全 文 ：张　娟 ,曹伟杰 ,陈崇顺 ,等.农杆菌介导洋桔梗遗传转化影响因素的研究 [ J].江苏农业科学 , 2010(2):23-25.
农杆菌介导洋桔梗遗传转化影响因素的研究
张　娟 , 曹伟杰 , 陈崇顺 , 马文晔 , 王转梅 , 岳　敏
(南京师范大学生命科学学院 /江苏省生物多样性与生物技术重点实验室 ,江苏南京 210046)
　　摘要:以洋桔梗品种 DoubleMariachiPink叶片为外植体 ,研究了影响农杆菌介导遗传转化效率的几个重要因素。
结果表明 , 叶片外植体与农杆菌合适的共培养时间为 5 d;以新的切割方法——— “刺孔法”切割叶片 , 每个叶块外植体
再生不定芽平均 15.22个 ,明显多于 “三刀切”的 11个;“刺孔法”的叶块转化率达到 77.7%, 每个叶块再生卡那霉素
抗性苗平均 0.64株 , 明显高于 “三刀切”的 57.7%和 0.38株;在 “刺孔法”处理中 ,与孔外边缘切口相比 , 分布均匀的
孔内切口利于更多不定芽的再生和卡那霉素抗性苗的形成。
　　关键词:洋桔梗;农杆菌介导法;遗传转化;共培养;刺孔法
　　中图分类号:Q948.12 +2.3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)02-0023-03
收稿日期:2009-08-05
作者简介:张　娟(1983—),女 , 山东济南人 ,硕士研究生 ,主要从事
植物生物技术与分子生物学研究。 E-mail:zhangjuansuccess@
163.com。
通信作者:陈崇顺 ,博士 ,硕士生导师。 E-mail:chenchongsun@njnu.
edu.cn。
　　洋桔梗 (Eustomagrandiflorum)别名草原龙胆 ,是龙胆科
龙胆属 1、2年生草本观赏植物 ,原产于美国中部内布拉斯加
州至德克萨斯州一带 。洋桔梗花姿优美 , 花色丰富 ,花形别
致 ,具有较高的观赏价值和经济价值 ,现已跻身世界十大切花
之列 [ 1] 。随着分子生物学的发展 ,植物基因工程及 T-DNA
标签法在植物新种质的创制方面显示了比传统育种方法更高
的效率 ,它主要以农杆菌介导 T-DNA转移为遗传转化体系 ,
已在多种植物上获得了成功 [ 2 -3 ] 。目前有关利用农杆菌介导
法转化洋桔梗的研究所涉及的目的基因有 TSWV基因 [ 4] 、LFY
类基因 [ 5] 、NPR1基因 [6 ] 、PSY基因 [ 7] 、CHS基因 [ 8 ] 、BEAT基
因 [ 9]等 ,所涉及的品种有 YodelBlue、LisaBlue、DeepBlue、
Wakamurasaki、RoyalPink。
本研究主要通过农杆菌介导 T-DNA转化叶片外植体 ,
对影响洋桔梗品种 DoubleMariachiPink遗传转化效率的几
个重要因素进行研究 ,旨在建立农杆菌介导 DoubleMariachi
Pink洋桔梗的高效遗传转化体系 。
1　材料与方法
1.1　材料
植物试材为 DoubleMariachiPink洋桔梗 F1代种子(日
本 SAKATA公司生产 ,昆明缤纷园艺有限公司经销)经过萌
发 [ 1]及约 2个月离体增殖培养所获得试管苗的叶片。
试验所用农杆菌菌株为 LBA4404 ,质粒为 pBI121。该质
粒 T-DNA含 CaMV的 35S启动子 、卡那霉素抗性基因(新霉
素磷酸转移酶基因 nptⅡ)和 gus(β -葡糖醛酸酶)基因等 。
1.2　方法
1.2.1　不同切割方法对叶片外植体再生不定芽的影响 　按
图 1的 2种不同方法分别对叶片进行切割 , “三刀切 ” [10] (图
1-A)是将叶片切成 1对 (2个 )叶块(每块大约 5 mm×
10mm);“刺孔法 ”(图 1-B)是在 “三刀切 ”的基础上 ,用直
径大约 1mm的针从叶片背面均匀刺孔 ,每对叶块 16孔 。将
切好的叶块背面向下接种于不定芽再生培养基(MS+6 -BA
1.0 mg/L)[ 10 ]上 ,每种切割方法接种 25对(50个)叶块 , 30 d
后统计再生不定芽数 ,计算再生不定芽平均数 (叶片外植体
叶块上不定芽总个数 /叶片外植体叶块数)。培养条件:温度
(25±2)℃,光强 60μmol/(m2 · s),光 -暗周期 16h-8h。
1.2.2　农杆菌的活化和培养　将保存于 -20℃的农杆菌接
种涂布于含有抗生素的 LB培养基 (胰化蛋白胨 10 g/L+酵
母提取物 5 g/L+NaCl10 g/L+卡那霉素 50 mg/L+利福平
50mg/L, pH值 7.0)平板上 ,于 28℃暗培养 1 ～ 2d至长出单
菌落 。挑取单菌落 ,接种于添加卡那霉素(100 mg/L)和利福
平(50 mg/L)的 LB液体培养基中 ,于 28 ℃振荡培养至对数
生长期 , 4℃离心收集菌体 ,并用新鲜的 1 /2 MS液体培养基
将其重悬成菌液(D600 nm≈0.5),转入无菌容器中备用 。
1.2.3　洋桔梗叶块的预培养 、共培养及遗传转化　采用叶盘
转化法 [ 11 -12] 。取洋桔梗无菌苗叶片 ,分别采用 “三刀切 ”和
“刺孔法 ”将其切成叶块 ,将叶块背面向下接种于不定芽再生
培养基上 ,于(25±2)℃预培养 3 d,然后将叶块浸入上述制
备好的农杆菌菌液中 。 10 min之后 ,用无菌滤纸吸干多余菌
液 ,将叶块转接于不定芽再生培养基上 ,于(25±2)℃及黑暗
条件下 “共培养 ”2 ～ 6 d。用无菌水冲洗 3次 ,将叶块转接于
筛选脱菌及不定芽再生培养基(MS+6-BA1.0 mg/L+卡那
霉素 30mg/L+羧苄青霉素 200mg/L)上 ,于(25±2)℃进行
筛选培养 。 2周后 ,可见绿芽再生 。筛选培养 30d后 ,统计卡
那霉素抗性不定芽再生数 ,计算转化率(再生卡那霉素抗性
不定芽的叶块数 /接种的总叶块数 ×100%);再将绿芽切下 ,
转接于筛选脱菌及不定芽增殖培养基(MS+6-BA0.1 mg/L
+NAA 0.05 mg/L+卡那霉素 30 mg/L+羧苄青霉素
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DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.02.124
100 mg/L)上筛选培养 。每隔 30 d,重新转接于新的筛选脱
菌及不定芽增殖培养基上筛选培养 ,如此筛选培养转接 2次 ,
即筛选培养总共 90d后 ,统计卡那霉素抗性苗株数 ,计算卡
那霉素抗性苗平均数(再生卡那霉素抗性苗株数 /接种的总
叶块数)。
1.2.4　gus基因表达的组织化学检测　按王关林等 [ 11]的方
法进行 。将经过 “共培养 ”的叶块转接于不定芽再生培养基
上进行培养 , 3d后进行 gus基因瞬时表达检测。
1.2.5　试验数据的统计分析　用 SPSS13.0统计软件对相关
数据进行 χ2检验或方差分析 。
2　结果与分析
2.1　不同切割方法对叶片外植体再生不定芽的影响
接种 10 d后 ,大多外植体上都有黄绿色愈伤组织长出 ,
在与叶片主脉垂直的切口处和刺孔处可见明显的愈伤组织 。
接种 15 d后 ,所有外植体上都显现芽点 ,在 “刺孔法 ”处理中 ,
孔内不定芽的出现早于孔外不定芽 。接种 30 d后 ,每个叶块
均有不定芽再生(图 2)。
　　由表 1可知 , “刺孔法 ”中每个叶块再生不定芽数比 “三
刀切 ”中每个叶块再生不定芽数平均多 4.22个 ,即 “刺孔法 ”
处理显著优于 “三刀切”处理 。
由表 2可知 , “刺孔法 ”处理叶块 ,孔内再生的不定芽数
表 1　不同切割方法对叶块外植体再生不定芽的影响
切割方法 再生不定芽平均数(个 /块)
刺孔法 15.22a
三刀切 11.00b
表 2　“刺孔法 ”处理叶块不同切口部位对再生不定芽的影响
叶块切口部位 再生不定芽平均数(个 /块)
孔内 8.54a
边缘 6.68b
比叶块边缘切口处再生的不定芽数平均多 1.86个 ,两者间存
在显著性差异 。这表明 ,孔内切口更利于不定芽的再生 。
2.2　不同共培养时间对农杆菌介导转化率的影响
由表 3可知 ,在相同菌液浓度和侵染时间的条件下 ,共培
养 5 ～ 6d的洋桔梗叶块转化率显著高于共培养 3 ～ 4 d,而共
培养 3 ～ 4d的洋桔梗叶块转化率又显著高于共培养 2d。不
同共培养时间叶块 gus基因表达的组织化学检测结果(图 3)
也表明 ,随着共培养时间的增加 ,叶块出现蓝斑(gus基因表
达)的数量也随之增加 ,共培养 5 ～ 6 d叶块的蓝斑数量明显
多于其他处理 。
　　需要指出的是 ,当共培养时间超过 5 d时 ,在以后的继代
培养中 ,农杆菌会过度增殖 ,从而给后续的脱菌工作带来困
难 。因此 ,确定合适的共培养时间为 5 d。
表 3　不同共培养时间对农杆菌介导洋桔梗转化率的影响
共培养时间
(d)
接种总叶块数
(块)
再生卡那霉素抗性
不定芽叶块数(块)
转化率
(%)
2 45 2 4.5c
3 14 4 28.6b
4 44 13 29.5b
5 26 15 57.7a
6 33 21 63.6a
2.3　不同切割方法对叶块转化率和卡那霉素抗性苗数的
影响
由表 4可知 ,无论是叶块转化率 ,还是每个叶块再生卡那
霉素抗性苗数 , “刺孔法 ”均显著优于 “三刀切 ”。 “刺孔法 ”
的转化率达到 77.7%,比一般 “三刀切 ”的 57.7%提高了 20
百分点;卡那霉素抗性苗的平均数也增加了 0.26株 /块 。
　　由表 5可知 ,在以 “刺孔法 ”切割的叶块外植体中 ,不同
表 4　不同切割方法对叶块转化率和卡那霉素抗性苗数的影响
切割方法 转化率(%)
卡那霉素抗性苗平均数
(株 /块)
刺孔法 77.7a 0.64a
三刀切 57.7b 0.38b
切口部位对叶块转化率及每个叶块再生卡那霉素抗性苗数的
影响显著不同:筛选培养 30d后 ,切口在孔内和边缘的转化
表 5　“刺孔法 ”处理叶块不同切口部位对叶块转化率和卡那霉素抗性苗数的影响
叶块切
口部位
叶块外植体数
(块)
转化叶块数
(块)
转化率(%)
(筛选培养 30d后)
卡那霉素抗性苗总数(株)
(筛选培养 90d后)
卡那霉素抗性苗
平均数(株 /块)
孔内 94 45 47.9a 37 0.39a
边缘 94 57 60.6b 23 0.24b
—24— 江苏农业科学　2010年第 2期
率分别为 47.9%和 60.6%,切口在边缘的转化率显著高于在
孔内的转化率;再经 2次转接 、各 30 d的筛选培养 ,即总共
90d的筛选培养后 ,从最终获得的卡那霉素抗性苗数来看 ,
来源于切口在孔内和边缘的卡那霉素抗性苗的平均数分别为
0.39株 /块和 0.24株 /块 ,孔内来源的抗性苗数多于边缘来
源的抗性苗数 。
3　结论与讨论
本研究以 DoubleMariachiPink洋桔梗叶片为外植体 ,通
过比较发现 ,叶片外植体与农杆菌合适的共培养时间为 5 d。
新的切割方法——— “刺孔法 ”切割叶片外植体 ,对于不定芽的
再生 ,更优于一般的 “三刀切 ”处理 ,明显利于再生更多的不
定芽 ,因而也明显利于后续的遗传转化;结合 3 d的 “预培养 ”
和 5d的 “共培养 ”, “刺孔法 ”处理叶块外植体的遗传转化率
达到 77.7%,比一般 “三刀切 ”处理提高了 20个百分点 。进
一步分析表明 ,与孔外边缘切口相比 , “刺孔法 ”处理的孔内
切口更利于不定芽的再生 。
影响农杆菌介导的洋桔梗遗传转化的因素较多 ,但由于
农杆菌的附着 、DNA转移和整合都要在共培养阶段完成 ,因
此共培养时间是影响遗传转化效率的重要因素之一 。王关林
等 [ 11 ]认为 ,农杆菌需要经过一段 “细胞调节期 ”(16h)后才能
诱发 T-DNA的转移 ,即共培养时间必须长于 16h;但共培养
时间太长 ,农杆菌过度生长会使植物细胞受到毒害而死亡 。
本研究确定洋桔梗 DoubleMariachiPink的合适共培养时间
为 5d,这与 Mercuri等 [ 13 ]在洋桔梗试材遗传转化研究中采用
的共培养时间相一致;Ledger等 [ 14]在 Wakamurasaki洋桔梗
遗传转化研究中 ,采用的共培养时间为 2d;郑阳霞 [ 7]在 Deep
Blue洋桔梗遗传转化研究中 ,设定共培养时间 1 ～ 6 d,后经
比较发现 ,当共培养时间为 3 d时所得到的抗性芽分化率最
高(50%);毛元荣 [ 6 ]用 LisaBlue洋桔梗叶盘分别与农杆菌共
培养 2、4、6、8 d,在共培养 2 d时得到了最高的遗传转化率
(13.3%)。上述研究确定的合适共培养时间不尽相同 ,这可
能与研究所用洋桔梗品种及其生理状况等不同有关 。
一般对叶片外植体的处理方法多采用 “三刀切 ”[ 15 -16 ] 。
然而 ,对植物外植体进行一定创伤刺激后 ,能在合适的条件下
触发其细胞的脱分化和再分化;再生植株细胞起源于切口及
附近部位 ,创口面积的合理分布 ,更加有利于再生苗的发育和
生长 。同时 ,农杆菌感染外植体主要在切口部位 ,因为分生组
织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的侵染最为敏感 ,
而且创口面积的增大 ,能增加农杆菌侵染的附着面积 [ 17] 。因
此 ,本研究在 “三刀切 ”的基础上 ,新设计对洋桔梗叶片进行
“刺孔 ”处理 ,增加了外植体的创伤面积 ,而且使伤口以一定
密度均匀分布在整个叶块上 。研究结果表明 ,虽然 “刺孔法 ”
处理叶块增加了 “刺孔”的工作量 ,但每个叶块再生不定芽数
比 “三刀切 ”平均多了 4.22个 。此外 ,无论是在叶块转化率 ,
还是在每个叶块再生卡那霉素抗性苗数方面 , “刺孔法 ”也都
大大优于“三刀切 ”:“刺孔法 ”的转化率达到 77.7%,比一般
“三刀切 ”提高了 20个百分点 ,卡那霉素抗性苗的平均数也
增加了 0.26株 /块 。这对遗传转化率不高的植物种类 、品种
等试材而言 ,具有非常重要的意义 。
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