全 文 ：园 艺 学 报 1998 , 25 (2):175～ 178
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:1997-12-04;修回日期:1998-03-12。
＊上海市建设技术发展基金资助。
球根鸢尾的病毒鉴定及试管脱毒成球技术＊
袁梅芳 杨建瑛 吴保平
(上海市园林科学研究所 , 上海 200232)
提 要 对上海地区球根鸢尾进行了病毒病害调查。经检测初步确定球根鸢尾普遍存在
鸢尾重花叶病毒 、鸢尾轻花叶病毒 、 水仙潜隐病毒 3 种病毒的复合侵染。对带毒种球进行茎尖
组培脱毒 , 得出了茎尖诱导成芽 、 芽成球及小球生根的培养基配方。将组培苗在试管苗 、 成球
苗 、移栽苗等不同时期进行病毒检测 , 结果表明 , 小于 1.0 mm 的茎尖诱导的幼苗可脱去上述
3 种病毒。
关键词 球根鸢尾;病毒鉴定;茎尖组培脱毒
球根鸢尾作为一种新的鲜切花品种 , 近几年由荷兰大批引进栽植。但由于病毒病害的
影响 , 植株叶片产生花叶 、褪绿 、花色斑驳 , 切花的数量和质量明显下降 。当球茎连续种
植几年后 , 病毒积累到一定程度 , 可引起种球退化 , 以致失去商品价值。因此 , 对引进的
球根鸢尾进行病毒种类鉴定 , 结合茎尖组培脱毒使种球复壮 , 尤为重要 。
1 材料与方法
1.1 病毒病调查和病毒种类鉴定
病毒病调查时间为 1991 ～ 1995年 , 调查地点在本所试验地 、上海市林业站 、上海市青
东农场和崇明县和兴园艺场球根鸢尾种植地 , 调查品种共 17个。
免疫双扩散试验:将待测样品用 pH 8.0 、 100 mmol·L-1的硼酸缓冲液 (内含 1.5%
SDS)充分研磨 , 其汁液为待测材料 , 采用常规奥氏琼脂糖双扩散法 , 平板中加入 0.15%
SDS 。
免疫电镜试验:将待测样品用 pH 8.0 、 100 mmol·L-1的硼酸缓冲液充分研磨 , 5 000
r/ min离心后 , 取上清液备用 , 采用吸附装饰结合法〔1〕进行免疫电镜制样。
鸢尾重花叶病毒(ISMV)、鸢尾轻花叶病毒(IMMV)、水仙潜隐病毒(N LV)抗血清
及 3种病毒阳性对照鸢尾植物和健康鸢尾植物均由 Derks博士(Bulb Research Centre , The
Netherlands)提供 。
1.2 茎尖组培脱毒及试管成球
在本所试验地采集周径为 8 ～ 10 cm的White Cloud品种的带毒鸢尾球茎 , 放置在室温
下使其萌发 , 当中心芽端长出 0.5 ～ 1.0 cm 时 , 剥去球茎外表皮 , 经常规方法消毒后 , 去
除外部鳞片 , 将芽连同基盘一起切下 , 解剖镜下剥取长约 0.3 ～ 0.5 、 0.5 ～ 1.0 、 1.0 ～ 1.5
mm的茎尖分别在诱导成芽 、芽成球及小球生根的系列培养基上培养 , 最后将生根小球移
栽到温室中生长〔2〕 。
1.3 试管苗的病毒检测
将White Cloud 品种茎尖组培的试管苗 、成球苗及移栽小苗的叶片加入 pH 8.0 、
100 mmol·L -1硼酸缓冲液 , 经研磨后 5 000 r/ min离心 , 上清液为待测样品 。
电镜检测按常规方法进行 , 用 2%磷钨酸负染 , 置H-300型电镜下观察。
血清学测定采用琼脂糖双扩散法(方法同前)和间接酶联免疫吸附测定法 , 第二抗体
为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白 , 底物为邻苯二胺 , 置 490 nm 处测OD值 , 每
次测定都设空白 、阴性和阳性对照 , OD值比阳性对照高 2倍以上者判断为阳性反应 。
2 结果与分析
2.1 病毒病调查和病毒种类鉴定结果
2.1.1 植株发病情况 在各试验点随机取样 , 对球根鸢尾植物叶片上表现花叶 、褪绿 、斑
驳等典型病毒病引起的症状植株进行统计 , 调查结果见表 1。各鸢尾种植地的不同品种均
受到不同程度的病毒感染 。调查中发现 , 由于上海市青东农场的鸢尾种球已种植了 5年之
久 , 有病毒病典型症状的样品数比其它各点从国外新引进的种球高得多 , Blue Star , Blue
M agic , Apollo , White Bridge等品种几乎 100%被病毒感染 。
表 1 田间球根鸢尾病毒病症状发生率
Table 1 Virus infection rates of bulbous iris plants under field conditions
品 种
Varieties
调 查
株 数
No.of
samples
发病株数
No.of samples
show ing virus
symptoms
病株率
S amples
show ing virus
symptom s(%)
Apollo 83 25 30.12
Blue Diamond 40 26 65.00
Blue Magic 68 13 19.12
Blue Sail 48 25 52.08
Blue Star 260 198 76.15
C row n Jewel 71 13 18.31
Golden Harvest 77 3 3.90
Hildegarde 80 24 30.00
Ideal 73 33 45.21
品 种
Variet ies
调 查
株 数
No.of
samples
发病株数
No.of samples
show ing virus
symptoms
病株率
Sam ples
showing vi rus
symptoms(%)
Paris 57 5 8.77
Prof.Blaauw 73 57 78.08
Royal Yellow 42 23 54.76
Saturnus 63 4 6.35
Tels tar 58 28 48.28
White Bridge 74 34 45.95
WhiteWedgw od 61 33 54.10
White Cloud 77 20 25.97
2.1.2 免疫双扩散试验结果 取各试验点
不同鸢尾品种具明显病毒病症状的病叶样
品 59份 , 通过免疫扩散实验检测 , 结果见
表2 。在双扩散实验中 , 经常可以看到同一
样品分别与 ISMV , IMMV , NLV 3种抗血
清均有反应。
2.1.3 免疫电镜观察结果 经免疫双扩散
测定为阳性反应的植株叶片 ,通过免疫电
表 2 免疫双扩散检测鸢尾病毒的发生率
Table 2 Virus identi fication by immuno-diffusion test in iris
病毒抗血
清种类
Antisera
测试样
品总数
No.of
samples
tested
有病毒
样品数
No.of
samples
infected
百分率
Infection
(%)
ISM V ant iserum 59 10 16.95
IMMV ant iserum 59 31 52.54
NLV antiserum 59 38 64.41
176 园 艺 学 报 25 卷
镜观察 , 可以看到同一样品中不同的病毒粒体分别能被 Derks博士提供的 ISMV 、 IMMV 、
N LV 抗血清均一包被 。
以上试验初步证明上海市引种的球根鸢尾普遍受到 ISMV 、IMMV 、NLV 3种病毒的复
合侵染〔5 ～ 7〕。
2.2 茎尖组培脱毒及试管成球
2.2.1 茎尖诱导成芽 通过多次试验 , 得出茎尖诱导成芽的最适培养基为 M 1 , 成分为改
良的 MS+NAA 0.2 mg/ L+6-BA 3 mg/ L+蔗糖 3%+琼脂 0.8%, pH 5.8 , 培养温度
(25±2)℃, 光照度 1 000 ～ 2 000 lx , 12 h/ d。当茎尖接种到 M1 上 30 ～ 40 d后 , 茎尖基
部开始膨大 , 并陆续分化出许多不定芽 , 每2周循环培养一次 , 3个月后可形成约 30个芽。
在此基础上可迅速进行扩大繁殖 , 形成一定的生产规模。
2.2.2 试管成球 将 M1 上所得的芽接种在 M2 上 , M 2的成分为蔗糖 6%, 不加 NAA 和
6-BA , 余同 M1 , 培养条件同上。30d后可见芽的基部开始膨大形成小鳞茎 , 其周径最大
可达 2 cm , 大鳞茎周围还会产生小鳞茎。
2.2.3 小球生根 将小球移置在M3 上 , M3 为MS+NAA 0.1 mg/ L , 经过 20 d培养 , 小
球即可生根。
2.2.4 生根小球移栽 将培养瓶去盖后置室温下放置 2 ～ 3 d , 用镊子将生根小球小心取
出 , 洗去培养基 , 移入龙糠灰∶蛭石∶珍珠岩为 1∶1∶3的苗床上 , 用遮荫网 (遮光率 70%)
遮荫 , 2周后逐步去除遮荫网 , 使生根小球逐渐适应外界自然条件。移栽成活率为 90%。
2.3 试管苗的病毒检测
2.3.1 不同检测方法的比较 琼脂糖双扩散法 、电镜检测及间接酶联免疫法检测病毒时
样品稀释度分别为 10-2 、 10-3和 10-4 , 在组培苗小苗期 , 由于病毒含量较低 , 用双扩散法
有时不能检出病毒 , 用电镜检测和间接酶联免疫法检测取得了较好的结果 。当试管苗成球
并生根移植到苗床栽培时 , 通过肉眼观察结合双扩散法检测 , 操作方便 , 不需要专门仪器
设备 。
2.3.2 试管苗的脱毒鉴定 采用上述 3种检测手段对不同茎尖长度的组培苗进行鉴定 ,
结果表明 , 以长度为 1.0 mm 以下的茎尖诱导成苗的植株不带有上述 3种病毒 , 而茎尖长
度超过 1.0 mm 时 , 组培苗往往容易检测到上述 3 种病毒粒体 。外植体茎尖长度小于
0.5 mm时容易枯死 , 大于0.5 mm容易诱导形成小芽。因此 , 我们认为茎尖长度为 0.5 ～
1.0 mm比较合适脱毒培养。
3 讨论
鸢尾重花叶病毒 、鸢尾轻花叶病毒 、水仙潜隐病毒复合侵染球根鸢尾 , 所造成的危害
比任何一种病毒单独侵染造成的危害严重得多 。因此 , 在引种鸢尾球茎时 , 应加强病毒的
检测和检疫 , 防止大量引种时病毒在国内大面积扩散 。
球根鸢尾多采用无性繁殖 , 病毒容易积累 , 而目前我国球根鸢尾全部由荷兰进口。因
此 , 对球根鸢尾进行脱毒培养 , 快速繁殖 , 为短期内培养大量优质种球提供了可能途径 ,
这样 , 既可以达到种球复壮 , 又可以解决种球当地生产的问题。
茎尖组培苗在不同的生长期间病毒的积累程度不同 , 另外 , 组培苗在移栽到苗床后随
1772 期 袁梅芳等:球根鸢尾的病毒鉴定及试管脱毒成球技术
时会发生病毒再侵染 , 因此 , 组培苗的病毒检测应在不同生长阶段多次进行 , 在检测方法
上 , 为了消除各种方法的误差 , 应采取几种方法同时进行 , 才能保证脱毒苗真正无毒。
参 考 文 献
1 孟 清 , 解 峰 , 张鹤龄.制备免疫吸附电镜检测甘薯羽状斑驳病毒样品.植物病理学报.1995 , 25(3):270
2 Anderson W C , Miller P N , Mielke K A , et al.In vit ro Bulblet propagation of vi rus-f ree Dutch iris.Acta Horticulturae ,
1990 , 266:77～ 81
3 赵祥云 , 程 廉 , 邢尤美 , 等.百合珠芽组培及脱毒研究.园艺学报 , 1993 , 20(3):284～ 288
4 宋荣浩 , 袁贤溶 , 顾红卫.香石竹组培苗病毒检测.上海农学院学报 , 1995 , 13(增):65～ 68
5 Brunt A A , Derk s A F L M , Barnet t O W.Iris severe mosaic vi rus.C.M.I./ A.A.B.Descriptions of plant vi ruses ,
1988 , 338
6 Brunt A A.Iris mi ld mosaic virus.C.M.I../ A.A.B.Descriptions of plant viruses , 1986 , 324
7 Brunt A A.Narcissus latent vi rus.C.M.I./ A.A.B.Descriptions of plant vi ruses , 1976 , 170
The Preliminary Identification of Viruses and Virus -free Bulbs
Formation of Bulbous Iris in Vitro
Yuan Meifang , Yang Jianying , and Wu Baoping
(Shanghai Landscape Gardening Research Institute , Shanghai 200232)
Abstract Virus infection of iris under field conditions w as investigated in Shanghai.
Based on the serological determination by Ouchterlony Double-dif fusion test and microscopy ,
the i ris severe mosaic , i ris mild mosaic and narcissus latent virus w ere preliminary identified in
the same leaves of iris plants , which developed severe mosaic symptoms.The virus-f ree bul-
bous iris w ere obtained successfully by meristem-t ip cultures in vit ro.According to virus de-
tection tests at different stages of tissue culture , the 3 viruses were eliminated f rom infected
bulbous iris meristem-tips w ith the leng th of 1.0mm or less.
Key words Bulbous i ris;Virus identification;Virus-free bulbs;Tissue culture
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