全 文 ：植物生理与生物技术
裂叶马兰无性系建立的研究
刘宏森，王 婧，盖英男，宁淑香，姜长阳
(辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081)
摘 要：为保护野生资源、满足栽培对种苗的需求，以裂叶马兰的嫩茎为外植体，进行愈伤组织诱导与分化、不定芽生根、试管
苗生根继代增殖的研究，以及试管苗移栽和定植的研究，建立起裂叶马兰的无性系。结果表明：MS+蔗糖 35 g·L-1 +6-BA0.5
mg·L-1+2,4-D2.5 mg·L-1是嫩茎愈伤组织诱导培养和继代增殖培养的适宜培养基；MS+蔗糖 30 g·L-1+ AgN031.0 mg·L-1+GA31.0
mg·L-1 +ZT1.6 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1是愈伤组织分化培养的适宜培养基；1/2MS+蔗糖 20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1是不定芽生
根培养和试管苗生根继代增殖培养的适宜培养基；试管苗移栽成活率为 95.9%；定植成活率 98.0%。定植成活的试管苗保持了
野生裂叶马兰的所有植物学性状。
关键词：裂叶马兰；嫩茎；无性系
中图分类号：S334.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.10.003
Study on the Clone Construction of Kalimeris indica(L.)Sch.-Bip
LIU Hong-sen, WANG Jing, GAI Ying-nan, NING Shu-xiang, JIANG Chang-yang
(College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116081, China)
Abstract: In order to preserve the wild resources and meet the cultivated needs of people, with the method of tissue culture, the
tender stems of Kalimeris indica (L.)Sch.-Bip were used as materials to do the research on callus inducement and differentiation,
rooting of adventitious buds, rooting multiplication of tube seedlings, transplantation of tube seedlings and stable planting. The results
demonstrated that MS+ sucrose 35 g·L-1 +6-BA0.5 mg·L-1+2,4-D2.5 mg·L-1 was the ideal medium for callus inducement and callus
multiplication; MS+ sucrose 30 g·L-1+ AgN031.0 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1 +ZT1.6 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1 was the optimum medium
for callus differentiation cultivation; The ideal medium for rooting of adventitious buds and rooting multiplication of tube seedlings was
1/2MS+sucrose 20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1. The transplanting survival rate of tube seedlings was 95.9%. The planting survival rate
of tube seedlings was 98.0%.The tube seedlings stable planted maintained all botany characteristics of the wild Kalimeris indica (L.)
Sch.-Bip.
Key words: Kalimeris indica(L.)Sch.-Bip; tender stems ; clone
2013，19（10）：10-14天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences
收稿日期：2013-08-20；修订日期：2013-09-01
基金项目：辽宁省大学生创新创业训练项目 （20131016520）；辽宁省普通高等教育本科教学改革研究项目 （201203041-4）
作者简介：刘宏森（1991—），男，辽宁开原人，在读本科生，主要从事植物组织培养研究 。
通讯作者简介：姜长阳（1953—）男，辽宁大连人，教授，主要从事植物生物技术研究 。
裂叶马兰 (Kalimeris indica (L.)Sch.-Bip.）为菊
科马兰属多年生草本植物 [1-2]。生长于河岸、林内
草地及山坡草地 [3]。全草药用，具有凉血清热、利
湿解毒等功效，能治出血、疟疾、黄疸、水肿淋浊、
咳嗽、咽疼喉痹、乳痈痔疮、丹毒和蛇咬伤等疾病[4]。
近十多年来，辽宁南部地区的养殖专业户，将裂叶
马兰的干粉作为畜禽的饲料添加剂，能较明显地
减少疾病发生，提高效益。正是由于裂叶马兰能防
治多种人畜疾病，进入 21 世纪以来，辽宁南部地
区的人们一直在大量的采收裂叶马兰作为中草药
和家畜饲料添加剂，致使裂叶马兰的野生资源迅
速减少。为保护野生资源，进行栽培，研究者对裂
叶马兰进行了无性系建立的研究。此前已有马兰
属植物组织培养研究的报道 [5-6]，并且还有裂叶马
兰芽分化培养研究的报告 [7-8]，但迄今未见裂叶马
兰愈伤组织无性系建立研究的报道。本研究的目
的在于采用组织培养技术探索出裂叶马兰愈伤组
织无性系建立的有效途径，从而为其保护和利用
第 10期
奠定技术基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
6 月上旬，把大连郊区柳树村山坡上生长旺
盛裂叶马兰的地上部采回实验室，并冲洗干净。将
叶柄、叶片剪掉，将嫩茎切成多个 5 cm 左右茎段
后，放到磨口广口瓶中，用自来水洗涤振荡，再用
0.05％安利洗涤液洗涤约 10 min，用蒸馏水将材
料上的安利洗涤液泡沫冲洗干净。在经过杀菌消
毒处理的超净工作台上将材料用 70％~75％乙醇
灭菌 10 s 左右，立即用无菌水振荡洗涤 3 次，然
后加入 0.05%HgCl2 溶液，浸泡灭菌 14 min，并迅
速用无菌水洗涤 6 次 [9]，即可获得裂叶马兰的无
菌材料。将无菌材料转移到底部覆有 2 层滤纸并
经过无菌处理的培养皿中，准备剪切嫩茎接种 [10]。
固体培养基中琼脂含量为 5.0 g·L-1，pH 值 5.8～
6.0，每日持续光照 12 h，光照强度为 2 500 lx，恒温
25℃培养。
1.2 方 法
1.2.1 不同浓度细胞分裂素与 NAA、2,4-D 对嫩
茎段愈伤组织诱导培养的影响 以 MS+ 蔗糖 35
g·L-1为基本培养基，在添加不同浓度细胞分裂素
与 NAA、2,4-D 的培养基上接种培养长 0.3 cm 左
右的无生长点嫩茎段，进行愈伤组织的诱导培养。
愈伤组织诱导培养在恒温光照的培养箱中进行。
重复 3次，每种处理培养 50个材料。
1.2.2 不同浓度 6-BA、ZT 和 KT 与不同浓度的
NAA、IBA 对愈伤组织分化培养的影响 将在
MS+ 蔗糖 35 g·L -1 +6-BA0.5 mg·L -1+2,4-D2.5
mg·L-1培养基上继代增殖培养 58 d 的愈伤组织，
用枪状镊子在培养瓶内将其分散为 0.3 cm 左右
的颗粒状后，接种在以 MS +蔗糖 30 g·L -1 +
AgN031.0 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1 为基本培养基，
再添加不同浓度 6-BA、ZT 和 KT 与不同浓度的
NAA、IBA 的培养基上，进行愈伤组织分化培养试
验。愈伤组织分化培养试验重复 2 次，每种处理培
养 50个材料。其培养条件与愈伤组织诱导培养的
条件相同。
1.2.3 不同培养基对裂叶马兰不定芽生根培养
的影响 配制 8 种不定芽生根培养基，即 1/2MS+
蔗糖 20 g·L -1+IAA 0.3 mg·L -1、1/2MS +蔗糖 20
g·L -1 + IBA 0.3 mg·L -1、1/2MS+蔗糖 20 g·L -1 +
NAA 0.3 mg·L -1、1/2MS+蔗糖 20 g·L -1 +2,4 - D
0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖 20 g·L-1+IAA 0.6 mg·L-1、
1/2MS+蔗糖 20 g·L-1 + IBA 0.6 mg·L-1、1/2MS+蔗
糖 20 g·L -1 + NAA 0.6 mg·L -1、1/2MS +蔗糖 20
g·L-1 +2,4-D 0.6mg·L-1，将培养基进行灭菌后，把
继代分化增殖培养的不定芽从基部剪下，接种到
以上 8种生根培养基上进行不定芽的生根培养试
验。接种时不定芽形态学下部应插入培养基约
0.7 cm，置于恒温光照的培养箱中进行生根培养。
重复 2 次，每种培养基接种培养 100个材料。
1.2.4 试管苗生根继代增殖培养 把在 1/2MS+
蔗糖 20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1这种培养基上生
根培养 33 d 的试管苗，用手术剪子在瓶内剪成至
少具有 2 个叶片（实际上也至少具有 2 个生长
点）、长 1.5 cm 左右的茎段后，继续接种到 1/2
MS+蔗糖 20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1 这种培养基
上进行试管苗的生根继代增殖培养。这一试验只
进行了 1次，连续继代增殖培养了 5代。第一代接
种培养了 90个材料，之后每一代接种增殖培养的
材料数目扩大 1倍。
1.2.5 试管苗的移栽与定植 将第 5 代生根继
代增殖培养的试管苗培养瓶瓶塞除掉，置于日光
温室中炼苗 3 d。之后，将 700株试管苗移栽到上
半层为河沙、下半层为园土的温室营养钵中。
把在温室营养钵中移栽成活的试管苗，于
5 月中旬定植到水库旁的山坡草地上，共定植
400 株。
2 结果与分析
2.1 不同浓度细胞分裂素与 NAA、2,4-D 对嫩茎
段愈伤组织诱导培养的影响
培养到 66 d 时进行诱导影响统计观察，结果
由表 1可见，在不同浓度细胞分裂素与不同浓度
的 NAA、2,4-D 的培养基上，均可不同程度地诱导
培养出愈伤组织，但其效果差异较大。从诱导率、
愈伤组织的生长速度和愈伤组织的长势 3 个方面
综合看，6-BA 与 2,4-D 配合使用的效果较理想。
其中在 0.5 mg·L-1的 6-BA 与 2.5 mg·L-1的 2,4-
D配合使用时，不仅愈伤组织的诱导率最高、愈伤
组织的生长速度最快，而且诱导培养的愈伤组织
长势最好。对培养过程的观察还表明，在 0.5
刘宏森等：裂叶马兰无性系建立的研究 ·11·
第 19卷天津农业科学
表 1 不同浓度细胞分裂素与 NAA、2,4-D 对嫩茎段愈伤组织诱导培养的影响
mg·L-1 的 6-BA 与 2.5 mg·L-12,4-D 的配合使用
的培养基上，培养 7 d 可见有的培养茎段切口在
与培养基的接触部位开始生长出淡绿色的愈伤组
织。随着培养时间的增加，诱导率迅速增加，愈伤
组织也不断生长，并且颜色也变为嫩绿色。与此同
时，所生长的愈伤组织外面也逐渐生长出大小不
等的颗粒。以上结果说明，在 0.5 mg·L-16-BA 与
2.5 mg·L-12,4-D 配合使用时是嫩茎段愈伤组织
诱导培养的理想的生长调节剂组合。重复的 3 次
试验结果基本一致。把在这种生长调节剂组合的
培养基上诱导培养的愈伤组织，分散成为直径约
0.3 cm的块状后，接种到相同的培养基上进行愈
伤组织的继代增殖培养，结果证明：经过 58 d 的
培养，就又会培养生长出 1代与以嫩茎段位材料
进行了 65 d培养的长势一致的愈伤组织。上述结
果说明，MS+ 蔗糖 35 g·L -1 +6-BA0.5 mg·L -1+
2,4-D2.5 mg·L-1 这种培养基是裂叶马兰嫩茎愈
伤组织诱导培养和继代增殖的适宜培养基。
2.2 不同浓度 6 -BA、ZT 和 KT 与不同浓度的
NAA、IBA 对愈伤组织分化培养的影响
培养到 60 d 时进行统计观察，结果如表 2 所
示。在愈伤组织的分化培养试验中，在加入细胞分
裂素 KT 的培养基上，愈伤组织不分化；在加入生
长素 IBA 的培养基上，愈伤组织也不分化；其效
果较理想的是不同浓度 ZT 与 NAA 的培养基上，
其中最好的是在 ZT0.8 mg·L-1 与 NAA0.1 mg·L-1
配合使用的培养基上，不仅培养的愈伤组织分化
率最高，达到了 96%，并且每块培养的愈伤组织
分化不定芽数为 5.3 个，同时分化的不定芽呈丛
生状，高度为 1.3~2.1 cm，外观上生长旺盛。对分
化培养的过程观察还说明，在分化的初始时间、不
定芽的叶数、叶色和茎粗等较理想效果，均是出现
在 ZT1.6 mg·L-1与 NAA0.1 mg·L-1配合使用的培
养基上。2次重复试验的结果也几近一致。以上结
果证明：ZT1.6 mg·L-1与 NAA0.1 mg·L-1配合使用
是愈伤组织分化培养适宜生长调节剂组合，也就
是说，MS +蔗糖 30 g·L -1 + AgN031.0 mg·L -1 +
GA31.0 mg·L-1 +ZT1.6 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1 这
种培养基是裂叶马兰嫩茎愈伤组织分化培养的适
宜培养基。把分化的不定芽从基部切下后，再接种
到 MS+蔗糖 30 g·L -1+ AgN031.0 mg·L -1+GA31.0
mg·L-1 +ZT1.6 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1 这种培养
基上，进行不定芽的继代分化增殖培养。重复 2次
试验，每次继代 3 代的结果证明：经过 56 d 的继
注：+++代表长势好；++代表长势较好；+代表长势一般。 以下同。
细胞分裂素及浓度/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1) 2,4-D/(mg·L-1) 诱导率/% 愈伤组织块直径/cm 长势
ZT 0.5 1.5 0 36 0.3 +
ZT 1.0 1.5 0 28 0.3 +
ZT 1.5 1.5 0 20 0.2 +
ZT 0.5 0 1.5 78 0.9 ++
ZT 1.0 0 1.5 56 0.7 ++
ZT 1.5 0 1.5 26 0.3 +
KT 0.5 2.0 0 12 0.2 +
KT 1.0 2.0 0 8 0.1 +
KT 1.5 2.0 0 8 0.1 +
KT 0.5 0 2 28 0.4 +
KT 1.0 0 2 14 0.2 +
KT 1.5 0 2 12 0.2 +
6-BA 0.5 2.5 0 76 1.9 +
6-BA 1.0 2.5 0 64 1.6 +
6-BA 1.5 2.5 0 54 1.6 ++
6-BA 0.5 0 2.5 92 2.1 +++
6-BA 1.0 0 2.5 76 1.8 ++
6-BA 1.5 0 2.5 68 1.1 +
·12·
第 10期
表 2 不同浓度 6-BA、ZT 和 KT 与不同浓度的 NAA、IBA 对愈伤组织分化培养的影响
代分化增殖培养，就会培养出 1 代平均分化率为
100%、平均每代增殖系数为 5.6、分化不定芽长势
旺盛的丛生不定芽。MS+蔗糖 30 g·L-1+ AgN031.0
mg·L -1 +GA31.0 mg·L -1 +ZT1.6 mg·L -1 +NAA0.1
mg·L-1这种培养基还是裂叶马兰不定芽继代分化
增殖培养的理想培养基。
2.3 不同培养基对裂叶马兰不定芽生根培养的
影响
接种后每 11 d 观察统计记录一次生根情况，
生根培养 33 d 时观察统计结果证明：1/2MS+蔗糖
细胞分裂素及浓度/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1) IBA/(mg·L-1) 分化率/% 每块愈伤组织分化的不定芽个数 不定芽长势
6-BA 0.8 0.1 0 54 3.1 ++
6-BA 1.6 0.3 0 30 2.6 +
6-BA 2.4 0.5 0 16 1.5 +
6-BA 0.8 0 0.1 0 0 -
6-BA 1.6 0 0.3 0 0 -
6-BA 2.4 0 0.5 0 0 -
ZT 0.8 0.1 0 96 5.3 ++
ZT 1.6 0.3 0 56 2.2 +
ZT 2.4 0.5 0 12 1.4 +
ZT 0.8 0 0.1 0 0 -
ZT 1.6 0 0.3 0 0 -
ZT 2.4 0 0.5 0 0 -
KT 0.8 0.1 0 0 0 -
KT 1.6 0.3 0 0 0 -
KT 2.4 0.5 0 0 0 -
KT 0.8 0 0.1 0 0 -
KT 1.6 0 0.3 0 0 -
KT 2.4 0 0.5 0 0 -
20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1 是裂叶马兰不定芽生
根培养的理想培养基。在这种培养基上，经过 33 d
的培养，就会培养出 1 代生根率 99%、试管苗平
均高度 5.2 cm、具有 8.3 个叶片、茎粗 0.21 cm、外
观上生长旺盛的试管苗。观察还表明，在这种培养
基上培养至第 5 d 时可见有的培养材料开始生
根。之后，生根率、根长、根数都不断增加。初期生
长的根为白色，后期为绿色。
2.4 试管苗生根继代增殖培养
连续 5 代生根继代增殖培养的统计观察结果
证明：每一代的繁殖周期为 31 d、繁殖系数为
3.2、生根率为 99.2%，并且外观上试管苗根系均
为绿色、生长非常旺盛。按照 31 d 的繁殖系数为
3.2 的繁殖速度计算，1 株试管苗 1 年至少能保证
繁殖出 50万株试管苗。这种繁殖速度完全能满足
保护野生资源和栽培对裂叶马兰种苗的需求。这
也说明：1/2MS+蔗糖 20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1
也是裂叶马兰试管苗生根继代增殖培养的适宜培
养基。
2.5 试管苗的移栽与定植
移栽后 36 d 统计证明：移栽成活 671 株，成
活率为 95.9%。
定植后 42 d 统计显示：定植成活 392 株，成
活率 98.0%。定植成活的试管苗当年 9月开花、10
月结果，保持了野生裂叶马兰的所有植物学性状。
3 讨 论
在本研究中无生长点嫩茎段诱导培养的愈伤
组织和继代增殖培养的愈伤组织，是在相同的条
件下进行的。但是，后者经过 58 d 为一个培养周
期培养的愈伤组织与前者经过 65 d 为一个培养
周期培养的愈伤组织相同，后者的培养周期缩短
7 d。之所以会产生着这种现象是由于以下原因引
刘宏森等：裂叶马兰无性系建立的研究 ·13·
第 19卷天津农业科学
起的：一是前者使用的材料是无菌茎段，在剪切和
灭菌中受到了损伤，接种到培养基上需要一段恢
复时间；二是前者原来是在野外的土壤上生长的，
将其转移到培养基上进行人工培养需要有一个适
应性过程，而后者是在相同的条件下和相同的培
养基上生长的，不需要这个适应过程。
在本研究中的不定芽生根培养的试管苗和生
根继代增殖培养的试管苗，均可生长出绿色的根
系。在培养基中形成绿色的根系说明，试管苗根系
也能进行光合作用，对培养环境具有很强的适应
性。在前人的研究中，有时会出现试管苗根系发黑
的现象 [11-12]，这往往是由于培养基中缺氧，根系产
生无氧呼吸造成的。而试管苗形成的绿色根系，在
进行光合作用时必然产生氧气，有利于试管苗根
系代谢活动获得所需要的氧气，从而促进试管苗
的旺盛生长。
参考文献：
[1] 中国科学院北京植物研究所.中国高等植物图鉴（第四
册）[M].北京:科学出版社,1975:419.
[2] 李书心 .辽宁植物志（下册）[M].沈阳 :辽宁科学技术出
版社,1991:4501.
[3] 韩全忠 ,王正兴 .大连地区植物志 (下册 ) [M].大连 :大连
理工大学出版社,1993:730-731.
[4] 南京中医药大学编著.中药大辞典(下册)[M].上海:上海
科学技术出版社,2006:384-385.
[5] 李岩,吴延君.野生山马兰组织培养和快速繁殖[J].植物
生理学通讯，2002,39(6):580.
[6] 石丽敏 ,陈劲松 ,杨寅桂 ,等 .野生蔬菜马兰的离体培养
与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2007,43(1):113.
[7] 文国琴,何道文.马兰组织培养与植株再生[J].亚热带植
物科学，2005,34(4):64.
[8] 徐秀芳,张海洋.野生马兰的组培快繁技术研究[J].长江
蔬菜，2008(5):36-37.
[9] 曾建军 ,欧阳群 ,李晓红 ,等 .车前不定芽直接诱导及再
生体系的建立[J].安徽农业科学,2008,36(5):1810-1811.
[10] 李小平 ,朱培林 ,曾志斌 ,等 .车前栽培技术及相关研究
进展[J].江西林业科技，2006(4):44-48.
[11] 安利佳,姜长阳.植物组织培养导论[M].大连:辽宁师范
大学出版社,1996:105-117.
[12] 李慧.皱叶酸模高效再生体系的建立及愈伤组织大黄
素含量的分析[D].沈阳：辽宁师范大学，2013.
·14·