全 文 ：蒲葵子多糖含量测定及其抗氧化活性研究
陈　艳1 , 姚　宏2 , 李少光2 , 林新华2
摘要:　目的　测定蒲葵子多糖的含量 , 并探讨其体外抗氧化活性。 　方法　采用热水提取法提取蒲葵子粗
多糖 LCP , 经纯化得到总多糖 LCP1和精制多糖 LCP2 。经苯酚-硫酸显色后 , 在 490 nm 处进行比色测定总多糖
LCP1含量;采用分光光度法检测多糖 LCP2对自由基· OH 、O-2 · 、DDPH·的清除作用。　结果　总多糖 LCP1含
量为 51.94%(RSD 1.39%, n=3)。 1.0 mg/m L LCP2在体外对· OH 、O-2 · 、DDPH · 的清除率分别为66.31%、
60.11%、92.9%, 且其清除能力与浓度有明显的量效关系。 　结论　采用苯酚-硫酸法测定蒲葵子多糖的含量简
便 、快速 、准确 、灵敏度好。蒲葵子多糖具有较好的体外抗氧化活性 ,可作为天然抗氧剂应用于传统医药中。
关键词:　蒲葵子;抗肿瘤药(中药);中草药;多糖类;自由基清除剂;抗氧化剂
中图分类号:　R282.71;R284.1;R979.1;R931　　文献标识码:　A　　文章编号:　1672-4194(2011)03-0164-04
收稿日期:2011-02-25
基金项目:福建省卫生厅科研基金(2008-1-20);福建省教育厅科研
基金(JA07101);福建省自然科学基金(2009J01157)
作者单位:福建医科大学药学院 1.药物化学系;2.药物分析系 ,福
州　350004
作者简介:陈　艳(1980-),女,讲师 ,福建医科大学 2007级博士研
究生
通讯作者:姚　宏 , Email:yauhung@126.com
　　多糖作为来自高等植物 、动物细胞膜 、微生物
细胞壁中的天然大分子 ,是构成生命的基本物质之
一 ,具有多种生物活性 ,如抗肿瘤 、抗炎 、抗病毒 、降
血糖 、抗衰老 、免疫调节等[ 1-3] ,而这些生物活性与其
抗氧化活性密切相关。生物免疫系统需要适量的
自由基来抵抗细菌和病毒 ,但自由基过量却是有害
的[ 4] 。在预防和治疗与自由基有关的疾病中 ,大量
来源于植物的抗氧化剂起着非常重要的作用 。近
年来 ,国内外越来越关注蒲葵子的研究报道[ 5-6] 。本
课题组曾对蒲葵子体外抗癌活性部位进行了筛
选[ 7] ,并首次从中提取出水溶性多糖。本研究采用
硫酸苯酚法测定蒲葵子多糖的含量 ,考查其对羟基
自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O -2 ·)、DPPH
自由基(DPPH ·)的清除能力 ,并对其抗氧化活性
进行筛选 ,以期为蒲葵子多糖的进一步开发利用提
供理论依据。
1　材料和方法
1.1　仪器与试剂　紫外分光光度计(UV-2450 ,日
本岛津公司),KQ-250DE型医用数控超声波清洗器
(昆山市超声仪器有限公司),电热恒温鼓风干燥箱
(DHG-9140A 型 ,上海精宏实验设备有限公司),旋
转蒸发器(RE-3000型 ,上海亚荣生化仪器厂),电子
天平(BS124S ,北京赛多利斯仪器系统有限公司),
真空冷冻干燥机(FD-1型 ,北京博医康技术公司),
电热恒温水浴锅(H HS-4S型 ,上海康路仪器设备有
限公司)。葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定
所),1 , 1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH · , 美国
Sigma 公司), DEAE Sepharo se FF(美国 G E 公
司)。试验药材采集自福建福州地区 ,经福建医科
大学天然药物学系张永红教授鉴定为棕榈科植物
蒲葵(Livistona chinensis R.Br.)的干燥种子。所
用试剂均为分析纯 。
1.2　方法
1.2.1　多糖的提取　蒲葵子自然晾干 ,粉碎并过
筛 ,取粉末 0.5 kg ,经 70%乙醇回流提取 3次 ,每次
2 h ,去除脂溶性成分与色素。药渣置室温干燥 ,取
干燥粉末 ,加 10倍量水 ,100 ℃水浴回流提取 2次 ,
每次 2 h ,过滤 ,合并提取液 ,浓缩至小体积。加入
95%乙醇至终体积分数为 80%,进行醇沉 ,密封 ,冰
箱静置过夜。倾倒上清液 ,离心 ,收集沉淀 ,冷冻干
燥 ,得粗多糖(LCP)。
1.2.2　分离纯化 　将 LCP 用双重蒸馏水溶解;
Sevage 法除蛋白 , 提取液 ∶氯仿 ∶正丁醇 =
25∶5∶1 ,电动搅拌 30 min ,静置分层后 ,弃蛋白质
沉淀及有机层 ,直至有机溶液层与上清液间无白色
胶状物产生为止。依次用自来水 、蒸馏水透析48 h ,
透析液加 1%活性炭脱色 ,抽滤 ,滤液 80%乙醇醇
沉 ,冰箱冷藏过夜。倾倒上清液 ,离心 ,收集沉淀 ,
依次用无水乙醇 、乙醚洗涤 ,冷冻干燥 ,得到总多糖
(LCP1), 留待含量测定用。取总多糖 LCP1 经
DEAE Sepharo se FF 层析柱分离纯化 ,双重蒸馏水
洗脱得精制多糖(LCP2), 流速 6 mL/min , 每管
5 mL收集 。
1.2.3　LCP 1含量测定　采用苯酚-硫酸法[ 8] 。
1.2.3.1　配制葡萄糖标准溶液　精密称取 105 ℃
干燥至恒质量的葡萄糖 11.19 mg ,置 100 mL 量瓶
中 ,溶解并定容至 100 mL ,摇匀 ,即得111.9 μg/mL
164 福建医科大学学报　2011 年 6 月　第 45卷第 3期
标准储备液 ,冷藏备用。
1.2.3.2　制备 LCP1溶液 　精密称取 LCP 1 12.3
mg ,置 25 mL 量瓶中 ,加水定容 ,摇匀 ,即得 492.0
μg/mL 标准储备液 ,冷藏备用 。
1.2.3.3　配制 6%的苯酚液　称取温溶的苯酚 100
g ,加入 0.1 g 铝片 , 0.05 g 碳酸氢钠 ,加热蒸馏 ,收
集 200 ℃馏分 6 g ,置 100 mL 棕色量瓶中 ,溶解并
定容至 100 mL ,冰箱保存备用。
1.2.3.4　绘制标准曲线　精密吸取上述葡萄糖标
准液 0 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 、1.4 mL ,分别置于
25 mL 具塞试管中 ,水补足至 2.0 mL ,每样各设 2
次重复。向试管中依次加入 6%苯酚溶液 1.0 mL ,
浓硫酸 5.0 mL ,静止 10 min ,室温放置 20 min ,以
试剂空白为参比 ,在 490 nm 处测定其吸光度 。以
葡萄糖质量浓度(C)为横坐标 ,吸光度(A)为纵坐
标 ,绘制标准曲线 ,并计算得回归方程为
A=0.0154 C+0.007
　　相关系数 r =0.9993 。标准葡萄糖溶液在
22.38 ～ 78.33 μg/mL 范围内线性关系良好 。
1.2.3.5　精密度试验　精密吸取上述葡萄糖标准
液 0.8 mL 于具塞试管中 , 水补足至 2.0 mL , 按
“1.2.3.4项”的方法测定吸光度 , 求得 RSD 为
1.76%。
1.2.3.6　稳定性试验　葡萄糖样液完成显色后 ,
在 490 nm处每隔 20 min测 A ,结果显示在 2 h内 ,
RSD为 1.83%。
1.2.3.7　回收率试验　按高 、中 、低 3个水平 ,分别
精密吸取上述葡萄糖标准液 0.4 、0.8 、1.2 mL ,置于
25 mL 试管中 ,每支试管再加入已测知含量的 LCP1
样品 0.5 mL ,加水补至 2.0 mL ,按“1.2.3.4项”方
法测定吸光度 ,计算加样回收率。结果平均回收率
为 99.18%(n=5), RSD为 1.96%。
1.2.3.8 　多糖 LCP1含量测定 　准确量取上述
“1.2.3.2项” LCP1溶液 180 μL ,按“1.2.3.4项”下
方法测定吸光度 ,平行测定 3次。按下式进行计算:
　　 多糖含量=(C×V×D)/W
式中 C:供试液中葡萄糖浓度 ,D为样品溶液的稀释
倍数 ,V 为供试液体积 ,W 为供试液的质量。
1.2.4　抗氧化活性研究
1.2.4.1　对 ·OH 的抑制作用 　采用邻二氮菲-
Fe
2+-H 2O 2法(Fonton 反应)[ 9] ,按照表 1的方法进
行加样 ,多糖 LCP2设定 0.1 、0.3 、0.5 、1.0 、1.5 、2.0
mg/mL 等 6种不同浓度 。将各反应管加样摇匀后 ,
置于恒温水槽中 , 37 ℃保温 60 min , 536 nm 处测定
吸光度 ,按下式计算羟自由基清除率:
　　清除率(%)=[(A2 -A1)/(A0 -A1)] ×100%
　　式中 A0为未损伤管的吸光度 , A1为损伤管的吸
光度 , A2为样品管的吸光度。
表 1　邻二氮菲-Fe2+-H2O 2体系加样表
Tab 1　The sample table of phenanthro line- Fe2+-H2O2 sy stem mL
试　　剂 空白管 未损伤管 损伤管 样品管
pH 7.4 磷酸盐缓冲液 2 2 2 2
0.75 mmol/ L 邻二氮菲溶液 - 1 1 1
蒸馏水 4 2 1 -
0.75 mmol/ L 硫酸亚铁溶液 - 1 1 1
LCP 2 溶液 - - - 1
0.01% H2O 2 溶液 - - 1 1
总体积 6 6 6 6
1.2.4.2　对 O-2 ·的抑制作用　采用邻苯三酚自
氧化法[ 10] ,按照表 2的方法进行加样 ,多糖 LCP2设
定 0.1 、0.3 、0.5 、1.0 、1.5 、2.0 mg/mL 等 6种不同
浓度 。Tris-HC l缓冲液置 25 ℃水浴保温 20 min
后 ,加入 LCP2溶液(或蒸馏水)和邻苯三酚(或盐
酸)溶液 ,且加入后快速摇匀 ,然后以空白作对照测
定样品在 320 nm 处的 A ,每隔 0.5 min 记录 1次 ,
连续记录 4 min ,各管的氧化速率及对 O -2 ·的清除
率按下列公式计算:
　　氧化速率=(最后 1 次记录值一第 1 次记录值)/ 4
　　清除率=(自氧化管氧化速率一样品管氧化速率)/自
氧化管氧化速率×100%
1.2.4.3　对DPPH ·的抑制作用　参照文献[ 11] ,
取 80 μmol/L 的 DPPH 溶液2.0 mL , 分别加入
1.0 mL不同浓度(0.1 、0.3 、 0.5 、1.0 、 1.5 、
2.0 mg/mL)的 LCP2溶液 ,摇匀 ,静置30 min后 ,测
定517 nm波长下的吸光值(Ai), 以 50%的乙醇
1.0 mL代替样品作为空白对照管 ,以 50%的乙醇
165陈　艳等:蒲葵子多糖含量测定及其抗氧化活性研究
表 2　邻苯三酚自氧化法加样表
Tab 2 　The sample table of the pyr ogallol autox idation
method m L
试　剂 空白管 自氧化管 样品管
pH 8.2 、50 mmol/ L 的 T ris-HCl缓冲液 5.0 5.0 5.0
蒸馏水 5 4.7 -
2.5 mm ol/ L邻苯三酚溶液 - 0.3 0.3
LCP2 溶液 - - 4.7
总体积 10 10 10
2.0 mL 代替 DPPH 溶液作为样品参比管 ,并以等
体积蒸馏水和 50%乙醇混合液空白调零 ,按照同样
的方法测定 517 nm 波长下的吸光值 , 样品对
DPPH ·的抑制作用按下列公式计算:
　　清除率=[ 1-(Ai-Aj)/ Ac] ×100%
　　Ai=A(2.0 mL DPPH+1.0 mL 待测液)
　　Aj=A(1.0 mL 待测液+2.0 m L 50%乙醇)
　　AC=A(2.0 mL DPPH+1.0 mL 50%乙醇)
　　式中 Ai为样品管的吸光值 , Aj为样品参比管
的吸光值 , Ac为空白对照管的吸光值。
2　结　果
2.1 　多糖 LCP1 含量 　多糖 LCP1 的含量为
51.94%(n=3), RSD为 1.39%。
2.2　多糖 LCP2抗氧化活性研究 　蒲葵子多糖
LCP2对·OH 、O-2 ·和 DPPH ·均有明显的清除作
用 ,且随着 LCP 2浓度的增加 ,清除能力增强 ,表明
LCP2对 · OH 、O -2 ·和 DPPH ·的清除能力与
LCP2浓度有明显的量效关系(图 1)。在相同实验
浓度(1.0 mg/mL)时 , LCP2对 ·OH 和 O -2 ·的清
除率分别为 66.31%、60.11%,而对 DPPH ·的清
除率达到 92.9%。
A:·OH ;B:O -2 · ;C:DPPH· .
图 1　LCP 2对·OH 、O -2 · 、DPPH·的清除作用
Fig 1 　 The scaveng ing effect o f LCP2 on
· OH , O -2 · , DPPH· , respectively
3　讨　论
　　蒲葵子为棕榈科植物蒲葵 Liv istona chinensis
(Jacq.)R.Br.的种子 ,在民间被广泛用于治疗各
种癌症 ,其中福建民间将蒲葵子与猪肉一同炖至肉
熟烂 ,饮汤吃肉 ,用其治疗鼻咽癌 、食管癌的治疗。
国外文献报道 ,蒲葵子的水提物(0.1 g/mL)和乙醇
提取物(0.1 g/mL)对人白血病细胞 HL60生长有
较强的抑制作用 ,水提物和醇提物对 HL60的 IC50
都为 1/50 倍的提取液(即 2 μg/mL);水提物(10
μg/mL)和醇提物(10 μg/mL)对羟自由基的清除能
力分别相当于 13.0和 12.72 μmol/L 的 Tro lox(维
生素 E衍生物 ,抗氧化剂)的清除能力[ 6] 。目前 ,对
蒲葵子的研究主要集中于对其醇提物的分离分
析[ 5 , 7] ,本课题组采用水溶醇沉的方法 ,首次从中提
取出水溶性多糖。
　　多糖是一类天然高分子化合物 ,在中草药中广
泛存在 ,其纯度标准不能用小分子化合物的纯度标
准来衡量 ,通常所说的多糖纯品实质上是一定分子
量范围的均一组分[ 8] 。纯度鉴定通常有四种方法:
比旋光度法 、超离心法 、高压电泳法及凝胶过滤法 ,
前三种误差较大 ,凝胶过滤法是目前实验室常用的
方法 。故而 ,笔者采用 DEA E Sepharo se FF 层析柱
来纯化多糖 ,流出液用硫酸-苯酚法测定 ,画出流出
体积与糖浓度的关系曲线 ,并获得对称单一峰 ,因
此精制多糖 LCP2为均一组分 。
　　糖定量测定法有 3 , 5-二硝基水杨酸(DNS)比
色法 、硫酸-苯酚法 、蒽酮-硫酸法 、地衣酚-硫酸法
等[ 8] 。硫酸-苯酚法的原理为 ,糖转变为糖醛衍生物
在 490 nm 有最大吸收 ,且吸收值与糖含量呈线性
关系 。硫酸-苯酚法测定多糖的重现性好 ,灵敏度
高 ,故笔者采用硫酸-苯酚法来测定糖含量 。为提高
重现性 ,苯酚使用前须重蒸 ,配好的苯酚溶液应置
于冰箱中避光保存 ,浓硫酸应缓慢沿试管壁加入。
另外 ,蒲葵子水提液为深红色溶液 ,影响多糖的测
定结果 ,应用 1%活性炭吸附糖液中的色素物质 ,可
减少干扰 。
　　自由基可引发脂质过氧化反应 ,能与体内的生
物大分子 ,如 DNA 、蛋白质或脂质反应 ,削弱它们的
功能 ,促进人体衰老以及多种疾病 ,包括癌症 、心血
管疾病等有关。抗氧化剂的抗氧化作用可以通过
抑制自由基的产生 ,或直接清除自由基 , 甚至可以
通过提高内源性抗氧化物质的水平来实现 。文献
报道蒲葵子水提物有清除 ·OH 的活性[ 6] ,而蒲葵
子多糖为蒲葵子中的水溶性成分之一 ,笔者首先对
166 福建医科大学学报　2011 年 6 月　第 45卷第 3期
其体外抗氧化活性进行筛选。本实验采用邻二氮
菲-Fe2+-H2O2法 、邻苯三酚自氧化以及对DPPH ·
的抑制实验 ,考查其对 ·OH 、O -2 · 、DPPH ·的清
除能力。结果表明 ,蒲葵子多糖 LCP 2 对 3个自由
基具有较强的清除作用 ,且与 LCP2浓度有明显的
量效关系。因此 ,蒲葵子多糖 LCP 2可以作为抗氧
化剂 ,具有进一步开发利用价值 。本课题组对蒲葵
子多糖 LCP2的结构测定及其他活性筛选正在进
行中 。
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Quantitative Determination and Antioxidative Activity
of Polysaccharides in Livistona chinensis
CHEN Yan1 , YAO Hong2 , LI Shaoguang2 , LIN Xinhua2
1.Department of Pharmaceutical Chemistry;2.Department of Pharmaceutical Analysis ,
Fuj ian Medical University , Fuzhou 350004 , China
　　ABSTRACT:　Object ive　To research the content and the antio xidat ive activi ty in v i tro of po ly saccha-
rides from in Liv istona chinensis.　Methods　Poly saccharides LCP w as ex t racted by hotw ater , Poly sac-
charides LCP1and LCP2 were obtained af ter purification.　T he quantitative determination of LCP 1was pe r-
fo rmed at w aveleng th 490 nm w ith pheno l-sulfuric acid.　Scavenging ef fect to hydroxyl radical(·OH),
superoix ide anion(O -2 ·)and 1 , 1-dipheny l-2-picrylhydrazy l radical (DPPH ·)were measured by using
spect ropho tometry for ev aluating their antioxidant activity of LCP2 .　Results　The content o f LCP1 was
51.94%(RSD 1.39%, n=3).Fo r 1.0 mg/mL LCP2 , the scaveging rates o f O H · , O -2 · , DDPH ·
were 66.31%, 60.11%, 92.9 %, respect ively .　The scavenging effect of LCP2 was ce rtain do sage-de-
pendent.　Conclusion　S ulfuric acid-phenol method w as simple , rapid , accurate and had a good sensitivi-
ty.　The po ly saccharides of Liv istona chinensis showed high antio xidant activi ty , and can be applied as a
po tential natural ant ioxidant in Chinese T radi tional M edicine.
KEY WORDS:　Livistona chinensis;Antineoplastic drugs(TCD);drug s , chinese herbal;po ly saccha-
rides;f ree radical scavengers;antiox idants
(编辑:何佳凤)
167陈　艳等:蒲葵子多糖含量测定及其抗氧化活性研究