全 文 ：【研究原著】
半边旗 5F对硬皮病成纤维细胞 Caspase-3活性的影响
肖佐环 ,罗文基 ,孟晓军 ,陆东庆
作者单位:中山大学附属第五医院 ,广东 珠海 519000
作者简介:肖佐环 ( 1971-) ,女 ,湖南邵阳人 ,主治医师 ,硕士。研究方向:
硬皮病。
　　【摘要】　目的: 探讨半边旗 5F对凋亡有关的酶 Caspase-3的影响 ,进而了解该酶诱导系统性硬皮病患者皮肤成纤维
细胞凋亡的机制。方法: 用光度检测法、 RT-PCR法测定半边旗 5F对 Caspase-3的酶活性、 mRN A表达量的变化。 结果:
在半边旗 5F作用下 , Caspase-3的酶活性增高 , m RN A表达增多。 这些变化在一定范围内随着药物浓度的增高和作用时
间的延长而增强。结论:半边旗 5F通过影响 Caspase-3的 mRN A的表达量而增高酶的活性 ,是诱导系统性硬皮病患者皮
肤成纤维细胞的凋亡的机制之一。
【主题词】　硬皮病 ,局部性 /酶学 ;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 /遗传学 /药物作用 ;二萜类 /药理学 ;抗肿瘤药 (中药 ) /
药理学
【中图分类号】　 R75　　　　【文献标识码】　 A　　　　【文章编号】　 1009-6647( 2009) 05-1015-03
Effects of Pteris Semipinnata 5F on Caspase-3
of Systemic Scleroderma Skin Fibroblasts
XIAO Zuo-huan, LUO Wen-ji, M ENG Xiao-jun, et al.
(Department of Dermatology ,The F if th Af f iliated Hospital of Sun
Yat-sen University of Medical Sciences ,Zhuhai 519000, China )
　　【Abstract】　 Objectives: To study the effects o f pe ris semipinnata 5F on Caspa se-3 enzym e apoptosis co r rela ted of
systemic scler oderma ( SSc ) skin fibr obla sts and find th e cause o f apopto tic induction o f pteris Semipinnata 5F on SSc
Skin Fibroblasts. Methods: We detected the change o f enzyme ac tiv ity , m RNA expression o f Caspa se-3 by pho tomet ric
determina tion and RT-PCR. Results: The r esult show ed tha t 5F incr eased the lev el o f Caspase-3 enzyme activ ity and the
expression o f mRN A a long with the incr ea sing the concentra tion o f the drug. Conclusions: The 5F increases the lev el of
Caspase-3 enzyme activ ity and the expression o f m RN A is one of main mechannia sm about 5F induced the apoptotic of
SSc skin fibroblasts.
【MeSH】　 Scler oderma , Localized /enzymology; Caspases /g enetics /drug effects; Diterpenes /pha rmaco log y;
ANTINEOPLASTIC DRUG ( TCD) /pha rmacolog y
　　系统性硬皮病 ( SSc )是以皮肤纤维化、硬化为特
征的疾病。过度增殖的成纤维细胞和沉积的胶原是导
致皮肤硬化、纤维化的一个重要因素 ,成纤维细胞增殖
活性的精确测定可以反映和预测病变的发展趋势。 而
导致这种病理性成纤维细胞过度增殖的主要原因是增
殖 -凋亡调控的失衡 [1 ]。我们已知半边旗 5F对体外培
养的系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞 ( SFB)的增殖
及其胶原合成具有抑制作用 [2 ] ,半边旗 5F可诱导 SFB
的凋亡 [3 ] , Caspase蛋白酶是近年凋亡调控机制的研
究重点 ,其中 Caspase-3更是凋亡调控研究中的一个热
点。本实验通过研究半边旗 5F对 SFB的 Caspase-3的
影响 ,以期探讨半边旗 5F诱导 SFB凋亡的作用机制 ,
试为研制治疗 SSC的新药提供更为深入的理论依据。
现报告如下。
1　材料和方法
1. 1　材料　在局麻下切取 4例 SSc患者的活动性硬化
皮损 ,体外培养 SFB成功后 ,加入不同浓度的半边旗
5F( 5F组 ) ,以不加药组作为对照 ,分别培养 24 h、 48
h,进行实验 [2 ]。
1. 2　检测方法　 Caspase-3酶活性测定: 培养及加药
同上 ,按试剂盒步骤进行实验。酶标仪测 A405°并以对照
组酶活性为 100% ,其余各组酶活性= (各浓度组吸光
值 /对照组吸光值 )× 100% 。 RT-PCR法检测 Caspase-
3的 m RNA表达:培养及加药同上 ,作用 48 h,收集细
胞 ,抽提细胞总 RNA,逆转录得到 DNA模板 ,进行
PCR扩增。扩增参数为: 预变性 94℃ 6 min→ 94℃ 50
s→ 55℃ 50 s→ 72℃ 90 s (共 32个循环 )→ 72℃ 5
min,产物电泳 ,紫外透射仪下观察拍照。 Caspase-3及
内参引物序列见表 1(上海生物工程公司合成 )。
1015中国误诊学杂志 2009年 2月第 9卷第 5期　 Chin J Misdiagn, Feb 2009 V ol 9 No. 5
表 1　 Caspase-3及其内参引物的序列
检测指标 序列 长度 ( bp)
Ca spase-3 5’ -TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC-3’ 289
5’ -CTG AAACAGTATGCCGACAAGCTT-3’
内参 5’ -CCCATCACCA TCTTCCAG-3’ 574
( GAPDH) 5’ -AGAAGGTGGAAGCAGG-3’
2　结果
分别用 20、 40、 80μg /ml的半边旗 5F作用于 SFB
24 h、 48 h, Caspase3酶活性 ,随着半边旗 5F浓度的不
断增大而增大。表 2可见 ,随着作用时间的延长 ,酶活
性增加 ,与对照组相比均有显著性差异 ,但仅 20μg /ml
组 24 h的酶活性与 48 h的酶活性相比差异有显著性
(P < 0. 05)。
表 2　半边旗 5F组不同浓度不同作用
时间的酶活性与对照组的比较 (% )
组别 24 h酶活性 (% ) 48 h酶活性 (% )
对照组 100 100
半边旗 5F20μg /m l组 145. 5±4. 12) 171. 9± 13. 51) 2)
半边旗 5F 40μg /ml组 276. 5±7. 52) 286. 7± 7. 32)
半边旗 5F 80μg /ml组 423. 9±14. 32) 444. 9± 5. 52)
　　注:与 24 h比较 , 1) P < 0. 05;与对照组比较 , 2) P < 0. 01。
　　 RT-PCR产物电泳结果见图 1。由图 1可见对照组
Caspase-3的 mRNA呈低表达 ;随着药物浓度加大 ,
Caspase-3的 mRNA条带明显变亮 ,表达亦逐渐增多。
A:对照组 ; B: 20μg /ml 5F组 ; C: 60μg /ml 5F组 ; D: 80μg /ml 5F组
图 1　半边旗 5F对 Caspase-3的 mRNA表达的影响
3　讨论
细胞凋亡 (apopto sis)是多细胞有机体为调控机体
发育 ,维护内环境稳定 ,由基因控制的细胞主动死亡过
程。研究显示 SFB存在对细胞凋亡的抵抗性及非正常
的细胞凋亡 ,是 SSc发病的主要原因之一 [4, 5 ]。Kissin[6 ]
发现肌纤维母细胞凋亡受抑 ,可以导致纤维化调节异
常 ,从而导致系统性硬皮病的发生。调控硬皮病成纤维
细胞的凋亡 ,可以控制硬皮病的发生发展 [7 ]。 Tourkina
等 [8 ]通过研究发现 ,某些药物通过诱导硬皮病成纤维
细胞凋亡 ,可以阻止硬皮病小鼠模型的肺纤维化。上述
研究显示细胞凋亡与硬皮病的发生和转归有着密切的
关系 ,但目前国内外并未发现能有效诱导 SFB凋亡 ,
且相对副作用较小的治疗药物。 经我们实验组前期研
究发现 ,半边旗 5F可诱导 SFB的凋亡 ,有效抑制其增
殖及胶原分泌 ,为寻找有效治疗该病的药物提供了新
的途径 [ 2, 3 ]。但半边旗 5F诱发 SFB凋亡的机制并不十
分清楚 ,本实验就此进行了进一步研究。半胱天冬酶即
Caspase蛋白酶 ,是近年凋亡调控机制的研究热点。因
其均属于半胱氨酸蛋白酶类 ,具有特异的天冬氨酸酶
切位点 ,故统称为 Caspase蛋白酶家族。在细胞凋亡的
执行阶段起关键酶作用 ,凋亡的最后实施是通过
Caspase的激活而实现的 ,是凋亡调控的共同通路。
Caspase家族中最引人注目的是 Caspase-3,可被多种
激活物活化 ,分解体内具有重要功能的蛋白质 ,执行死
亡处决任务 ,导致细胞死亡 ,故又称之为“死亡蛋白
酶” ,被作为凋亡的生物学标志 [9 ]。 最近研究表明
Caspase-3的活化是众多刺激因素诱导细胞凋亡的共
同环节 [9 ]。 Akasaka等 [10 ]应用 TUN EL半定量分析发
现 ,在无血清诱导的成纤维细胞凋亡中 Caspa se-3起到
重要作用。 Yamamo to [11 ]研究亦表明在鼠硬皮病模型
的皮损中 Caspase-3的活性在成纤维细胞凋亡中扮演
了重要角色。 本实验通过研究半边旗 5F对 SFB的
Caspase-3的影响 ,探讨半边旗 5F诱导 SFB凋亡的作
用机制 ,为研制治疗 SSC的新药提供新启示。
本实验结果表明半边旗 5F可促进 Caspa se-3酶活
性及其 m RNA表达增加。 随着半边旗 5F浓度的不断
增大 ,作用时间的延长 , Caspase-3酶活性显著增加 ,启
动凋亡程序 ;用药 48 h后 , RT-PCR检测 Caspase-3的
m RNA表达量也随半边旗 5F浓度的加大有所增加 ,
提示酶原合成增加 ,未经半边旗 5F处理的 SFB即基础
表达 Caspase-3,其以无活性的酶原形式存在 ,当受到
刺激时 ,酶原被裂解 ,成为有活性的片断 ,启动凋亡程
序 ,随着半边旗 5F浓度的加大 ,作用时间的增加 ,酶原
生成增多 ,活化亦增多 ,导致酶活性逐渐增高 ,从而促
进凋亡。可见 ,半边旗 5F可使 Caspase-3的 m RNA表
达量增加 ,酶原生成和水解增多 ,从而导致 Caspase-3
的酶活性增强是半边旗 5F诱导 SFB细胞凋亡的重要
机制之一。
综上所述 ,细胞凋亡与硬皮病的发生和转归有着
密切的关系 ,我们研究发现中药半边旗 5F可有效诱导
SFB凋亡 ,抑制其增殖 ,减少其胶原分泌 ,并对其可能
的作用机制进行了深入研究 ,发现其可影响凋亡调控
的关键酶 Caspase-3的活性 ,从而启动 SFB凋亡。 目
前 ,系统性硬皮病仍无有效治疗办法 ,给患者身心带来
很大痛苦 ,半边旗 5F为寻找有效治疗该病新药提供了
一个新途径。
1016 中国误诊学杂志 2009年 2月第 9卷第 5期　 Chin J Misdiag n, Feb 2009 Vol 9 No. 5
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收稿日期: 2008-06-20;修回日期: 2008-12-04　　责任编辑:许纬洲
【教训分析】
残角子宫两次误诊 1例分析
章海林 1 ,李莲 2
作者单位: 1.河北省张家口市怀安县妇幼保健院妇产科 076150; 2.河北
省张家口市第一医院妇产科 075000
【主题词】　妊娠 , 异位 /诊断 ;子宫 /畸形 ;误诊
【中图分类号】　 R714. 224　　　　【文献标识码】　 B　　　　【文章编号】　 1009-6647( 2009) 05-1017-01
　　对残角子宫两次误诊 1例分析如下。
1　摘历摘要
女 , 30岁。因停经 46 d,在门诊人工流产失败 ,以双子宫、左
侧宫内妊娠于 2005-06-29入院。既往月经规律 ,于 4 a前孕足月
剖宫产 1次 ,手术中见妊娠子宫左侧突出 2 cm× 3 cm的小子宫
有蒂与妊娠子宫相连 ,未经任何处理。于 1 a前人工流产后上节
育环。 妇科检查: 已婚未产外阴 ,阴道通畅 ,宫颈轻度糜烂、着
色。 右子宫正常大小 ,活动好 ,左子宫大小约 4 cm× 5 cm球形 ,
活动好 ,与右子宫相连 ,双侧附件未触及异常。B超提示: 右子宫
三径4. 6 cm× 3. 8 cm× 3. 4 cm,形态正常 ,宫内可见节育环回声
反射 ,左子宫三径 4. 2 cm× 3. 4 cm× 2. 8 cm,宫内可见胎囊 2. 0
cm× 2. 0 cm,内见胎芽及胎心搏动 ,诊断为: 双子宫 ,左子宫妊
娠 ,右子宫内节育环。入院后再次行电吸术 ,探针不能进入妊娠
子宫 ,未吸出绒毛组织 ,考虑畸形子宫行剖腹探查。术中见右子
宫正常 ,左子宫球形 ,肌壁菲薄 ,张力大 ,表面布满血管 ,两子宫
间有蒂相连 ,行左侧子宫切除术 ,术后病理: 残角子宫。
2　讨论
在临床上 ,明确诊断单阴道双子宫、单宫颈双角子宫及残
角子宫 ,可根据以下三点: ( 1)详细询问病史 ,注意有无持续性
痛经、性交困难、不育、反复流产、死胎、早产、难产等病史。 ( 2)
仔细的妇科检查: 注意有无阴道纵隔、双子宫颈、宫体外形是否
对称、均匀、宫底部有无凹陷、子宫位置是否正常、宫旁有无包。
( 3)采取 B超、子宫输卵管造影、以及腹腔镜检查 [1]。
残角子宫妊娠的处理: 残角子宫妊娠因肌层发育不良 ,不
能承受过大胎儿 ,多在妊娠中期自然破裂 ,故应早期诊断 ,以行
该子宫切除为宜 [2]。
为避免残角子宫侧输卵管妊娠 ,应同时做残角子宫侧的输
卵管结扎或切除。 关于残角子宫妊娠的受精方式:可能是残角
侧卵子与对侧输卵管游离出的精子 ,至残角侧输卵管内结合 ,
此时妊娠黄体在残角侧 ;或者残角对侧卵子与精子在对则输卵
管内结合后 ,受精卵经腹腔再游到残角子宫内 ,此时妊娠黄体
在对侧卵巢 [3]。
【参考文献】
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收稿日期: 2008-05-11;修回日期: 2008-09-30　　责任编辑:魏建
1017中国误诊学杂志 2009年 2月第 9卷第 5期　 Chin J Misdiagn, Feb 2009 V ol 9 No. 5