全 文 ：迟熟蕉柑茎尖嫁接及其病毒鉴定
王明召　区善汉　娄兵海　刘升球　梅正敏　陈贵峰　麦适秋　陈宜超　莫健生
(广西柑桔研究所 ,广西 桂林 541004)
摘　要: 采用田间结果树上的芽作为接穗进行茎尖嫁接 ,最终获得 7株茎尖嫁接苗。 对所获得的茎尖
嫁接苗 ,应用指示植物腊斯克枳橙、墨西哥来檬和伊特洛格香橼亚利桑那 861- S- 1分别鉴定柑橘碎
叶病、衰退病和裂皮病 ,用 PCR检测技术鉴定柑桔黄龙病。结果表明: 1、 3、 4、 5、 6号迟熟蕉柑单株不带
碎叶病、衰退病、裂皮病和黄龙病 ,可用作繁殖无病毒苗木的备选材料。
关键词: 迟熟蕉柑 ;茎尖嫁接 ;病毒鉴定
　　迟熟蕉柑 (暂定名 )是近年选育的特迟熟柑桔优
良单株。主要特性是果实晚熟、高产稳产、品质较好。
该品种树冠圆头形 ,果圆球形 ,皮橙黄色 ,尚易剥离 ;
单果重 102～ 146 g;果肉柔软多汁 ,化渣 ,味甜 ,可溶
性固形物 9. 0% ～ 12% ,种子 2～ 10粒。在桂林果实
着色期为 12月下旬 ,成熟期为 3月上旬～ 4月下旬 ,
可留树挂至 5月 ,果实耐贮运。但在适栽区 ,柑桔黄龙
病较为严重 ,碎叶病、衰退病、裂皮病也时有发生 ,为
了获得无病毒单株 ,为该品种的推广应用提供无病毒
接穗和苗木 ,笔者于 2006～ 2009年进行了本试验研
究。
1　材料与方法
1. 1　茎尖嫁接
砧木准备:于嫁接前半个月选用枳或夏橙种子热
处理 ,剥去种皮 ,经消毒处理后 ,在无菌条件下播入灭
菌的试管固体培养基上。播后置于 27℃恒温黑暗条
件下培养。固体培养基为 MS植物细胞培养基加
0. 8%琼脂和 3%白糖。
嫁接:分别于 2006年 6月 1日、 6月 22日和 8月 24
日进行。嫁接前采田间同一结果植株上 1～ 3 cm长的
嫩梢备用。在无菌条件下从试管中取出砧木 ,截顶留
2～ 3 cm长茎段 ,切去根尖留 3～ 5 cm。在放大15倍的
双筒解剖镜下操作 ,在砧木中上部削“△”形切口。另
取准备好的嫩梢用解剖刀将下部叶剥掉 ,切下生长点
连带 2个叶原基的茎尖 ,垂直放入切口中。 将茎尖嫁
接苗放入已灭菌的液体培养基中 ,并置于 27℃的培
养室内培养 ,白天开日光灯增加光照。液体培养基为
M S植物细胞培养基加 3%白糖。
再嫁接:待茎尖嫁接苗长出 2片真叶后 ,将茎尖
嫁接苗再嫁接到盆栽无病的粗壮枳砧木上 ,以加速茎
尖苗的生长。
1. 2　柑桔病毒病和类似病毒病害的鉴定
采用指示植物鉴定方法鉴定柑桔碎叶病、衰退病
和裂皮病 ,应用的指示植物分别是腊斯克枳橙、墨西
哥来檬和伊特洛格香橼亚利桑那 861- S- 1选系 (简
称 861- S- 1香橼 ) ,采用双重芽接法接种 [ 1] ,即在无
病枳砧木上同时嫁接待鉴定植株的皮 (芽 )和指示植
物的芽。2007年 10月接种 ,在砧木上腹接指示植物的
芽片于中间位置 ,上下距离指示植物芽 2 cm处各嫁
接一片 (个 )待鉴定植株的皮 (芽 ) ,每种病接种 10株 ,
另外 ,每种病各设正负对照 6株 ,嫁接接种已知毒源
的指示植物作为正对照 ,单独嫁接指示植物作为负对
照。 2008年 4～ 9月 ,在适宜发病条件下 ,每隔 15～
45 d鉴定 1次 ,连续鉴定 7次 ,认真观察每一株指示植
物的发病情况 ,最后根据指示植物的症状表现确定鉴
定结果。
采用 PCR检测技术鉴定柑桔黄龙病 , 2009年 2
月 3日采样 , 2月 4、 5日提取 DNA, 2月 10日检测。用
改进的 CTAB法提取 DNA。根据李韬等 [2 ]设计的基
于黄龙病 16S rDN A上的巢式 PCR引物 ,对黄龙病病
原 DN A进行扩增。
巢式 PCR外侧引物对为:
P1 ( 5 - TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC
- 3 ) ,
32009年　第 20卷　第 4期　　 　　　　　南　方　园　艺　　　　　　　　　　·试验研究· 　　　
　收稿日期: 2009- 04- 02　　修回日期: 2008- 06- 17
* 广西科技攻关项目 (桂科攻 0424002- 3) ;广西农业重点科技计划项目 ( NK200829)
　作者简介:王明召 ( 1977- ) ,农艺师 ,主要从事柑桔脱毒及病毒鉴定工作。
P2 ( 5 - AGAATTCGACT TAATCCCCACCT
- 3 ) ;
巢式 PCR内侧引物对为:
P3 ( 5 - GCGTTCATGT AGAAGT TGTG -
3 ) ,
P4( 5 - CCT ACAGGTGGCTGACTCAT- 3 )。
巢式 PCR第一轮反应体系为 20μL,成分为:模
板 DNA 1μL, 0. 01 mmol /L引物 P1、 P2各 0. 4μL,
2. 5 mmo l /L dN T Ps 2 μL, 10× buf fer 2 μL,
25 mmol /L Mg Cl2 1. 2μL, 5 U /μL Taq DNA聚合酶
0. 1μL,超纯水 12. 9μL。巢式 PCR第一轮扩增程序
为: 95℃ 5 min; 94℃ 30 s, 53℃ 45 s, 72℃ 45 s, 31
个循环 ; 72℃ 10 min。
将第一轮 PCR的产物稀释 40倍 ,用作第二轮
PCR的模板。巢式 PCR第二轮反应体系为 20μL,成
分为: 模板 DNA 1μL, 0. 01 mmo l /L引物 P3、 P4各
0. 4μL, 2. 5mmo l /L dN TPs 2μL, 10× buf fer 2μL,
25 mmol /L Mg Cl2 1. 2μL, 5U /μL Taq DNA聚合酶
0. 1μL,超纯水 12. 9μL。扩增程序为: 95℃ 5 min; 94
℃ 30 s, 55℃ 45 s, 72℃ 45 s, 35个循环 ; 72℃
10 min。目的特异性扩增片段大小为 400 bp。 1. 5%
琼脂糖凝胶电泳 ,观察结果。
2　结果与分析
2. 1　茎尖嫁接结果
共嫁接 22株苗 ,最终成活 7株迟熟蕉柑茎尖嫁接
苗 ,成活率为 31. 8%。
2. 2　柑桔病毒病和类似病毒病害鉴定
经指示植物鉴定观察 ,碎叶病、衰退病、裂皮病正
对照的指示植物分别表现出各自特征性症状。碎叶病
正对照于第一次鉴定时 ( 4月 21日 )在腊斯克枳橙上
表现叶片缺刻、叶面凹凸不平、出现黄斑 ;衰退病正对
照于第二次鉴定时 ( 5月 7日 )在墨西哥来檬上表现嫩
叶脉明 ;裂皮病正对照于第四次鉴定时 ( 7月 16日 )在
861- S- 1香橼上表现叶片反卷 ,叶脉木栓化。 各病
负对照的指示植物表现正常。用来鉴定 1、 3、 4、 5、 6号
单株的腊斯克枳橙、墨西哥来檬和 861- S- 1香橼表
现正常 ,未表现出正对照症状 ,用以鉴定 2号和 7号单
株的腊斯克枳橙和 861- S- 1香橼表现正常 ,第四次
鉴定时 ( 7月 16日 )墨西哥来檬出现脉明症状。
如图 1,由电泳结果可见 ,迟熟蕉柑 7个单株均未
检测到柑桔黄龙病病原。
图 1　柑桔样品黄龙病 PCR检测结果
注: M: 100bp梯度的 DN A标准分子量 ; 1:水对照 ; 2- 8: 1- 7号迟
熟蕉柑样品 ; 9:负对照 ; 10:正对照
Fig. 1　 PCR detection of huanglong bing for ci trus s amples
Note: lan e M: DN A mark er wi th 100bp ladders; lane 1: w ater
cont rol; lanes 2- 8: ci t rus samples; lane 9: negativ e cont rol; l an e
10: posi tiv e cont rol
3　小结与讨论
本次嫁接最终成活 7株迟熟蕉柑茎尖嫁接苗 ,成
活率为 31. 8% 。由指示植物鉴定和 PCR检测的结果
可知: 1、 3、 4、 5、 6号迟熟蕉柑单株不带碎叶病、衰退
病、裂皮病和黄龙病 ,可用作繁殖无病苗木的备选材
料 ; 2、 7号迟熟蕉柑单株不带碎叶病、裂皮病和黄龙
病 ,但带有衰退病。
宋瑞琳等 [3 ]对带有衰退病的墨西哥来檬、日本甜
橙和雪柑 330进行茎尖嫁接脱毒 ,认为三个品种衰退
病的平均脱除率为 80. 6% 。另据周常勇等 [4 ]报道 ,衰
退病需经热处理才能脱除。 由此可见 ,单纯茎尖嫁接
不能完全脱除柑桔衰退病病毒。本试验中 2、 7号迟熟
蕉柑单株仍带有衰退病 ,可能是因为迟熟蕉柑母树本
身带有衰退病病原 ,茎尖嫁接不能完全脱除该病病毒
所致。
参考文献
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版社 , 2005: 107.
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29( 1): 31- 35.
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究 [ J].植物病理学报 , 1999, 29( 3): 275- 279.
[4 ]　周常勇 ,蒋元晖 ,赵学源 ,等 .柑桔苗木脱毒技术规范
[M ].中国农业出版社 , 2006: 3.
(下转第 8页 )
4 　　　· 试验研究·　　　　　 　　　　　南　方　园　艺　　 　　　　　 2009年　第 20卷　第 4期
受教育体验与娱乐体验。如:玉泉寺景区“杜鹃花海”
景点设计:由玉泉山庄的对面游道 ,经天星湖直到杜
鹃花基地 ,杜鹃花成片 ,形成花海。现花海中的杜鹃花
的密度不大。此处的杜鹃花进行培育 ,增添品种 ,补齐
花色 ,使之更为壮观。地貌景观——栗木桥景区“好汉
崖”景点设计: 在子午石上方有一高 40 m,宽 20 m左
右的山崖 ,坡度在 70度左右 ,坡面光滑 ,有自然形成
的裂痕 ,在干旱季节非常适于攀岩。当然 ,攀登者需要
几分勇气与技巧才能征服此崖 ,故命名为好汉崖 ,既
是形容攀登此崖的困难 ,又是对游客的一种鼓励。
森林公园具备开发森林旅游得天独厚的优势 ,针
对资源特色和优势 ,科学地利用景观资源 ,把资源潜
力发挥出来 ,森林公园亟待科学的景观规划理论指导
开发与布局。通过分析森林公园中人的景观体验感知
方式 ,探讨丰富森林公园中景观体验线索 ,增加景观
价值 ,同时丰富游人体验和增加旅游价值。 在森林旅
游大力推广的今天 ,为森林公园景观规划设计的人性
化研究添砖加瓦。
参考文献
[ 1]　章海棠 . 旅游美学导论 [M ].北京: 清华大学出版社 ,北
京交通大学出版社 , 2006: 131- 133.
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( 4): 20- 23.
[ 3 ]　但新求 . 情景规划与体验设计探讨 - 以雷公山森林公
园规划为例 [ J],中南林业调查规划 , 2005, 24( 3): 35-
39.
[ 4 ]　张华龄 . 散谈森林公园选择优势开发项目和森林公园
及景物命名问题 [C ].森林旅游和森林公园环境保护研
讨会文集 .林业资源管理 (特刊 ) , 1995: 140- 143.
Preliminary Study on Landscape Planning of Forest Park Based on Experience
LI Zhi-qiang , WU Qin-x iang , CHEN Liang-ming
(Central South Univ ersity of Forestry and Technology , Hunan ,Changsha 410004)
Abstract: Through the experience design in fo rest park landscape planning and design, it intended to explore
new way s to rich forest park functional requirements and design elements, and on how to create an
envi ronment to at t ract v isi to rs to experience, the experience design in Forest Pa rk proposed concrete
implementation of the design method, and summed up its cha racteristics o f the design and rela ted principles,
makes fo rest parks feature-rich and diverse, and create a mo re pleasant and a t tractive env ironment.
Key words: Forest park; Landscape planning; Experience
(上接第 4页 )
Shoot-tip Grafting of Late-ripening Tangan( Citrus tankan Tanaka)
and Identification of Virus Diseases
WANG Ming-zhao, O U Shan-han, LOU Bing-hai, LIU Sheng-qiu, M EI Zheng-min,
CHEN Gui-feng , M AI Shi-qiu, CHEN Yi-chao, MO Jian-sheng
(Guangx i Citrus Research Institute , Guangx i , Guilin 541004)
Abstract: Buds f rom g row n trees in field w ere used as cions of shoot-tip g raf ting. , and 7 seedling s were
obtained by the shoot-tip g raf ting tech nique. Rusk ci trange, Mexican lime and Ci t ron 861-S-1 w ere used a s
indica to r plants to identify Ci t rus Tat ter Leaf Virus ( CTLV ) , Ci t rus Tristeza Virus ( CTV ) and Cit rus
Exocorti s Viroid ( CEVd ) , respectively , and PCR technique w as used to detecting Ci t rus Huang longbing
( HLB) on the 7 seedling s. The results w ere follow ing: no pathogen of CTLV, CTV, CEVd and HLB could
be fund from number 1, 3, 4, 5, 6 seedlings of Late-ripening Jiaogan , and can be used fo r vi rus-free
seedling propagation .
Key words: La te-ripening Tangan; Shoo t-tip g raf ting; Identi fica tion of vi rus disea ses
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