全 文 ：中国农学通报 2012,28(34):53-57
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：江苏省科技厅高新技术研究项目“红叶石楠、三叶草抗逆新品种（系）选育”(BG2007317)；山东省科技厅“山东省良种工程农业生物资源创
新利用研究”[鲁农良种字(2010)117号]。
第一作者简介：李妮，女，1989年出生，甘肃庆阳人，硕士，主要从事蔬菜育种及生物技术方面的研究。通信地址：730070甘肃兰州市安宁区营门村1
号，甘肃农业大学农学院，Tel：0931-7631145，E-mail：lini0102@163.com。
通讯作者：梁慧敏，女，1962年出生，宁夏银川人，教授，博士，主要从事园林植物组培和育种。通信地址：212400江苏句容江苏省句容市长江路3号，
江苏农林职业技术学院，Tel：0511-87290906，E-mail：lianghuimin0218@126.com。
收稿日期：2012-07-25，修回日期：2012-09-11。
红叶石楠RAPD反应体系的优化
李 妮 1，燕丽萍 2,3，刘翠兰 2,3，屈 星 1，梁慧敏 4，夏 阳 2,3
（1甘肃农业大学农学院，兰州 730070；2山东省林业科学研究院，济南 250014；
3山东省林木遗传改良重点实验室，济南 250014；4江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400）
摘 要：建立并研究适合红叶石楠的RAPD的最佳反应体系，为以后开展红叶石楠的遗传多样性研究、物
种资源研究和亲缘关系鉴定等提供重要的参考。采用改进后的CTAB法，成功地提取了红叶石楠基因
组DNA，通过单因素试验设计，研究了Mg2+、dNTP、引物的浓度和模板DNA，Taq酶的用量对RAPD反应
的影响，建立适合于红叶石楠的RAPD反应体系。结果表明，在25 μL的RAPD反应体系中最佳反应条件
分别是 10×PCR Buffer 2.5 μL、Mg2 + (25 mmol/L) 2.0 μL、引物(20 μmol/L) 2.0 μL、dNTPs (2.5 mmol/L)
1.8 μL、DNA模板(49.5 μg/mL) 2.0 μL、Taq聚合酶0.3 μL (5 U/µL)。适宜的PCR循环程序为94℃预变性
4 min，然后 44个循环（94℃变性 30 s，36℃退火 30 s，72℃延伸 2 min）后，72℃延伸 10 min，最后 16℃保
存。改进的CTAB法能成功地提取红叶石楠基因组DNA，利用单因素试验设计所建立的RAPD反应体
系，通过重复试验证明了该体系稳定可靠，可应用于红叶石楠遗传多样性、亲缘关系等方面的研究中，为
红叶石楠在分子生物学研究奠定了基础。
关键词：红叶石楠；RAPD；体系优化
中图分类号：S687.2 文献标志码：A 论文编号：2012-2619
Optimization of RAPD System for Photinia faseri
Li Ni1, Yan Liping2,3, Liu Cuilan2,3, Qu Xing1, Liang Huimin4, Xia Yang2,3
(1College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;
2Shandong Provincial Academy of Forestry, Jinan 250014;
3Shandong Provincial Key Laboratory of Forest Genetic Improvement Tree, Jinan 250014;
4Jiangsu Agriculture and Forestry Profession Technology College, Jurong Jiangsu 212400)
Abstract: The reference for the research on the diversity and resource of Photinia faseri and the identification
of the relation of its varieties were provided through establish and study the stable system of RAPD reaction.
The genomic DNA of Photinia faseri was successfully extracted with the improved CTAB method and studied
the concentrations of Mg2 + , dNTPs and primer, and the dosages of template DNA and TaqDNA polymerase
which could influence the results of RAPD by the single factor design, established the suitable system of
RAPD reaction for Photinia faseri. The results showed that the optimized RAPD reaction conditions were 10×
PCR Buffer 2.5 μL, Mg2 + (25mmol/L) 2.0 μL, primer (20 μmol/L) 2.0 μL, dNTPs(2.5 mmol/L) 1.8 μL, DNA
(49.5 μg/mL) 2.0 μL, Taq polymerase 0.3 μL (5 U/μL) in a total of 25 μL reaction system. The appropriate
PCR procedure was pre-denaturing at 94℃ for 4 min, followed 44 cycles (denaturing at 94℃ for 30 s，
annealing at 36℃ for 30 s, extending at 72℃ for 2 min), extending at 72℃ for 10 min and preserving at 16℃.
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0 引言
红叶石楠(Photinia fraseri)是蔷薇科石楠属植物的
杂交种或选育的栽培种,又名火焰红、千年红，因其具
有鲜红色的新梢和嫩叶而得名[1]，是优良的彩叶观赏
树种。红叶石楠在国外特别是欧美和日本早被广泛应
用，被誉为“红叶绿篱之王”[2-3]。中国在20世纪90年代
中期从国外引种后开始进行大批量的速繁和推广。目
前，国内对红叶石楠的研究主要集中在组织培养及工
厂化育苗成套技术、扦插繁殖育苗技术、造型艺术和园
林应用等方面[4]。而在美国、日本、新西兰等国家，则
主要集中在对不同品种生理特点和栽培繁殖技术的研
究[5-9]。然而国内外至今尚未见有关红叶石楠分子标记
体系构建的相关研究报道。
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)标
记是目前研究者最常使用的DNA标记技术之一[10-12]，
它是以基因组为模板，以随机10个碱基的核苷酸序列
为引物，经PCR扩增后产生不连续的DNA产物，来检
测DNA多态性的技术。RAPD技术与其他的分子标
记相比具有很大的优越性，它具有DNA用量少、对
DNA的纯度要求较低、标记数量丰富、通用性强且无需
使用同位素等特点，除此之外，RAPD操作简单，省时省
力，且费用较低。现已广泛应用于植物群体遗传多样
性、物种起源、系统进化、种质资源鉴定、保存和利用、构
建基因图谱和分子标记辅助育种等研究领域[13-15]。本
研究以红叶石楠为试验材料，采用单因素设计，即在稳
定其他因素的情况下，对RAPD反应体系中某一因素
进行梯度调整，探讨了DNA模板、dNTPs、引物、MgCl2
和TaqDNA聚合酶等条件对其扩增结果的影响，对其
反应体系中各因子的反应条件进行优化，建立一种适
合于红叶石楠稳定的RAPD反应体系,以期为进一步
的RAPD研究奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 时间与地点
实验于 2011年 11月—2012年 4月在山东省林木
遗传改良重点实验室进行。
1.2 材料及主要试剂
红叶石楠样品于 2011年 9月 25号采自江苏农林
职业技术学院实习基地农博园，树龄为两年生，选取生
长状况良好的幼嫩叶片，采摘后于-20℃冰箱中保存
待用。
实验所用 TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer (Mg2 +
Free)、dNTPs、MgCl2、MarkerDL2000 等 PCR 试剂及
RAPD随机引物均购自TaKaRa公司，乙醇、氯仿、异戊
醇等其他试剂均为国产分析纯。PCR仪为北京东方
安诺生化科技有限公司生产的Master cycler Personal
PCR仪，凝胶成像仪为GENE GENIUS全自动凝胶成
像，电泳仪为北京六一生产的DYCP-31DN电泳仪。
1.3 基因组DNA提取
选取红叶石楠幼嫩叶片，采用改进后的CTAB[16-17]
法提取红叶石楠基因组DNA，提取的DNA纯度与浓
度经Gene Quant紫外分光光度计检测，测得浓度为
495 μg/mL（用时稀释10倍），-20℃保存备用。
1.4 RAPD引物筛选
按引物 GC含量不同，随机挑选出 35个 S系列
RAPD引物，用所提取的红叶石楠DNA作为模板，对
所选的35条引物进行PCR扩增，筛选出条带数量多且
相对清晰、稳定且重复性好的14条引物作为研究所用
引物（表1）。
The genomic DNA of Photinia faseri was successfully extracted with the improved CTAB method and the
reaction system was established for the procedure of RAPD by the single factor design, through the repeat tests
showed that this system was stable and reliable, and could be used in the genetic diversity and genetic
relationship of Photinia faseri, it laid the foundation to research Photinia faseri in molecular biology.
Key words: Photinia fraseri; RAPD; optimization
引物编号
S151
S154
S155
S156
S157
S158
S159
引物序列（5—3）
GAGTCTCAGG
CTACTGCCGT
AACGGTGACC
GGTGACTGTG
CTACTGCCGT
GGACTGCAGA
ACGGCGTATG
引物编号
S190
S191
S192
S196
S198
S187
S160
引物序列（5—3）
ACGGCGTATG
ACCGTTCCAG
CTGGCGAACT
AGGGGGTTCC
CTGGCGAACT
TCCGATGCTG
AACGGTGACC
表1 体系优化时所用的RAPD引物序列
·· 54
李 妮等：红叶石楠RAPD反应体系的优化
1.5 RAPD-PCR反应体系的优化设计
采用单因素递进筛选方法，选取对RAPD影响较
大的5种因素进行单因素设计，即每次只改变RAPD反
应体系中的一个反应因素，保持其他因素的浓度水平
不变，各因素水平设置见表2。扩增总体积为25 μL，灭
菌双蒸水补足。对上述因素进行优化时，退火温度先
设37℃，待扩增反应体系中各成分确定浓度后再对退
火温度进行筛选。退火温度设为34、35、36、37℃。
因素
MgCl2(25 mmol/L)
dNTPs(2.5 mmol/L)
Primer(20 μmol/L)
DNA(49.5 µg/mL)
Taq酶(5 U/μL)
水平（体积）/μL
1
1.4
1.2
1.2
1.0
0.1
2
1.6
1.4
1.4
1.5
0.2
3
1.8
1.6
1.6
2.0
0.3
4
2.0
1.8
1.8
2.5
0.4
5
2.2
2.0
2.0
3.0
0.5
6
2.4
2.2
2.2
3.5
0.6
7
2.6
2.4
2.4
—
—
表2 RAPD反应体系单因素设计
1.6 电泳检测
PCR结束后，在扩增产物加入 3 μL 6×Loading
Buffer混匀，于含有 0.5 μg/mL EB的 1.5%琼脂糖凝胶
电泳分离（120 V电压下电泳 25 min），电泳结束后在
GENE GENIUS全自动凝胶成像系统上观察和照相。
2 结果与分析
2.1 Mg2+的优化结果
Mg2+为 TaqDNA酶的激活剂，它的浓度对RAPD
反应的特异性和扩增效果都有影响。实验结果表明
（图 1）：当Mg2+体积为 1.4 μL时，RAPD的扩增产物几
乎不存在，在1.8 μL和2.0 μL之间时扩增效果较好，条
带清晰，而当Mg2+体积大于2.0 μL时，目的条带的扩增
数量减少且逐渐减弱，最终选定Mg2+体积为2.0 μL。
2.2 模板DNA优化结果
从图 2看出，当模板DNA体积小于 2.0 μL时，扩
增出的条带较少，且扩增出来的条带亮度不够，以
2.0 μL和 2.5 μL扩增效果最好,当体积大于 2.5 μL时，
扩增出的条带开始变弱，综合扩增效果和成本 2个方
面考虑，选定模板DNA的体积为2.0 μL。
2.3 引物的优化结果
从图3看出，当引物体积为1.2 μL时，不能扩增出
所有的条带，当体积小于 2.0 μL时扩增出来的条带较
弱且亮度不够，以2.0 μL和2.2 μL时扩增效果最好，综
合扩增效果和成本考虑，选定引物体积为2.0 μL。
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 M
泳道1~7：Mg2+体积分别为1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 μL；M：DL2000
图1 Mg2+量对扩增结果的影响
1 2 3 4 5 6 M
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
泳道1~6：DNA体积分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL；M：DL2000
图2 模板DNA的量对扩增的影响
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 M
泳道1~7：引物体积分别为1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 μL；M：DL2000
图3 引物的量对扩增结果的影响
·· 55
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2.4 dNTPs优化结果
从图 4看出，dNTPs的体积为 1.2 μL时扩增效果
差，检测到扩增产物很少，随dNTPs体积的增大，扩增
强度逐渐增强，到dNTPs 1.8 μL时达到峰值，扩增效果
较好，超过此浓度后扩增强度又逐渐变暗，最终选定
dNTPs体积为1.8 μL。
2.5 Taq DNA聚合酶优化结果
从图5看出，当Taq DNA酶用量低于0.3 μL时，扩
增条带弱，当Taq酶为 0.3 μL和 0.4 μL时扩增带亮度
明显增强，扩增效果好，当酶用量超过 0.4 μL后，扩增
条带又逐渐变暗，同时考虑到经济因素，最终选定Taq
酶的用量为0.3 μL。
2.6 退火温度的优化结果
从图 6看出，退火温度在 34℃时，没有条带出现，
当温度为35℃时条带出现，36℃时条带亮而清晰，37℃
时条带变弱，因此选定36℃为退火温度。
2.7 优化体系的建立
根据以上几个主要因子的优化结果，确定了PCR
的扩增程序的优化体系。依此体系进行了3次重复试
验，每次实验同时做5份平行样，均能获得稳定的实验
结果（图7）。
3 结论
笔者对RAPD反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓
度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA酶等5个主要
影响因素进行了系统的研究，并对扩增程序中退火温
度进行了优化，3次重复实验后，最终确立了红叶石楠
RAPD-PCR反应体系：25 μL体系中 10×PCR Buffer
2.5 μL、5 U/μL Taq DNA酶 0.3 μL、49.5 μg/mL模板
DNA 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L
dNTPs 1.8 μL、20 μmol/L Primer 2.0 μL、灭菌双蒸水
14.4 μL。最佳扩增程序为：94℃预变性4 min，然后44
个循环（94℃变性 30 s，36℃退火 1 min，72℃延伸
2 min）后，72℃延伸10 min，最后16℃保存。
4 讨论
利用改良的CTAB法能够快速有效地从红叶石楠
嫩叶中提取基因组DNA，其纯度和浓度都能够满足
RAPD优化体系对DNA的要求。RAPD分析一般采
用Williams等[10]的反应体系，但该反应体系并不适合
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 M
泳道1~7：dNTPs体积分别为1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 μL；
M：DL2000
图4 dNTPs的量对扩增结果的影响
1 2 3 4 5 6 M
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
泳道1~6：Taq酶的体积分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL；M：DL2000
图5 Taq酶用量对扩增结果的影响
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 M
泳道1~4分别为34、35、36、37℃；M：DL2000
图6 退火温度对RAPD反应的影响
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 M
25 μL体系；10×PCR Buffer 2.5 μL、Taq酶0.3μL、DNA 2.0 μL、MgCl2
2.0 μL、dNTPs 1.8 μL、Primer 2.0 μL、灭菌双蒸水14.4 μL，M：DL2000
图7 最佳反应体系
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李 妮等：红叶石楠RAPD反应体系的优化
所有的物种，不同的实验材料、不同的实验条件都会对
RAPD的结果产生很大的影响 [18-21]。本实验表明，在
RAPD反应体系中，模板DNA的质量和纯度、Mg2+浓
度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物浓度与纯
度、退火温度等因素都会对红叶石楠的RAPD扩增结
果具有不同程度影响。Mg2 +作为 Taq聚合酶的激活
剂，浓度过高或过低都会对反应有比较大的影响；Taq
聚合酶的用量受到反应体积、酶活性、酶的耐热性等因
素制约，因此需要适量的 Taq聚合酶；引物浓度对
RAPD反应的特异性扩增和扩增产物的量都有一定的
影响；引物的退火温度取决于引物的碱基组成、长度和
浓度，也决定了反应的特异性；底物 dNTPs的量对循
环数、扩增产物的量有较大影响，浓度过高或过低均会
影响扩增条带的效果。因此，各反应因子的优化组合
是获得清晰，重复性好且稳定的RAPD扩增产物的前
提，也是扩增成功的关键，只有研究出合适的反应条
件，才能获得稳定且重复性较高的实验结果。笔者采
用单因素多水平梯度试验设计有效的筛出了Taq酶、
引物、DNA模板、Mg2+、dNTPs的浓度或用量，优化得
出红叶石楠PCR-RAPD最佳反应条件和扩增程序，为
进一步研究红叶石楠遗传多样性奠定了基础。
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