮子口 13 祖宗树 浙江常山澄潭
4 无性系 4 浙江常山狮子口 14 优株 3# 浙江巨县林场
5 无性系 5 浙江常山狮子口 15 优株 5# 浙江巨县林场
6 无性系 6 浙江常山狮子口 16 优株 7# 浙江巨县林场
7 无性系 7 浙江常山狮子口 17 优株 9# 浙江巨县林场
8 无性系 8 浙江常山狮子口 18 优株Z 浙江常山十五里
9 无性系 9 浙江常山狮子口 19 优株X 浙江常山十五里
10 无性系 10 浙江常山狮子口
采用改良的 CTAB法来进行 DNA 的提取 , 其大致步骤为:①
每份材料称取冷冻剪碎的叶样 5 g , 用乳钵加液氮后快速研
磨成粉 ,装于小棕色瓶内;②加入 β-巯基乙醇 250μL ,搅拌均
匀;③加入 2%的 CTAB抽提液 20 mL, 搅匀后置于 60 ℃的恒
温水浴摇床中 ,保温 30 min;④转入 50 mL离心管中 , 加入等
体积的氯仿/异戊醇液 , 轻摇 20 min 左右;⑤室温下以 4 000
rpm 的速度离心 20 ～ 30 min;⑥取上清液转入另一 50 mL的
离心管中 , 加入上清液体积 1/10 的 10%CTAB 液 , 稍摇匀后
再加入 20 mL氯仿/异戊醇液 ,轻摇 20 min;⑦室温下以 4 000
rpm 的速度离心 20 min;⑧重复⑥、⑦步骤 1 ～ 2 次;⑨取上
清液转入另一 50 mL 的离心管中 , 然后沿管壁慢慢加入
-24 ℃预冷冻的异丙醇 , 加入量约为上清液体积的 2/3 , 再
轻轻摇晃至絮状物出现;⑩室温下以 4 000 rpm 的速度离心
15 min; 1倾去上层的离心液 ,倒置离心管干燥DNA; 12每管
加入浓度为 1 mol·L-1的 NaCl溶液 5 mL和 RNaseA 5μL ,置于
56 ℃的恒温水浴上保持 12 h以上; 13取出离心管冷却 ,然后
沿管壁缓慢加入 2 倍体积 99.5%的预冷乙醇 , 以沉淀 DNA;
14用玻棒小心钩出 DNA , 置于 76%的乙醇中洗 30 min; 15转
入99.5%的乙醇中漂洗 10 min; 16将 DNA 气干后加入 1.5
mL的 TE 液中 ,待溶解后备用或于冰箱中 4 ℃保存。
1.3　DNA浓度与纯度的测定
本实验采用美国 BECKMAN 公司生产的 DU — 640 核酸
蛋白分析仪来测定所提 DNA 的浓度和纯度。
1.4　RAPD扩增反应体系及其产物鉴定
1.4.1　反应体系　RAPD 扩增是在德国 eppendorf公司生产
的PCR—G600 仪器上进行的。反应采用15μL体系:DNAtem-
plate , 2 μL(10 ng);10×Buffer, 1.5μL;2 mmol·L-1dNTPs , 1.8
μL;25 mmol·L-1MgC12 , 1.44μL;10μmol·L-1Primer , 1.26 μL;5
UTaq 聚合酶 , 0.2μL;DDH2O , 6.8μL。各反应管中最后加 10
～ 20μL的矿物油 , 以防止挥发。
1.4.2　扩增程序(条件)　常山胡柚 RAPD扩增条件为:95 ℃
预变性 3 min;94 ℃变性30 s , 36 ℃退火 30 s , 72 ℃延伸 1 min ,
共反应 35个循环;72 ℃延伸 5 min后转入4 ℃保存。
1.4.3　RAPD扩增产物鉴定　扩增产物用 1.4%的琼脂糖凝
胶在 0.5×TBE 电泳缓冲液中电泳分离 , 然后经 EB(溴化乙
锭)稀释液染色 ,再用伯奥公司生产的凝胶自动成像仪在紫
外光下进行观察并照相记录结果。
1.5　数据处理
RAPD扩增带的有无分别用“ 1”和“0”表示(强带和弱带
均记录),建立数据文件 ,然后进行统计分析。
2　结果与分析
2.1　常山胡柚叶片 DNA 的抽提效果
本次分析采用改良的 CTAB 法 , 不仅成功提取到常山胡
柚叶片 DNA ,而且经测定所得 DNA 的浓度高 , 纯度好 , 19 个
试样的DNA浓度均在 100μg·mL-1以上 ,有的甚至高达近 700
μg·mL-1 ,其平均值为 276.90μg·mL-1 , 换言之 , 每克常山胡
柚鲜叶片平均可获 DNA 83μg;所得 DNA 的纯度基本上处在
1.4～ 1.8 的范围内 , 平均为 1.56 , 符合 RAPD反应对 DNA纯
度的要求。
2.2　RAPD随机引物的筛选
本实验所用的随机扩增引物 , 购自美国 OPERON 公司 ,
包括 AA-AZ系列 , 共 520种。我们根据大量文献资料报道以
及其他研究人员的分析经验 ,从中确定了 60 个引物 , 首先在
柑桔属的常山胡柚 、 柑 、柚子 、衢桔 、甜橙 、脐橙 、温州蜜桔
等 7 个种之间进行引物筛选 , 从中再根据谱带识别位点的多
少 、谱带分离的清晰程度及多态性的多少 , 确定了 12 个随机
引物(具体种类及其碱基序列如表 2 所示), 用于常山胡柚各
无性系及优株之间的 RAPD分析。
表 2　常山胡柚 RAPD标记的引物名称及其碱基序列
序号 引物名称 引物碱基序列 序号 引物名称 引物碱基序列
1 AC06 CCAGAACGGA 7 AG13 GGCTTGGCGA
2 AC19 AGTCCGCCTG 8 AG15 CCCACACGCA
3 AD12 AAGAGGGCGT 9 AJ14 ACCGATGCTG
4 AE04 CCAGCACTTC 10 AK19 TCGCAGCGAG
5 AE10 CTGAAGCGCA 11 AI02 AGCCGTTCAG
6 AE15 TGCCTGGACC 12 AO18 GGGAGCGCTT
2.3　常山胡柚 RAPD 扩增结果
实验中所选用的12 个随机引物对常山胡柚 19个样品的
DNA均能扩增出较为清晰的谱带 , 所得到的 DNA 片段长度
基本处于 200～ 2 300 bp 之间。 12 个引物共得到随机扩增位
点 103 个 ,平均每个引物产生8.6 个识别位点 ,说明所用的引
物与模板 DNA 的同源性较好 , 而且所采用的 PCR反应体系
和条件都比较适合。但是 , 在常山胡柚 RAPD扩增结果(见
图 1 、图 2)中均没有发现多态性位点。
图 1　常山胡柚优良无性系和优株的 RAPD图谱
(1～ 19的名称见表 1所示 ,引物为 AC19)
·5·第 2期 仲山民 ,等:常山胡柚优良无性系的 RAPD分析
图 2　常山胡柚优良无性系和优株的 RAPD图谱
(1～ 19的名称见表 1所示 ,引物为 AJ14)
　　由此表明 , 目前所选的 12 个常山胡柚优良无性系及 7
个不同优株之间在分子水平上并无什么差异 ,它们在表型上
及某些经济性状方面所表现出来的差异 , 可能是由于其生长
发育阶段 、生态环境条件及抚育管理措施等方面的不同所带
来的。同时也说明常山胡柚这一柑桔属的新种 , 其本身的遗
传因子相对稳定 ,变异不大 , 这一点还可以从不同地方的 、不
同优株之间没有 RAPD多态性这一结果得到证实。
3　小结与讨论
(1)常山胡柚叶片 DNA 的提取国内外均无报道。本次
分析经反复试验 ,最后采用改良的 CTAB 法 , 不仅成功地提取
到常山胡柚叶片 DNA , 而且所得 DNA 的浓度高 , 纯度好 , 完
全符合 RAPD分析之要求 , 也能基本满足其它分子生物学分
析的要求。
(2)经无数次摸索后确定并在本次实验中采用的 PCR
扩增反应体系和循环条件完全适合于常山胡柚的 RAPD分
析 ,所得的 DNA扩增谱带清晰稳定 , 可靠性强。实验中筛选
出的12 个引物共得到随机扩增位点 103 个 ,平均每个引物产
生 8.6 个识别位点 ,但其中均未发现多态性位点。
(3)从本次实验的 RAPD分析结果来看 , 目前所选的 12
个常山胡柚优良无性系及其它 7 个优株之间在分子水平上
并无明显差异 ,产生这一结果的原因可能有:a)与常山胡柚
本身的遗传因子有关。 由于常山胡柚这一新种的栽培历史
较短 、栽培范围也较集中 , 因而其本身的遗传因子相对稳定 ,
造成遗传变异不大;b)与常山胡柚的选优标准有关。因为
常山胡柚各优良无性系 、各优株的产生都是按照相对一致
的 、一定的选优标准来进行的 , 因此 , 所选的 12 个优良无性
系和 7 个优株在基因型上就可能比较一致或接近 , 造成差异
不明显;c)与分子标记技术有关。 因为本次分析所采用的
RAPD标记是一种显性标记 , 它难以区分显性纯合体与显性
杂合体。假如常山胡柚各无性系 、各优株之间的差异存在于
隐性基因上 , 则 RAPD 标记也无法显现 , 因此还得更换分析
方法 、改用其它分子标记技术;d)与随机引物的数量有关。
限于条件 , 本实验首先选用了 60 个引物在种间进行筛选 , 然
后从中确定了 12个引物用于常山胡柚各试样的分析。虽然
都没有发现多态性 ,并由此产生了本次实验条件下的基本结
论:目前所选的 12 个优良无性系及其它 7 个优株之间的分
子水平上并无差异 ,表明常山胡柚这一物种本身的遗传变异
较小 ,其经济性状的差异主要受生长发育阶段 、生态环境条
件及经营管理水平等因素的影响。然而 , 常山胡柚各无性系
之间 、不同产地之间是否在分子水平上真的没有差异 , 还不
能由此定论。通过增加引物的种类 ,或改用其它分子标记技
术 , 能否找出常山胡柚各无性系 、各优株 、各产地之间的差
异 , 还有待于进一步的试验 、探索。
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