全 文 ：第 48 卷 第 3 期
2 0 1 2 年 3 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 48，No. 3
Mar．，2 0 1 2
农杆菌介导慈竹 4CL基因遗传转化梁山慈竹*
李晓瑞 胡尚连 曹 颖 卢学琴 任 鹏 吴晓宇 周美娟
(西南科技大学生命科学与工程学院 绵阳 621010)
摘 要: 以梁山慈竹 2 种类型成熟胚的愈伤组织为材料，采用农杆菌遗传介导的方法，将已构建好的具有降低木
质素含量的 PBI121-4CL-RNAi表达载体导入愈伤组织，探讨愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间
和温度对遗传转化的影响。研究结果表明，淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织是较好的遗传转化材料。以
在愈伤组织培养基上预培养 8 天的淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织为转化受体，在菌液浓度为
OD600 = 0. 05的 EHA105 中侵染 20 min 后，在 25 ℃、黑暗条件下共培养 2 天(共培养基表面加一层无菌滤纸) ，在含
有卡那霉素为 55 mg·L － 1的抗性筛选培养基上筛选 30 天，抗性愈伤组织率为 90%，经 PCR 检测，慈竹 4CL 基因已
导入梁山慈竹愈伤组织中。抗性愈伤组织在芽诱导培养基上诱导 30 天，可获得丛生芽，待丛生芽长至 3 ～ 5 cm 后，
在生根培养基上经过 20 ～ 30 天的诱导，可产生 1 ～ 8 条根，获得再生植株。经 PCR 检测，慈竹 4CL 基因已导入梁山
慈竹再生植株中，获得了转基因植株，转化效率为 9%。RT-PCR 检测结果表明，转 4CL 基因的梁山慈竹愈伤组织和
植株的内源 4CL 基因的表达受到抑制，且表达量比对照明显降低。
关键词: 梁山慈竹;愈伤组织;根癌农杆菌介导法;遗传转化
中图分类号:S718. 46 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2012)03 － 0038 － 07
收稿日期:2011 － 07 － 14;修回日期:2011 － 10 － 27。
基金项目:四川省“十二五”重点攻关资助项目;四川省应用基础研究基金资助项目(05JY029-101) ;四川主要丛生竹定向培育技术项目
(10zx1102)。
* 胡尚连为通讯作者。
Agrobacterium-Mediated Transformation of 4CL Gene from
Neosinocalamus affinis into Dendrocalamus farinosus
Li Xiaorui Hu Shanglian Cao Ying Lu Xueqin Ren Peng Wu Xiaoyu Zhou Meijuan
(College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology Mianyang 621010)
Abstract: The effects of preculture time，bacteria concentration，infection time，time and temperature of co-culture on
Agrobacterium-mediated transformation were studied through introducing expression vector PBI121-4CL-RNAi， that
decreases lignin content，into callus from a mature embryo of Dendrocalamus farinosus． Our purpose is to establish an
Agrobacterium-mediated transformation method of Dendrocalamus farinosus and to obtain transgenic plants． This study
could lay a foundation for transformation of Dendrocalamus farinosus． The results showed that the loose and fragile callus of
Dendrocalamus farinosus with pale yellow color and granular shape was a good donor to be used for Agrobacterium-mediated
transformation． The callus was precultured in the inducing medium for 8 days，before it was immersed for 20 min in
Agrobacterium suspension (EHA105，Agrobacterium concentration is OD600 = 0. 05) ，and then it were co-cultured in the
co-cultivation medium with single filter paper at 25 ℃ for 2 days in the dark． The co-cultured callus were transferred into
Kana-resistant medium containing Kana (55 mg·L － 1)for 30 days． The Kana-resistant callus was accounted for 90% of
the total callus． PCR identification of the Kana-resistant callus showed that the 4CL gene from Neosinocalamus affinis was
introduced into Dendrocalamus farinosus callus． The Kana-resistant calli were transferred to the shooting medium and
cultured for 30 days to obtain clustered shoots． After growing to 3—5 cm，the shoots were transferred into the rooting
medium for 20—30 days． The regeneration plants with 1—8 roots were obtained． PCR identification of resistant plants
showed that the 4CL gene from Neosinocalamus affinis was introduced into the resistant plants． The transgenic plant was
obtained． The transformation efficiency with the system was 9% ． The results showed that the endogenous 4CL gene
expression in the transgenic callus and plants was effectively suppressed． The expression in the transcription level is
significantly lower than the control by RT-PCR detection．
Key words: Dendrocalamus farinosus;callus;Agrobacterium-mediated method;genetic transformation
第 3 期 李晓瑞等:农杆菌介导慈竹 4CL 基因遗传转化梁山慈竹
竹类植物在分子标记(Dong et al．，2011;Tang
et al．，2010)、功能基因的分离与鉴定(Zhou et al．，
2011)等方面的研究取得了一定的进展，但仍滞后
于如水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、小麦
(Triticum aestivum)等禾本科(Gramineae)农作物。
由于竹子本身很难开花的特殊生物学特性，限制了
竹子遗传改良进程。近年来，尽管有调控竹木质素
合成酶基因克隆(金顺玉等，2010;胡尚连等，
2009)、纤维素合成酶基因克隆(张智俊等，2010;
杜亮亮等，2010)等方面的研究报道，但仍未见成功
遗传转化竹的相关研究，严重制约了基因工程在竹
遗传改良方面的应用。
梁山慈竹(Dendrocalamus farinosus)为竹亚科
(Bambusoideae)牡竹属(Dendrocalamus)植物，是四
川省本土大型丛生竹种之一，耐寒性较强，是优质高
产纸浆用材的原料，具有较好的水土保持作用，能够
明显地减少地表径流和泥沙侵蚀。长期以来对梁山
慈竹的研究主要集中在竹材解剖(方伟等，1998)、
退耕还林中的水土保持效应(笪志祥等，2007)、纤
维及造纸性能(张喜，1995)、遗传多样性(蒋瑶等，
2008)以及愈伤组织诱导与植株再生(Hu et al．，
2011)等方面，而遗传转化方面的研究至今尚未见
报道。作者所在研究室采用 RACE 技术已克隆到
慈竹(Neosinocalamus affinis)的 4CL(4 － 香豆酸辅
酶 A 连 接 酶 4-coumarate:CoA ligase，简 称 为
4CL)全长 cDNA 序列(GenBank:EU327341) (胡
尚连等，2009) ，并已构建好具有降低木质素含量
的 PBI121- 4CL-RNAi 表 达 载 体 (周 建 英 等，
2010) ，同时也建立了梁山慈竹愈伤组织培养与植
株再生体系(Hu et al．，2011) ，为本文研究奠定了
良好的基础。鉴于此，本文以梁山慈竹种子成熟
胚 的 愈 伤 组 织 为 材 料，采 用 根 癌 农 杆 菌
(Agrobacterium tumefaciens)介 导 法 将 构 建 好 的
PBI121-4CL-RNAi 表达载体导入梁山慈竹愈伤组
织，通过研究影响梁山慈竹遗传转化的因素，建立
农杆菌遗传转化梁山慈竹的方法，获得转基因植
株，为梁山慈竹遗传转化研究奠定基础，为竹功能
基因组学研究提供一个研究平台。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
以梁山慈竹 2 种类型的成熟胚愈伤组织(第 1
种类型为淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组
织;第 2 种类型为有绿色芽点的颗粒状胚性愈伤组
织)作为转化受体。
1. 2 主要培养基
基本培养基为改良的愈伤组织诱导培养基
(MS2) (Hu et al．，2011)。侵染培养基由液体 MS2、
稀释后的根癌农杆菌菌液和 100 μmol·L － 1的乙酰
丁香酮组成。共培养的培养基:由固体 MS2 培养基
和 100 μmol·L － 1的乙酰丁香酮组成。抗性筛选培
养基:由固体 MS2、55 mg·L － 1卡那霉素(Kana)和
500 mg·L － 1羧卞霉素(Carb)组成，筛选 30 天后，抗
性愈伤组织转接到固体 MS2 + 300 mg·L － 1羧卞霉素
的继代培养基上。芽诱导培养基:当抗性愈伤组织
分化出绿色芽点时，将其转接到用于诱导芽分化的
固体培养基(MA1) (Hu et al．，2011)上，同时加入
300 mg·L － 1羧卞霉素。根诱导培养基:当芽长到
3 ～ 5 cm高时，将其转接到含 100 mg·L － 1羧卞霉素
的生根培养基(Hu et al．，2011)上，进行根的诱导。
1. 3 根癌农杆菌菌株及质粒
根癌农杆菌菌株为 EHA105，采用冻融法，将周
建英(2010)构建好的 PBI121-4CL-RNAi 质粒转化
根癌农杆菌 EHA105，该质粒携带 4CL 基因和抗卡
那霉素的 NPTII 选择基因。
1. 4 根癌农杆菌的活化
挑取已转入 pBI121-4CL-RNAi 质粒的农杆菌，
在含有 50 mg·L － 1利福平和 100 mg·L － 1卡那霉素的
LB 平板上划线，在 28 ℃培养箱中培养 2 天，挑单菌
于 3 mL 摇菌管中，28 ℃摇动培养 2 天;以菌液为模
板，采用周建英(2010)设计的引物，在 PTC-200 PCR
自动扩增仪上分别扩增正向 Na4CL-F 和反向
Na4CL-R 基因目标片段约 600 bp(图 1) ，电泳验证
正确的菌液保存备用。
图 1 pBI121-4CL-RNAi 根癌农杆
菌菌液 PCR 验证
Fig. 1 PCR identification of Agrobacterium tumefaciens
with plasmid of pBI121-4CL-RNAi
1. 5 根癌农杆菌介导的梁山慈竹愈伤组织遗传转
化的方法
1. 5. 1 卡那霉素抗性筛选浓度的确定 将梁山慈
竹第 1 种类型的愈伤组织接种在含 15，35，55，75，
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林 业 科 学 48 卷
100 mg·L － 1卡那霉素的 MS2 培养基上，共 5 个处
理，每个处理 3 次重复，每次 30 ～ 40 块愈伤组织。
30 天后统计愈伤组织褐化率，以确定抗性筛选时卡
那霉素的使用浓度。经试验，卡那霉素以 55 mg·
L － 1为宜。
1. 5. 2 外植体的筛选 用含有 PBI121-4CL-RNAi
质粒的根癌农杆菌遗传转化 2 种不同类型的愈伤组
织，在 MS2 + 55 mg·L － 1 Kana + 500 mg·L － 1 Carb 的
固体培养基上筛选 30 天后，观察并统计其褐化率，
选择适宜的转化受体。
1. 5. 3 预培养时间的确定 以预培养 0，4，8，15
天的第 1 种类型的愈伤组织作为受体材料，在
OD600 = 0. 2的菌液中，110 r·min
－ 1、28 ℃的条件下
侵染 20 min，然后接种在表面加有 1 层无菌滤纸的
共培养基上，25 ℃黑暗培养 2 天，再将其置于 MS2
+ 55 mg·L － 1 Kana + 500 mg·L － 1 Carb 的固体培养基
上，共 4 个处理，每个处理 3 次重复，每次 30 ～ 40 块
愈伤组织。筛选培养 30 天，观察并统计愈伤组织褐
化率，选择合适的预培养时间。
1. 5. 4 根癌农杆菌菌液浓度与侵染时间的确定
将已确定较适宜预培养天数的第 1 种类型愈伤组
织，分别在 OD600值为 0. 05，0. 2，0. 5 的菌液中和
110 r·min － 1，28 ℃的条件下侵染 10，20，30 min，然
后将其接种在表面加有 1 层无菌滤纸的共培养基
上，25 ℃黑暗培养 2 天，再将其置于 MS2 + 55 mg·
L － 1 Kana + 500 mg·L － 1 Carb 的固体培养基上，每个
处理 3 次重复，每次 30 ～ 40 块愈伤组织。筛选培养
30 天，观察并统计愈伤组织褐化率，确定抗性愈伤
组织获得率较高的组合。
1. 5. 5 共培养时间、温度及方式的确定 将已确定
较适宜预培养天数的第 1 种类型愈伤组织，分别在
OD600值为 0. 05，0. 2，0. 5 的菌液中和 110 r·min
－ 1，
28 ℃的条件下侵染 20 min 后，分别在 25，28 ℃条
件下，将其接种在表面加有 1 层无菌滤纸和不加的
共培养基上，分别黑暗培养 2 天、3 天，然后将其置
于 MS2 + 55 mg·L － 1 Kana + 500 mg·L － 1 Carb 的固体
培养基上，每个处理 3 次重复，每次 30 ～ 40 块愈伤
组织。抗性筛选 30 天，确定最佳共培养时间、温度
和共培养方式。
1. 5. 6 抗性愈伤组织筛选与植株再生 共培养结
束后，将愈伤组织转接到抗性筛选培养基(MS2 +
55 mg·L － 1 Kana + 500 mg·L － 1 Carb)上，然后将筛
选 30 天的抗性愈伤组织，转入含有 300 mg·L － 1 Carb
的 MS2 培养基上继代培养，每 2 ～ 3 周继代 1 次，将
培养至泛绿的愈伤组织转接到芽诱导分化培养基
(MA1 + 300 mg·L － 1 Carb)上，待芽长至 3 ～ 5 cm 后，
将其转接到生根培养基上。
1. 6 PCR 与 RT-PCR 检测
以筛选培养 2 个月的抗性愈伤组织及其抗性植
株为 材 料，分 别 在 液 氮 中 迅 速 研 磨 后，采 用
TIANGEN 试剂盒分别提取 DNA 和 RNA。
扩增 NPT Ⅱ全长引物序列为 F:AGAGGCT
ATTCGGCTATGACTG; R: ACTCGTCAAGAAGGCG
ATAGAA。扩增 4CL 基因引物序列为 F:TAGGA
CAGGGCTATGGGATG; R: ATGCAAATCTCCCCTG
ACTG。扩增 Tublin 内参基因引物序列为 F:AAC
ATG TTGCCTGAGGTTCC;R:GTTCTTGGCATCCCA
CATCT。序列由上海生物工程有限公司合成。
NPT Ⅱ-PCR 检测:PCR 扩增体系为 20 μL。反
应程序为:95 ℃预变性 3 min;95 ℃变性 30 s，65
℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，35 个循环;72 ℃延伸 5
min。取 PCR 产物 5 μL 在 1%琼脂糖凝胶上进行电
泳检测。
RT-PCR 检测:选择已导入 4CL 基因的愈伤组
织和植株的 RNA 为模板，由宝生物(TaKaRa)公司
的 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H ˉ)反转录
试剂盒提供的试剂，进行 cDNA 合成反应，然后通过
Bio-Rad 公司的 PTC-200 PCR 自动扩增仪进行扩
增。反应体系为 20 μL，42 ℃保温 1. 5 h，70 ℃保温
15 min，停止反转录反应，取出合成的 cDNA 产物，
－ 20 ℃ 条件下保存。4CL 基因、Tublin 基因的
RT-PCR扩增反应体系都为 20 μL，取 2 μL cDNA 模
板，95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，
72 ℃10 min，30 个循环。PCR 反应产物在 1%琼脂
糖凝胶上进行电泳。
2 结果与分析
2. 1 卡那霉素抗性筛选浓度的确定
卡那霉素浓度的敏感性试验结果表明:随着浓
度不断提高，没有转基因的梁山慈竹第 1 种类型愈
伤组织表现出明显褐化现象。由表 1 可知，Kana 对
梁山慈竹愈伤组织具有强烈的抑制作用，30 天后，
在 Kana 浓度为 55 mg·L － 1的培养基上，愈伤组织的
褐化率为 48. 7%;Kana 浓度为 100 mg·L － 1的培养
基上，62. 0%的愈伤组织褐化死亡。由于竹愈伤组
织再生植株较难，因此，本研究以 55 mg·L － 1的 Kana
作为抗性筛选浓度。
2. 2 外植体的筛选
在遗传转化过程中，受体材料的类型十分重要。
用含有 PBI121-4CL-RNAi 质粒的根癌农杆菌遗传
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第 3 期 李晓瑞等:农杆菌介导慈竹 4CL 基因遗传转化梁山慈竹
表 1 卡那霉素对梁山慈竹第 1 种类型愈伤组织的作用
Tab． 1 Effect of Kana on the first type of callus
of Dendrocalamus farinosus
卡那霉素的浓度
Concentration of Kana /(mg·L － 1)
愈伤组织的褐化率
Browning rate of callus(%)
15 27(± 3. 65)
25 34(± 2. 95)
35 36(± 3. 17)
55 48(± 2. 18)
75 53(± 0. 31)
100 62(± 4. 37)
转化 2 种不同类型的愈伤组织后，共培养 2 ～ 3 天，
第 2 种类型的愈伤组织，虽然其抗性愈伤组织率为
50%，但是在诱导芽分化时，其易受农杆菌和抗生素
的影响，大部分褐化死亡，不适合作转化受体;第 1
种类型，即淡黄色、颗粒状、疏松易碎的愈伤组织在
抗性培养基上筛选时，抗性愈伤组织获得率可达
90%。因此，第 1 种类型的愈伤组织是较好的遗传
转化受体。
2. 3 外植体预培养时间对愈伤组织遗传转化的
影响
在遗传转化过程中，受体材料的状态也很重要。
选择淡黄色、颗粒状、疏松易碎、生长分裂旺盛的胚
性愈伤组织作为转化受体材料。通过试验结果表
明，以预培养 8 天、生长良好的愈伤组织为受体材
料，更有利于遗传转化(图 2A)。
2. 4 根癌农杆菌菌液浓度、侵染时间对愈伤组织遗
传转化的影响
农杆菌接种侵染的过程是农杆菌侵入植物组织
并吸附在植物细胞上的过程，侵染时间越久，农杆菌
吸附在植物细胞上的数量也就越多。而在本研究
中，菌液浓度过高、侵染时间过长，梁山慈竹抗性愈
伤组织获得率呈降低趋势(图 2B)。所以，对梁山慈
竹愈伤组织侵染时，农杆菌浓度以 OD600 = 0. 05 和
OD600 = 0. 2 较为适宜，侵染时间为 20 min。
2. 5 共培养时间、温度及方式对愈伤组织遗传转化
的影响
共培养时间的长短对遗传转化有着很大的影响。
本研究表明，菌液浓度越高，共培养的时间越久，愈伤
组织褐化越严重，抗性愈伤组织率也越低(图 2C) ，且
周围有农杆菌生长，没有褐化的愈伤组织表面呈暗黄
色。侵染后的愈伤组织分别在 25，28 ℃下共培养
时，愈伤组织褐化程度较低的共培养温度是 25 ℃，且
在共培养基表面加 1 层无菌滤纸，能有效抑制农杆菌
的生长和减少愈伤组织的褐化。在共培养 2 天时，
OD600 = 0. 05 侵染愈伤组织 20 min 时，可获得较高的
抗性愈伤组织率(90%)。在共培养 3 天时，随菌液浓
度的增加，抗性愈伤组织率也在降低。通过对影响抗
性愈伤组织率的共培养时间、温度及方式的研究，认
为较低菌液浓度 OD600 = 0. 05 侵染的愈伤组织，在表
面加有 1 层无菌滤纸的共培养基上，25 ℃暗培养
2 天，可以获得较高的抗性愈伤组织率。
图 2 外植体预培养时间、菌液浓度和侵染时间、共培养时间对梁山慈竹愈伤组织遗传转化的影响
Fig. 2 Effects of explants preculture time，infection time and concentration，co-cultivation
time on transformation of callus in Dendrocalamus farinosus
2. 6 转基因植株的获得与 RT-PCR 检测
将预培养 8 天的梁山慈竹第 1 种类型胚性愈伤
组织，在 OD600 = 0. 05 的菌液中、110 r·min
－ 1、28 ℃
侵染 20 min，25 ℃暗培养 2 天后(图 3A) ，转接到含
有 55 mg·L － 1 Kana 的筛选培养基上筛选 30 天(图
3B) ，获得抗性愈伤组织，经 PCR 检测，pBI-4CL-
RNAi 质粒已导入愈伤组织内(图 4)。将已导入
4CL 基因的抗性愈伤组织转入诱导芽的 MA1 培养
基上(图 3C) ，诱导 30 天后，可以获得丛生芽(图
3D) ，待丛生芽长至 3 ～ 5 cm 时(图 3E) ，将其转入
生根培养基，经过 20 ～ 30 天的诱导(图 3F) ，可产生
1 ～ 8 条根，获得梁山慈竹抗性植株(图 3G)。经
PCR 检测，扩增出约 750 bp 的目的条带，证明 pBI-
4CL-RNAi 质粒已转入梁山慈竹抗性小植株内(图
4) ，表明已获得转 4CL 的梁山慈竹小植株，转化效率
为 9%，将获得的转基因植株移栽至小盆中生长(图
14
林 业 科 学 48 卷
3H)。在本研究中，羧卞霉素对梁山慈竹生根影响很
大，转基因植株的根比未转基因(图 3I)的短。
以转慈竹 4CL 基因抗性愈伤组织和再生植株
的 cDNA 为模板，分别用 4CL 和 Tublin 引物进行
RT-PCR 扩增，如图 5 所示，转基因愈伤组织和植株
中均可获得特异性扩增产物，但与未转基因的对照
相比，其表达量明显降低，说明采用 RNAi 技术将慈
竹 4CL 基因导入梁山慈竹愈伤组织和再生植株后，
能有效抑制梁山慈竹转基因愈伤组织和植株的内源
4CL 基因的表达水平。
图 3 梁山慈竹愈伤组织遗传转化与植株再生
Fig. 3 Genetic transformation of callus and plant regeneration in Dendrocalamus farinosus
A． 愈伤组织共培养;B．抗性愈伤组织筛选;C．抗性愈伤组织分化;D．抗性芽的诱导;E．抗性芽的伸长;F．抗性芽生
根;G，H． 转基因植株;I．未转基因植株的根(左)和转基因植株的根(右)。
A． Co-cultivation for resistant callus;B． Selection for resistant callus;C． Differential culture of resistant callus;D． Induction
of resistant shoots;E． Elongation of resistant shoots;F． Rooting of resistant shoots;G，H． Transgenic plants;I． The root of
the non-transgenic plant (left)and the transgenic plant (right)．
图 4 转慈竹 4CL 基因抗性愈伤组织和
再生植株的 PCR 检测
Fig. 4 PCR identification of Kana-resistant embryogenic callus and
transgenic plants with 4CL gene from Neosinocalamus affinis
M． Marker (DL2000) ;N． (阳性对照)质粒 DNA;P1 ． (阴性对
照)未转化愈伤组织 DNA;1 － 5． 转基因愈伤组织;P2 ． (阴性
对照)未转基因植株 DNA;6 － 11． 转基因植株。
M． Marker (DL2000) ;N． Plasmid DNA(positive control) ;P1 ．
Non-transgenic embryogenic callus DNA(negative control) ;1 － 5．
Transgenic embryogenic callus; P2 ． Non-transgenic plants DNA
(negative control) ;6 － 11． Transgenic plants．
图 5 转慈竹 4CL 基因的愈伤组织和
再生植株的 RT-PCR 检测
Fig. 5 RT-PCR detection of transgenic embryogenic callus and
transgenic plants with 4CL gene from Neosinocalamus affinis
P1 ． (阴性对照)未转化愈伤组织 cDNA;1 － 5． 转基因愈伤组
织;P2 ． (阴性对照)未转基因植株 cDNA;6 － 11． 转基因植株;
Tubulin．内参。
P1 ． Non-transgenic embryogenic callus cDNA(negative control) ;
1 － 5． Transgenic embryogenic callus;P2 ． Non-transgenic plants
cDNA(negative control) ;6 － 11． Transgenic plants． Tubulin．
Control．
24
第 3 期 李晓瑞等:农杆菌介导慈竹 4CL 基因遗传转化梁山慈竹
3 讨论与结论
外植体的类型(Shen et al．，1993)和预培养
(Lawrence et al．，2000;Xu et al．，2009)、菌株类型
(Hiei et al．，1994)和菌液浓度(Swain et al．，2010)、
侵染时间(Barik et al．，2005)、共培养时间(Zhao et
al．，2002;Ishida et al．，1996)和温度(Frame et al．，
2002;Fullner et al．，1996)等对遗传转化效率有很
大影响。本研究在菌液浓度 OD600 = 0. 05 的条件
下，采用 EHA105 侵染梁山慈竹成熟胚愈伤组织 20
min，获得较好的转化效果。不同的菌株类型对不同
类型植物的作用不同，王宏芝等(2004)认为高毒性
的菌株 EHA105 对小麦具有更强的侵染力;在陶传
涛等(2008)的研究中，使用 EHA105 侵染玉米未成
熟胚愈伤组织 20 min，获得了较高转化率，但是菌液
浓度为 OD600 = 0. 6，远高于本研究使用的 OD600 =
0. 05 的浓度;而 Ozawa(2009)的研究采用 OD600 =
0. 04 的 EHA 101 侵染水稻愈伤组织，获得了较高转
化率。由此可见，不同的禾本科植物对农杆菌的敏
感性不同，因此，寻找适宜的菌株类型及菌液浓度和
侵染时间的组合十分重要。
已有研究表明，20 ～ 25 ℃共培养可提高转化效
率(Frame et al．，2002;Fullner et al．，1996)。本研究
在共培养时，25 ℃暗培养 2 天，不同于 He 等(2006)
的 21 ℃和 Hiei 等(1994)的 22 ℃的结论。关于共
培养时间，一般认为 2 ～ 3 天为佳(Zhao et al．，2002;
Ishida et al．，1996)。本研究认为共培养方式也是影
响转化效率的重要因素，在固体共培养基表面加 1
层无菌滤纸，能有效抑制农杆菌的生长，这样也兼顾
了愈伤组织的生长温度(25 ℃) ，而不用降低共培养
温度来防止农杆菌过度生长。Ozawa(2009)的研究
表明，侵染后的水稻愈伤组织，在用液体培养基浸湿
的 3 层滤纸上，25 ℃暗培养 3 天，转化效果比共培
养在固体培养基上更好。
Cheng 等(2004)认为 AS(乙酰丁香酮)能有效
促进农杆菌对一些植物的转化，尤其是单子叶植物。
Mohri 等(1997)在日本白桦(Betula platyphylla var．
japonica)的转化中报道，在共培养基中加入 100
μmol·L － 1 AS 可使转化率提高 8 倍，但也有在侵染
液中加入 AS 取得很好的转化效果的报道(Owens et
al．，1988)。鉴于 AS 能促进单子叶植物的转化，并
且在共培养基中或侵染液中加入 AS 能起到很好的
促进作用，本研究在侵染液和共培养基中均加入了
100 μmol·L － 1的 AS，也取得好的转化效果。
本研究通过农杆菌介导法成功地将慈竹 4CL
基因导入梁山慈竹愈伤组织中，并筛选出转基因植
株。在整个过程中，高效的组织培养和再生体系的
建立是重要因素之一。对影响农杆菌介导梁山慈竹
愈伤组织遗传转化效率因素(菌液浓度、侵染时间、
共培养时间和温度及方式等)的研究表明:菌液浓
度、侵染时间、共培养方式对愈伤组织的存活和转化
效果有明显影响，采用 OD600 = 0. 05 的 EHA105 侵
染梁山慈竹愈伤组织 20 min，在表面加有 1 层无菌
滤纸的共培养基上，25 ℃暗培养 2 天，抗性愈伤组
织的获得率高达 90%，转化效率为 9%。不同的植
物对 Kana 的敏感性不同，在本研究中，Kana 的使用
浓度 55 mg·L － 1要比水稻(500 mg·L － 1) (Dekeyser et
al．，1999)、小麦(100 mg·L － 1) (贺杰等，2010)等禾
本科农作物的低，但是，Kana 强烈抑制梁山慈竹愈
伤组织根芽分化。在今后的研究中，还需要进一步
摸索防褐化条件，减少抗性愈伤组织的死亡;进一
步优化移栽条件，提高转基因植株成活率。
本研究采用 RT-PCR 技术已证明，在已获得的
梁山慈竹转基因愈伤组织和植株中，其内源 4CL 基
因的表达水平得到抑制，这些结果有助于进一步分
析转基因植株 4CL 酶活性、木质素含量及其组分的
变化，为有效筛选减少木质素含量或改变木质素组
成的梁山慈竹提供了可行途径。尽管在转录水平上
对转基因梁山慈竹植株进行了检测，但在今后的研
究中，还需采用 Western 杂交技术对转基因植株的
蛋白质进行分析，以检测在翻译水平上的转基因表
达量。
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(责任编辑 徐 红)
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