全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(9): 1594−1601 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(20112X08004-004-009), 国家自然科学基金项目(31071443)和浙江省科技厅公益
技术项目(2012C32001)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 唐桂香, E-mail: tanggx@zju.edu.cn; 单志慧, E-mail: zhihuijimi@163.com
第一作者联系方式: E-mail: joan@zju.edu.cn
Received(收稿日期): 2012-11-28; Accepted(接受日期): 2013-05-24; Published online(网络出版日期): 2013-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130709.1600.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01594
农杆菌介导的 RNAi CP基因在大豆中的转化
章洁琼 1 李红艳 1 胡小南 1 单志慧 2,* 唐桂香 1,*
1浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310058; 2中国农业科学院油料作物研究所, 湖北武汉 430062
摘 要: 花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一, 生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本
研究以 RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体, Bar基因作为筛选标记基因, 成熟子叶节为外
植体, 采用农杆菌介导法获得了 22株 T0代转基因大豆生根苗, 经草丁膦涂抹、Bar试纸条和 PCR法鉴定, 获得 RNAi
CP转基因植株 18株; 对转基因植株 T1代的遗传分析表明, 外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律;
T1代 Southern杂交表明, 导入的干扰片段为单拷贝; 花叶病毒摩擦接种表明, RNAi CP转基因大豆植株具有抗花叶病
毒特性; 摩擦接种后 3周, DAS-ELISA检测进一步表明, RNAi CP转基因植株花叶病毒检出率仅为 7.69%, 而非转基
因植株为 100%。这表明 RNAi花叶病毒 CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。
关键词: 大豆; RNAi CP; 遗传转化; 大豆花叶病毒; 病毒鉴定
Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation of RNAi CP Gene into
Soybean (Glycine max L.)
ZHANG Jie-Qiong 1, LI Hong-Yan1, HU Xiao-Nan 1, SHAN Zhi-Hui2,*, and TANG Gui-Xiang1,*
1 Institute of Crop Science, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Oil Crops Research Institute,
Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China
Abstract: Soybean mosaic virus (SMV) causes a severe disease in soybean, which can be efficiently prevented by planting resis-
tant cultivars. In order to improve the SMV resistance of soybean, an agrobacterium-tumefaciens mediated gene transformation
was conducted in this study by using RNAi soybean mosaic virus coat protein (CP) gene as the expression vector, bar gene as the
selective marker gene, and cotyledonary-node as the explant to get RNAi transformation soybean. As results, 22 putative trans-
genic soybean plants were obtained and 18 positive transgenic soybean plants were identified by coating with leaves herbicide,
using bar protein quick dip stick and PCR analysis. The segregation ratio of T1 transgenic progeny showed that the transformed
gene could be inherited according to the Mendels law. The T1 southern blot analysis showed that the imported interference frag-
ment was one copy. After SMV friction inoculation, the RNAi CP transgenic soybean plants showed good resistance to SMV.
DAS-ELISA analysis at three weeks after SMV inoculation revealed that 100% of the non-transgenic lines SMV while only
7.69% of the RNAi plants were infected by SMV. The results demonstrated that the RNAi CP transgenic soybean plants obtained
in the study are valuable resources for improving the SMV resistance of soybean.
Keywords: Soybean; RNAi CP; Genetic transformation; Soybean mosaic virus; Virus identification
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)病是
世界范围内普遍发生的病毒病害之一, 1915 年美国
首次报道了该病害。1921 年 Gardner 和 Kendrick[1]
将病原描述为 SMV。在病毒分类学上, 大豆花叶病
毒属马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)成员, 主要通过种
子带毒、蚜虫以非持久性方式以及汁液等方式传播。
大豆花叶病毒病不仅引起大豆植株矮化、叶片皱缩、
花叶、顶枯等症状, 而且造成大豆种粒斑驳, 降低大
豆外观品质, 病田一般减产 10%~30% [2], 严重时大
面积绝产, 给大豆生产造成巨大的经济损失。因此,
第 9期 章洁琼等: 农杆菌介导的 RNAi CP基因在大豆中的转化 1595
大豆花叶病毒引起了国内外科研人员的高度重视并
对其开展了广泛的研究[3-5]。
培育和种植抗病品种是防治大豆花叶病毒病最
经济有效的方法, 但采用回交及杂交系谱法培育抗
SMV 大豆品种需要一个长期的过程。近年来, 随着
RNA干扰(RNAi)——一种抵消转录后调节的内源性
技术的发展, 利用 RNAi 技术创制抗病毒转基因植
株已成为可能[6-7]。Smith等[8]和 Kalantidis等[9]采用
RNAi 方法分别获得烟草和黄瓜抗花叶病毒植株 ;
Missiou 等[10]通过干扰马铃薯 PVY病毒 3′端高度保
守区域片段的方法也获得了抗 PVYN、PVYO 和
PVYNTN 病毒植株。本研究拟利用大豆花叶病毒 CP
基因高度保守片段构建反向重复的 RNAi 载体为表
达载体, 以 Bar 基因作为筛选标记基因, 通过农杆
菌介导大豆子叶节法, 获得 RNAi 抗花叶病毒转基
因大豆, 期望获得免疫或高抗 SMV 的转基因大豆,
为防治大豆花叶病毒提供新种质, 加快大豆抗病毒
育种进程。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大豆转化受体为中国农业科学院油料作物研究
所育成品种天隆 1号; RNAi表达载体 pB7GWIWG2-
CP616 (图1)从比利时根特大学生物技术研究中心购
买 , 由中国农业科学院油料作物研究所构建 [11];
pB7GWIWG2-CP616 载体含有来源于武汉大豆花叶
病毒的 G7株系(AY216010) CP基因的 616 bp保守
片段及膦丝菌素乙酰转移酶基因(Bar); 所用的农杆
菌菌株为 EHA105; 大豆花叶病毒带毒种子(G7 株系)
由上海交通大学曹趆平教授惠赠。
1.2 农杆菌介导大豆子叶节转化体系
参照 Zhang 等[12]和 Paz 等[13]描述的方法, 加以
改进, 利用本实验室前期建立的农杆菌介导大豆子
叶节转化体系介导转化大豆。选择成熟、健康、饱
满的大豆种子经氯气灭菌后, 在通风柜中过夜吹去
多余的氯气 ; 播种在发芽培养基 (germination me-
dium, GM)中发芽 1 d; 然后分离大豆子叶节为外植
体, 经OD650值为 0.8左右的农杆菌菌液侵染 30 min,
在共培养基(co-cultivation medium, CCM)光照培养 3
d; 之后在芽诱导培养基(shoot induction medium, SI)
中诱导培养 4周, 每 2周更换新鲜的培养基; 将外植
体转入芽伸长培养基(shoot elongation medium, SE)
上诱导芽的再生 ; 芽伸长后再转入生根培养基
(rooting medium, RM)中诱导生根; 生根后先在培养
室中驯化 10 d, 待苗成活后移入温室中生长, 约 80
d 获得转基因生根苗。大豆转化过程所用培养基配
方见表 1。
1.3 转基因植株的鉴定
1.3.1 除草剂抗性鉴定 将商用草丁膦原液稀释
为 135 mg L–1, 以主叶脉为分界线用棉签蘸该液擦
拭半片叶子, 标记未涂的半片叶子, 温室中培养 1
周后观察叶片对除草剂的反应。
1.3.2 Bar 试纸条检测 取约半个指甲大小叶片
放入 1.5 mL 离心管中, 用研磨棒将叶片研碎, 加入
0.3 mL提取液, 搅拌均匀, 将购自 Envirologix公司
的 Quickstix Kit for Liberty Link (bar) Cotton Leaf &
Seed 快速检测 Bar 蛋白质的试纸条按标识的方向插
入混合液中, 5 min后观察结果。试纸条出现 2条带
为阳性植株, 出现 1 条带为阴性植株, 没有条带出
现表明操作有误。
1.3.3 PCR 鉴定法 根据 Edward 等[14]介绍的方
法快速提取大豆基因组 DNA 用于 PCR 检测。采用
20 μL的 PCR反应体系, 引物由 TaKaRa公司合成。
Bar 基因引物 F 序列为 5′-CAGCTGCCAGAAACCC
ACGT-3′, R为 5′-CTGCACCATCGTCAACCACT-3′,
目的扩增片段为 436 bp, 扩增条件为 94℃ 5 min; 94
℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 20 s, 30个循环, 72℃ 10
min; CP基因引物 F为 5′-TTTGCTGAACTTGGTCT
CCA-3′; R 为 5′-TGATCTTCCCTTCAACCATT-3′,
目的扩增片段为 616 bp, 扩增条件为 94℃ 5 min;
图 1 pB7GWIWG2-CP616重组表达载体
Fig. 1 Recombination expression vector of pB7GWIWG2-CP616
1596 作 物 学 报 第 39卷
表 1 农杆菌介导大豆子叶节转化法培养基配方
Table 1 Media composition of soybean cotyledonary-node Agrobacterium-mediated transformation
培养基
Medium
配方
Recipe
GM B5+20 g L–1蔗糖+3 g L–1琼脂, pH 5.8
B5+20 g L–1 sucrose+3 g L–1 Agar, pH 5.8
CCM 1/10 B5 +30 g L–1蔗糖+3.9 g L–1 MES+1.67 mg L–1 BAP+0.25 mg L–1 GA3+200 μmol L–1乙酰丁香酮, pH 5.6
(CCM固体培养基需加入 4.5 g L–1琼脂)
1/10 B5 +30 g L–1 sucrose +3.9 g L–1 MES+1.67 mg L–1 BAP+0.25 mg L–1 GA3+200 μmol L–1 acetosyringone, pH
5.6 (CCM solid culture medium supplemented with 4.5 g L–1 agar)
SI B5+30 g L–1蔗糖+0.59 g L–1MES+8 g L–1琼脂+1.67 mg L–1 BAP+250 mg L–1替卡西林+100 mg L–1头孢霉素+5
mg L–1草丁膦, pH 5.7
B5+30 g L–1 sucrose+0.59 g L–1 MES+8 g L–1 agar+1.67 mg L–1 BAP+250 mg L–1 ticarcillin+100 mg L–1 cefo-
taxime+5 mg L–1 glufosinate, pH 5.7
SE MS+30 g L–1蔗糖+0.59 g L–1MES+8 g L–1琼脂+1 mg L–1ZR+0.1 mg L–1IAA+0.5 mg L–1 GA3+50 mg L–1谷氨酸
+50 mg L–1 天冬氨酸+5 mg L–1草丁膦; pH 5.7
MS+30 g L–1 sucrose+0.59 g L–1 MES+8 g L–1 agar+1 mg L–1ZR+0.1 mg L–1 IAA+0.5 mg L–1 GA3+50 mg L–1
glutamic acid+50 mg L–1 aspartate acid+5 mg L–1 glufosinate; pH 5.7
RM MS+20 g L–1蔗糖+0.59 g L–1 MES +3 g L–1琼脂+1 mg L–1 IBA, pH 5.8
MS+20 g L–1 sucrose+0.59 g L–1 MES +3 g L–1 agar+1 mg L–1 IBA, pH 5.8
94℃ 30 s, 54℃ 45 s, 72℃ 1 min, 30个循环, 72℃
10 min。以 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.4 RNAi CP转基因大豆 T1代遗传分析
对 T1代转基因大豆分别进行除草剂涂抺和 Bar
试纸条鉴定, 分析 T1 代转基因大豆的分离比例, 采
用 SPSS11.0软件对各株系进行卡方测验。
1.5 转基因植株的 Southern blot鉴定
参照改良的 CTAB 法提取转基因植株叶片的
DNA[15], 用 EcoR I消化转基因大豆基因组DNA, 电
泳后转膜, 按照 Roche公司的 DIG High Primer La-
beling and Detection Starter Kit II说明书固定、标记、
杂交和检测。
1.6 转基因大豆 T1 代植株花叶病毒摩擦接种抗
性鉴定
播种带毒(大豆花叶病毒 G7 株系)的大豆种子,
取新鲜三叶期病叶, 用 0.01 mol L–1, pH 7.0的磷酸
缓冲液研磨病叶, 1 g叶片需用 10 mL缓冲液。接种
液中放入少量的 600 目金刚沙, 于单叶期将 2 片单
叶用浸过接种液的棉棒摩擦接种 , 之后用水冲洗 ,
接种后 3 周观察大豆花叶病毒症状, 植株生长环境
温度需保持在 20~30℃ [16]。
1.7 大豆花叶病毒的 DAS-ELISA检测
大豆花叶病毒摩擦接种后 3周参照ACD公司的
DAS-ELISA 试剂盒说明书进行 DAS-ELISA 检测,
测定各株系叶片 405 nm的 OD值(P)及阴性对照 OD
值(N), 以其比值 P/N>2视为感花叶病毒。
2 结果与分析
2.1 农杆菌介导法获得 RNAi CP 转基因大豆植
株
室在前期大豆农杆菌介导转化体系优化基础上,
从国内外 25个基因型中筛选到适宜转化的受体天隆
1号。以天隆 1号为受体, 采用农杆菌介导大豆子叶
节转化体系 , 分别自命名为 SMV-1、SMV-2 和
SMV-3 的 3 批次试验(表 2)中转化了 186、91、105
个外植体, 分别获得 7、6和 9株 T0代 RNAi CP转
基因大豆生根苗。
分别采用草丁膦涂抹法、BAR 试纸条法、PCR
法鉴定 22 株 T0代转基因大豆生根苗。由图 2 可知,
叶片经 135 mg L–1草丁瞵涂抹半片叶后, 22株 T0代
植株中, 4号、11号、12号、14号植株表现涂草丁
膦的左半张叶片变黄而呈现枯萎状, 而未涂草丁膦
的右半张叶片仍保持绿色状; 剩下的 18株T0代植株
表现涂与不涂草丁膦的两个半叶没有明显差异, 说
明草丁膦选择标记基因 Bar已被转入这 18株大豆植
株中, 叶片表现草丁膦抗性。
Bar试纸条结果如图 3所示, T0代转基因大豆植
株 4号、11号、12号、14号株系的测试线(test line)
不显现红色, 表明这几个株系中不含有筛选标记基
因表达的 Bar蛋白, 为阴性植株; 剩下的 18株 T0代
转基因植株的对照线和测试线均显现红色, 表明均
为阳性植株。
第 9期 章洁琼等: 农杆菌介导的 RNAi CP基因在大豆中的转化 1597
图 2 T0代转基因大豆植株草丁膦涂抹鉴定结果图
Fig. 2 Detection of T0 putative transgenic soybean plants by coating half leaves with herbicide
CK: 不含重组质粒转化得到的大豆植株叶片; 1~22表示 T0代转基因大豆植株叶片。
CK: negative control; 1–22: T0 putative transgenic soybean plants.
图 3 T0代转基因大豆植株 bar试纸条鉴定结果图
Fig. 3 Detection of T0 putative transgenic soybean plants by bar protein quick dip stick
1~22表示 T0代转基因大豆植株叶片。
1–22: T0 putative transgenic soybean plants.
T0代转基因植株 Bar 基因(图 4-A)和干扰片段
CP 基因(图 4-B)的 PCR 产物电泳结果图均一致表
明, 编号为 4 号、11 号、12 号和 14 号的 T0代转
基因株系没有扩增出目的片段, 为阴性植株, 剩余
的 18 株 T0代株系均有 436 bp 的 Bar 基因目的片
段和 616 bp的 CP基因目的扩增片段, 为阳性转基
因植株。
3种检测结果一致表明, SMV-1、SMV-2和 SMV-3
批次试验中分别获得了 6 株、5 株和 7 株阳性转化
植株, 即共获得 18株 T0代 RNAi CP基因阳性转化
植株。SMV-1、SMV-2和 SMV-3批次的转化效率分
别为 3.22%、5.49%和 6.67%, 平均转化效率为 5.13%
(表 2)。
2.2 转基因植株 Southern blot鉴定结果
以质粒 pB7GWIWG2-CP616 为模板, CP-F 和
CP-R为引物 PCR扩增出约 616 bp的 CP基因片段,
经琼脂糖电泳回收目的片段, 采用随机引物法标记
CP 探针。随机选取 6 株 PCR 结果为阳性的 T1代
RNAi CP转基因大豆植株, pB7GWIWG2-CP616质
粒 DNA 为正对照 , 以非转基因大豆植株基因组
DNA为负对照, 进行 Southern杂交分析, 图 5表明,
CP 干扰片段均已转入转基因大豆植株的基因组
DNA 中, 且均为单拷贝, 说明 CP 干扰片段可在转
基因大豆植株后代中稳定遗传。
1598 作 物 学 报 第 39卷
图 4 T0代转基因大豆植株 PCR鉴定结果图
Fig. 4 Detection of T0 putative transgenic soybean plants by PCR
A: Bar基因; B: CP基因; M: Marker DL2000; +: pb7gwiwg2-CP616质粒 DNA; –: 不含重组质粒转化得到的大豆植株叶片 DNA;
1~22: T0代转基因大豆植株叶片。
A: Bar gene; B: CP gene; M: marker DL2000; +: positive control; –: negative control; 1–22: T0 putative transgenic soybean plants.
表 2 大豆农杆菌介导转化 RNAi CP基因效率
Table 2 Agrobacterium-tumefaciens mediated transformation efficiency of RNAi CP gene in soybean
转化批次
Transformation batch
外植体数
Number of
explants
生根苗
Number of rooting
plants
阳性植株
Number of positive
transformants
转化效率
Transformation efficiency
(%)
SMV-1 186 7 6 3.22
SMV-2 91 6 5 5.49
SMV-3 105 9 7 6.67
合计 Total 382 22 18 5.13
图 5 T1代转基因植株 Southern blot结果图
Fig. 5 Southern blot analysis of positive T1 generation trans-
genic soybean
–: 不含重组质粒转化得到的大豆植株; +: pB7GWIWG2-CP616
质粒 DNA; 2-11、2-15、2-26、2-30、2-32、3-5为 T1代阳性转基
因植株。
–: negative control; +: positive control; 2-11, 2-15, 2-26, 2-30, 2-32,
and 3-5: transformed plants of T1 generation soybean.
2.2 RNAi CP转基因大豆遗传分析
18 株 T0代 RNAi CP 转基因大豆株系在温室条
件下生长, 经自花授粉后, 收获 T1代种子。其中 18
号的 T0 代株系表现不育性, 不能结实, 最终共获得
17 个 T0代 RNAi CP 转基因大豆株系的种子, 这些
T0代转基因大豆株系的种子数最少的为 1 粒, 最多
的为 35 粒(表 3); 播种各 T0代转基因大豆株系的这
些种子, 发芽生长以获得 T1代植株, 其中 T0代编号
为 5 号和 10 号的株系均只收获了 1 粒种子, 且这 2
个株系的种子播种后均不能正常发芽, 无法获得 T1
代植株; 剩余的 15个T0代株系的种子播种后均可正
常发芽。由表 3可知, 15个 T0代 RNAi CP转基因大
豆株系中, 5 个(编号为 7 号、8 号、15 号、19 号、
20 号)在 T1 代表现沉默, 转入的目标片段不能遗传
到下一代; 剩余的 10个(编号为 1号、2号、3号、6
号、9号、13号、16号、17号、21号、22号)转入
的基因片段能在 T1代遗传, RNAi CP转基因大豆 T1
代的遗传率为 66.67%。稳定遗传的 10个株系中, 有
4个(编号为 6号、9号、21号、22号)在后代没有分
离, 这可能与这几个后代本身结种子的粒数较少有
关; 剩余 6个后代均分离, 卡方测验表明除 17号外,
1 号、2 号、3 号、13 号、16 号 T0代转基因株系在
第 9期 章洁琼等: 农杆菌介导的 RNAi CP基因在大豆中的转化 1599
T1代的分离均符合孟德尔 1对基因遗传规律。
2.3 RNAi CP转基因大豆花叶病毒抗性鉴定
接种花叶病毒后, 非转基因大豆植株出现了花
叶、叶脉褐化, 叶片皱缩等症状(图 6-A), 大部分 T1
代 RNAi CP转基因植株叶片仍保持鲜绿状, 小部分
植株的叶片出现了轻微的花叶症状, 但无皱缩症状
出现(图 6-B), 与对照材料相比, 各转化材料 SMV
抗病性显著提高, 这表明 RNAi CP转基因植株对大
豆花叶病毒产生了一定的耐受性, 可对 SMV免疫或
延迟发病。
表 3 T1代转基因大豆后代的分离
Table 3 Segregation ratio of T1 transgenic RNAi CP soybean plant
转基因株系
Transgenic line
T1阳性株数
T1 positive plant
T1代阴性株数
T1 negative plant
分离比例
Ratio of P:N
卡方值
χ2-value
P值
P-value
1 1 1 1:1 0.667 0.414
2 23 12 2:1 1.610 0.205
3 6 3 2:1 0.333 0.564
13 3 2 3: 2 0.600 0.439
16 3 1 3: 1 0.000 1.000
17 1 3 1: 3 5.333 0.021
6 3 0 3:0
9 2 0 2:0
21 1 0 1:0
22 1 0 1:0
7 0 10 0:10
8 0 11 0:11
15 0 1 0:01
19 0 8 0:08
20 0 2 0:02
P值大于 0.05表示符合孟德尔 1对基因的遗传规律。
All P-values indicated significance fit to Mendel’s law of inheritance for one gene (P>0.05).
图 6 SMV接种后植株抗病性比较
Fig. 6 Comparison of SMV resistance
A: 非转基因植株叶片; B: T2代转基因植株叶片。
A: leaves of non-transgenic soybean plant;
B: leaves of transgenic soybean T2 plant.
进一步的 DAS-ELISA 检测结果表明(表 4), 转
基因大豆植株 OD405 值明显低于非转基因植株, 将
反应孔 OD 值 (P)与阴性对照孔 OD 值 (N)比值
(P/N)>2作为感花叶病毒植株的判断标准, 结果显示
非转基因大豆植株 P/N 值均大于 2, SMV 检出率为
100%; 而 T1代转基因植株中, 只有 1个样品 P/N值
大于 2, SMV检出率仅为 7.69%, 表明 RNAi CP转基
因大豆植株对花叶病毒产生了抗性。
3 讨论
研究表明, 大豆花叶病毒在自然条件下有变异
性, 抗病资源的抗性具有明显的株系特异性, 寄主
的抗性因病毒株系的变异而丧失, 因此, 迫切需要
培育广谱、抗性持久的大豆抗花叶病毒病品种[11]。
RNAi 技术利用病毒本身的基因导入植物, 从而获
得抗病毒植株, 为抗病毒育种提供了新的策略和方
法, 具有高度的可行性, 人们将水稻黄斑病毒(Rice
yellow mottle virus, RYMV)复制所必需的某种酶基
因导入水稻, 通过诱导 RNA 干扰, 已培育出具有
RYMV 抗性的水稻, 并已稳定遗传 3 代[17]。Abbott
等[18]以大麦黄矮病毒 PAV株系(Barley yellow dwarf
viruses-PAV, BYDV-PAV)的多聚酶基因反向重复序
1600 作 物 学 报 第 39卷
列载体转化大麦, 获得 PAV 免疫植株, 以 ELISA 检
测和田间接种均未检测到病毒。转病毒外壳蛋白 CP
基因是研究最早、应用最广泛的抗病毒手段 , Ha-
yakawa 等 [19]和燕义唐等 [20]将条纹叶枯病毒 (Rice
stripe virus, RSV)的 CP基因分别导入粳稻和籼稻中,
发现表达 CP 基因的转基因水稻植株对 RSV 的侵
染具一定抗性。朱俊华等[21]用马铃薯坏死病毒衣壳
蛋白基因片段构建反向重复载体, 获得的抗病植株
比例大大高于用正向重复载体转化获得的抗病植株
比例。
表 4 以 DAS-ELISA检测大豆非转基因和 RNAiCP植株的花叶病抗性
Table 4 Detection of soybean mosaic virus in both non-transgenic and RNAi CP plants by DAS-ELISA
非 RNAi CP 植株 Non RNAi CP transgenic plant RNAi CP植株 RNAi CP transgenic plant
OD405nm (P) P/N OD405nm (P) P/N
0.782 3.93(+) 0.166 0.83(–)
1.222 6.14(+) 0.282 1.42(–)
1.779 8.94(+) 0.346 1.74(–)
0.511 2.57(+) 0.336 1.69(–)
0.569 2.86(+) 0.323 1.62(–)
0.480 2.41(+) 0.375 1.88(–)
0.505 2.54(+) 0.306 1.54(–)
0.865 4.35(+) 0.260 1.30(–)
0.520 2.61(+) 0.484 2.43(+)
0.570 2.86(+) 0.302 1.52(–)
0.617 3.10(+) 0.235 1.18(–)
0.802 4.03(+) 0.216 1.09(–)
1.477 7.42(+) 0.272 1.37(–)
N: 阴性对照, 其 OD405nm值为 0.199; +: 阳性; –: 阴性。N: OD405nm is 0.199 in negative control ; +: positive; –: negative.
在本研究中, 我们利用大豆花叶病毒 CP 基因
的高度保守片段构建成反向重复的 RNAi 植物表达
载体, 选择 CP基因高度保守片段, 能避免病毒因非
保守区的高突变率而产生的抗性突变株; 另外, 获
得的转基因植株不含抗生素基因, 以除草剂 bar 基
因作为选择标记基因, 生物安全性高, 后期可采用
草丁膦喷施法对大田中的转基因植株进行大规模的
筛选, 操作简单且成本低, 极大方便了转基因植株
的后续鉴定及育种工作。本研究获得的转基因材料
经大豆花叶病毒接种鉴定表明, 转基因植株对大豆
花叶病毒具有一定抗性, 但不同转化材料对大豆花
叶病毒的耐受性表现不同。今后需进一步研究这些
转化材料后代对不同大豆花叶病毒株系以及与
SMV 同源性较高的其他病毒的抗性表现, 从而选择
出具有病毒广谱抗性的大豆新种质。
基于 RNA 干扰原理获得的转基因植株的抗病
性可遗传到后代, 但会在后代中出现分离现象, 该
现象很复杂, 可能与转基因的拷贝数及整合方式有
关[22]。本研究表明, 部分 T0代 RNAi CP转化株系在
T1代沉默, 转化片段不能遗传到后代; 部分 T0代株
系在 T1代的分离比符合孟德尔 1对显性基因遗传规
律, 据此可知转化片段在 T1 代已稳定遗传, 但其遗
传稳定性有待进一步研究。
4 结论
采用农杆菌介导的大豆转化体系, 将反向重复
的 CP基因导入大豆基因组, 获得了 RNAi CP转基
因植株 , 接种鉴定表明具抗大豆花叶病毒的特性 ,
为培育抗 SMV大豆新种质、丰富抗病遗传材料奠定
了基础。
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