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[ 21] KawakamiA., HirayamaK., KawakamiF., etal.Purification
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Biochim.Biophys.Acta, 2006, 1760:421-431.
(2007-11-26收稿)
灰毡毛忍冬药材 HPLC指纹图谱研究
辛　宁 ,丰　杰 ,黄陆良 ,银胜高
(广西中医学院 ,广西南宁 530001)
　　摘要　目的:应用 HPLC法建立灰毡毛忍冬药材的指纹图谱。方法:采用 HypersilgoldC
18
(4.6 mm×250 mm,
5μm)色谱柱 , 乙腈和 0.05%磷酸水溶液为流动相 ,梯度洗脱 , 流速 0.5 ml/min, 柱温 30℃, 检测波长为 240 nm。结
果:建立了灰毡毛忍冬药材的指纹图谱 , 并检测了不同产地 11批灰毡毛忍冬药材;采用 “中药色谱指纹图谱相似度
评价系统(2004A版)”标定了 10个共有峰 , 相似度较高 , 各色谱峰分离较好 , 达到中药指纹图谱研究的技术要求。
结论:该方法准确可靠 ,为更好地控制药材内在质量提供了科学依据。
关键词　灰毡毛忍冬;HPLC;指纹图谱
中图分类号:R282.71　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)08-1138-05
StudyonFingerprintSpectrumofLoniceramacranthoidesbyHPLC
XINNing, FENGJie, HUANGLu-liang, YINSheng-gao
(GuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Nanning530001, China)
Abstract　Object:ToestablishthefingerprintspectrumofLoniceramacranthoidesbyHPLC.Methods:ThecolumnofHypersil
goldC18(4.6 mm×250mm, 5μm)wasused.ThemobilephaseconsistedofAcetonitril-0.05%phosphoricacidwithgradientelution.
Thecolumntemperaturewas30℃, thedetectivewavelengthwas240 nm, andtheflowratewas0.5 ml/min.Results:Fingerprint
spectrumofLoniceramacranthoideswasestablished, and11 samplesofdifferentoriginLoniceramacranthoides.weredetected.Ten
peaksinthechromatogramwerecommonbySimilarityEvaluationSystemforChromatographicFingerprintsofTraditionalChineseMedi-
cine(Version2004 A).Therewasahighsimilarityandeachchromatographicpeakwasobtainedwithgoodseparationandcorrelation
accordingtothetechnicalrequirementsoffingerprintofChinesetraditionalmedicine.Conclusion:Thismethodisaccurate, reliable
andprovidesascientificbasisforcontrolingthequalityofLoniceramacranthoides.
Keywords　LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.;HPLC;Fingerprint
基金项目:广西高校人才小高地建设创新团队资助计划(桂科政 0424008-ZD)作者简介:辛宁(1957-),女 ,教授 ,主要从事中药材商品质量与标准研究;Tel:0771-3137585, E-mail:xn@gxtcmu.edu.cn。
　　忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬 Loniceramacran-
thoidesHand.-Mazz.为 2005年版中国药典山银花
药材基源植物之一 ,首次收载在新增药典品种山银
花项下。主产于湖南 、广西 、重庆等地 ,为西南地区
药材的主流商品之一 。灰毡毛忍冬入药部位为花蕾
或带初开的花 ,具有清热解毒 、凉散风热的功能 ,用
于疔疮痛肿 、喉痹 、丹毒 、热毒血痢 、风热感冒 、温病
发热诸病〔1〕。
灰毡毛忍冬主要含有机酸 、黄酮 、皂苷 、挥发油
等。绿原酸是主要有效成分 ,也是主要质量控制指
标。灰毡毛忍冬的质量研究多以其所含有效成分绿
原酸 、异绿原酸为指标 ,以其含量多少及变化情况作
出质量优劣或方法可行的评价 。建立能系统 、完整
地反映灰毡毛忍冬药材内在质量的控制方法是当务
之急 。采用 HPLC法 ,旨在能更客观而有效的评价
和控制灰毡毛忍冬药材的质量 ,建立灰毡毛忍冬药
材的指纹图谱 ,确保灰毡毛忍冬药材的质量和临床
使用安全有效 ,提供客观可控的 、国内外能接受的产
·1138· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.08.018
品质量控制技术 。
1 　仪器与试药
1.1 　仪器　Agilent1100高效液相色谱仪 ,含在线
真空脱气机(G-1322A),高压四元泵(G-1311A),标
准自动进样器 (G-1313A), 智能化柱温箱 (G-
1316A),可变波长检测器 (G-1313A),二极管阵列
检测器 , Agilent1100 series色谱工作站;CG-16W高
速微量离心机;SB3200T超声波清洗仪;Milipore
Simplicity-185超纯水仪;BP211D电子天平。
1.2 　试剂与样品　乙腈为色谱纯 ,乙醇和磷酸为
分析纯 ,水为超纯水;对照品:绿原酸对照品由中国
药品生物制品检定所提供(批号:110753-200413)。
药材:灰毡毛忍冬药材为忍冬科忍冬属植物灰毡毛
忍冬 L.macranthoidesH.-M.的干燥花蕾或带初开
的花 ,样品经广西中医药研究所方鼎研究员鉴定 。
实验所用各产地灰毡毛忍冬药材见表 1。
　表 1 　不同产地的灰毡毛忍冬药材
药材编号 产地
1 湖南溆浦
2 重庆
3 广西柳州融水县
4 广西柳州三江县边浪村
5 广西柳州三江县白文村
6 广西桂林全州
7 广西桂林资源县晓锦村
8 广西桂林梅溪乡铜座村
9 广西桂林梅溪乡咸水洞
10 广西桂林中峰乡车田湾
11 广西桂林中峰乡大源村
2 　方法与结果
2.1 　色谱条件　HypersilgoldC18色谱柱(4.6 mm
×250 mm, 5μm);流动相:A(乙腈)-B(0.05%磷酸
水溶液);流速:0.5 ml/min;检测波长:240 nm;柱
温:25℃;进样量:5μl。梯度洗脱:0 ～ 20 min(8%A
～ 10%A), 20 ～ 35 min(10%A～ 15%A), 35 ～ 45
min(15%A～ 18%A), 45 ～ 65 min(18%A～ 21%
A), 65 ～ 75min(21%A～ 26%A)。
2.2 　对照品溶液的制备　精密称取绿原酸对照品
适量 ,加甲醇制成含绿原酸约 0.13 mg/ml的溶液 ,
作为对照品溶液 。
2.3 　供试品溶液的制备　取灰毡毛忍冬药材粉末
(过 4号筛)0.1 g精密称定 ,置锥形瓶中 ,精密加入
50%乙醇 25 ml,密塞 ,称定重量 ,超声 30 min,放冷
后补足减失重量 ,过滤 ,取续滤液置微型离心管中以
10000 r/min的速度离心 10 min,取上清液作为供试
品溶液。
2.4　方法学考察
2.4.1 　系统适应性考察:取对照品溶液 5μl,注入
色谱仪 ,绿原酸对照品色谱图见图 1。
图 1　绿原酸对照品色谱图
2.4.2　精密度试验:取灰毡毛忍冬对照品溶液 ,连
续进样 6次 ,检测指纹图谱 ,灰毡毛忍冬各共有峰的
相对保留时间 RSD值在 0 ～ 0.097%之间;相对峰面
积 RSD值在 0 ～ 1.2%之间 ,均小于 3%,符合指纹
图谱要求 。
2.4.3 　稳定性试验:取同一批次(9号样品)灰毡
毛忍冬供试品溶液 ,分别于 0、3、6、9、12、18、24 h进
行指纹图谱测定 ,结果表明 ,各共有峰相对保留时间
RSD值在 0.040% ～ 0.13%之间;相对峰面积 RSD
值在 0.10% ～ 1.3%之间 ,均小于 3%,符合指纹图
谱要求。表明样品溶液在 24h内稳定。
2.4.4 　重复性试验:取同一批次(9号样品)灰毡
毛忍冬药材 6份 ,精密称定 ,按供试品溶液的制备方
法 ,制备成供试品溶液 ,检测指纹图谱 。结果表明 ,
各共有峰相对保留时间 RSD值在 0.033% ～
0.092%之间;相对峰面积 RSD值在 0.23% ～ 2.6%
之间 ,均小于 3%,符合指纹图谱要求 。
2.5　样品测定　取不同批次灰毡毛忍冬药材粉末
精密称定 ,按供试品溶液的制备方法 ,制备成供试品
溶液 ,注入液相色谱仪 5μl, 记录 75 min色谱图即
得。
2.6　指纹图谱分析与评价
2.6.1　共有峰标定:根据 11批不同产地的灰毡毛
忍冬药材 HPLC指纹图谱检测结果 ,利用 “中药色谱
指纹图谱相似度评价软件”生成灰毡毛忍冬药材共
有模式的对照 HPLC指纹图谱见图 2,其中共有特
征峰有 10个 ,保留时间 23.29 min的峰为绿原酸的
指纹峰 ,其峰面积较大 ,与相邻峰分离良好 ,出峰位
置适中 ,其峰高和峰面积较为适中 。故选定绿原酸
为指纹图谱参照物 ,其色谱峰为参照峰 S,以其保留
时间和峰面积为 1,计算各峰的相对保留时间和峰
面积比值 。 11批灰毡毛忍冬药材的指纹图谱见图
·1139·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月
3。
图 2　灰毡毛忍冬药材的对照 HPLC指纹图谱
2.6.2　共有峰的相对保留时间和相对峰面积计
算:以绿原酸峰为参照峰 ,分别计算其他各共有峰的
相对保留时间和相对峰面积比值 ,见表 2、表 3。
2.6.3　相似度评价:利用 “中药色谱指纹图谱相似
度值评价系统 2004 A版 ”软件 ,分别对 11批灰毡毛
忍冬药材指纹图谱进行匹配 ,并以 11批样品生成的
对照谱图(平均数法)作为对照模板 ,计算各谱图的
相似度 ,范围分别在 0.921 ～ 1.000,见表 4。
3　讨论
3.1　流动相的选择:参考文献 〔2-4〕对色谱条件进行
了优化 ,采用乙腈 -磷酸梯度洗脱法 ,灰毡毛忍冬各
色谱峰得到了较好的分离 ,得到较完整的 HPLC色
谱图 。磷酸不同比例比较发现 ,增加酸的浓度并没
有提高分离度和改善峰形 ,而且考虑到色谱柱所能
承受的 pH值 ,故控制加入磷酸的浓度为 0.05%。
3.2　检测波长的选择:实验过程中通过改变波长
考察指纹图谱的出峰效果 ,结果表明 240 nm测定的
信息量多 ,图谱中的各指纹峰信号均衡 ,分离效果较
好。因此 ,选用 240nm作为检测波长 。
3.3　提取溶剂的选择:灰毡毛忍冬中主要含有机
酸和黄酮类成分 〔2〕 ,根据其有效成分的性质 ,经过
50%甲醇 、50%乙醇 、70%甲醇 、70%乙醇 、甲醇 、水
等溶剂提取试验 , 50%乙醇提取部分成分相对较多 ,
故选择 50%乙醇提取 。
图 3　11批灰毡毛忍冬药材高效液相色谱叠加图
　　表 2 　灰毡毛忍冬药材 HPLC指纹特征共有峰相对保留时间
样品号 峰号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0.629 1.000 1.110 1.474 1.748 1.875 2.545 2.603 2.692 2.930
2 0.629 1.000 1.110 1.473 1.747 1.874 2.543 2.602 2.690 2.928
3 0.629 1.000 1.109 1.473 1.748 1.876 2.545 2.603 2.692 2.928
4 0.629 1.000 1.110 1.472 1.745 1.872 2.540 2.598 2.686 2.923
5 0.627 1.000 1.111 1.474 1.746 1.872 2.540 2.598 2.686 2.923
6 0.628 1.000 1.110 1.471 1.742 1.868 2.535 2.592 2.680 2.917
7 0.628 1.000 1.110 1.472 1.744 1.871 2.539 2.598 2.686 2.924
8 0.628 1.000 1.110 1.473 1.746 1.872 2.540 2.598 2.687 2.923
9 0.628 1.000 1.111 1.473 1.745 1.871 2.534 2.592 2.681 2.917
10 0.629 1.000 1.110 1.475 1.749 1.877 2.547 2.605 2.694 2.931
11 0.629 1.000 1.110 1.474 1.749 1.875 2.547 2.605 2.693 2.929
·1140· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月
　　表 3 　灰毡毛忍冬药材 HPLC指纹特征共有峰相对峰面积
样品号 峰号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0.115 1.000 0.081 0.006 0.005 0.116 0.018 0.586 0.015 0.079
2 0.064 1.000 0.107 0.006 0.009 0.194 0.050 0.900 0.017 0.233
3 0.067 1.000 0.112 0.006 0.009 0.191 0.051 0.890 0.017 0.225
4 0.082 1.000 0.121 0.006 0.008 0.135 0.081 1.047 0.021 0.259
5 0.057 1.000 0.064 0.027 0.006 0.097 0.007 0.779 0.048 0.038
6 0.151 1.000 0.176 0.011 0.008 0.130 0.067 1.332 0.052 0.239
7 0.088 1.000 0.085 0.024 0.008 0.118 0.010 0.970 0.051 0.049
8 0.086 1.000 0.094 0.050 0.008 0.136 0.008 0.853 0.082 0.041
9 0.083 1.000 0.068 0.030 0.008 0.089 0.010 0.999 0.065 0.049
10 0.126 1.000 0.090 0.047 0.010 0.113 0.008 1.046 0.104 0.035
11 0.051 1.000 0.083 0.009 0.007 0.094 0.032 0.664 0.018 0.137
　　表 4 　灰毡毛忍冬指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)相似度计算结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 对照
S1 1.000 0.972 0.974 0.955 0.988 0.921 0.970 0.981 0.965 0.959 0.995 0.979
S2 0.972 1.000 1.000 0.995 0.984 0.978 0.987 0.986 0.984 0.981 0.986 0.996
S3 0.974 1.000 1.000 0.995 0.985 0.977 0.987 0.987 0.985 0.981 0.987 0.996
S4 0.955 0.995 0.995 1.000 0.977 0.992 0.987 0.981 0.987 0.984 0.974 0.993
S5 0.988 0.984 0.985 0.977 1.000 0.957 0.994 0.997 0.992 0.988 0.993 0.995
S6 0.921 0.978 0.977 0.992 0.957 1.000 0.980 0.968 0.981 0.983 0.942 0.979
S7 0.970 0.987 0.987 0.987 0.994 0.980 1.000 0.997 0.999 0.998 0.979 0.997
S8 0.981 0.986 0.987 0.981 0.997 0.968 0.997 1.000 0.995 0.994 0.987 0.996
S9 0.965 0.984 0.985 0.987 0.992 0.981 0.999 0.995 1.000 0.999 0.976 0.995
S10 0.959 0.981 0.981 0.984 0.988 0.983 0.998 0.994 0.999 1.000 0.969 0.993
S11 0.995 0.986 0.987 0.974 0.993 0.942 0.979 0.987 0.976 0.969 1.000 0.989
对照 0.979 0.996 0.996 0.993 0.995 0.979 0.997 0.996 0.995 0.993 0.989 1.000
3.4 　提取条件的选择:采用冷浸提取 、回流提取和
超声提取三种方法进行对比试验 ,结果表明相同提
取时间 ,超声提取的峰信息多 ,而且操作简单 ,故选
择超声提取 。并对比了超声提取时间 ,最终选择用
过 4号筛的灰毡毛忍冬中粉 ,直接加入溶剂超声提
取 30min,滤过后取续滤液测试。
3.5 　分析时间考察:吸取供试品溶液 5μl,注入高
效液相色谱仪 ,运行 120 min,记录色谱图 ,发现 75
min以后已无明显色谱峰 , 因此分析时间定为 75
min。
3.6 　空白试验:吸取甲醇空白溶液 5μl注入高效
液相色谱仪 ,记录色谱图 ,结果溶剂基本无峰 ,对检
测基本无干扰。
3.7 　通过以上 11批灰毡毛忍冬药材的 HPLC指
纹相似度结果可以看出 ,不同产地的灰毡毛忍冬药
材指纹图谱相似度较高 ,均大于 0.900,说明药材组
成一致性较好 ,本文是参考 《中药注射剂指纹图谱
研究的技术要求(暂行)》的相关要求建立了灰毡毛
忍冬药材的 HPLC指纹图谱 ,建立的灰毡毛忍冬指
纹图的特征共有色谱峰 ,能够为灰毡毛忍冬药材的
鉴别 ,甚至质量控制提供了可靠的科学依据。收集
的 3个地区的 11批药材样品 ,有一定的广泛性与同
一性 ,保证指纹图谱良好的特征性和代表性 。
参 考 文 献
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(2008-01-02收稿)
冬虫夏草及其类似品的 HPLC指纹特征分析
赖宇红 ,阮桂平 ,谢友莲 ,陈浩桉
(广东省药品检验所 ,广东广州 510180)
　　摘要　目的:研究冬虫夏草及其类似品的 HPLC指纹特征分析方法。方法:对冬虫夏草及其类似品共 13个样
本进行 HPLC测定 ,结果分别采用相似度评价和采用轮廓图 、雷达图 、星座图等方法进行多变量二维平面比对分
析。结果:相似度分析可综合量化样本的相似程度 , 轮廓图 、雷达图 、星座图等图示则能直观展示品种间的分类和
特点。结论:相似度分析和轮廓图 、雷达图 、星座图等多变量图示的综合应用更加有利于指纹图谱的评判和指纹特
征解析。
关键词　冬虫夏草;HPLC;指纹图谱;轮廓图;雷达图;星座图
中图分类号:R282.71　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)08-1142-04
StudyonHPLCFingerprintCharacteristicAnalysisofCordyceps
sinensisandItsSimilarProducts
LAIYu-hong, RuanGui-ping, XieYou-lian, ChenHao-an
(GuangdongInstituteforDrugControl, Guangzhou510180, China)
Abstract　Objective:TostudyonHPLCfingerprintcharacteristicanalysisofCordycepssinensisanditssimilarproducts.Meth-
ods:Todeterminate13samplesofCordycepssinensisanditssimilarproductsbyHPLC, andanalyzetheHPLCresultswithsimilarap-
praisalmethodandgraphicalmethodsofmultivariatesampleintwodimensionalplanesuchasthemethodsofprofile, radarchartand
constellationgraph.Results:Thesimilarappraisalmethodmightsynthesizethesimilardegreeinquantification, whilethegraphical
methodssuchasprofilegraph, radarchartandconstelationgraphcouldshowmoredetailsabouttheclassificationandthecharacteristic
ofvarietiesdirectly.Conclusions:Werecommendthecombinedapplicationofsimilarappraisalmethodandthegraphicalmethodsdue
toitsadvantagesonthejudgmentandcharacteristicanalysisoffingerprint.
Keywords　Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.;HPLC;Fingerprint;Profilegraph;Radarchart;Constelationgraph
基金项目:广东省中医药管理局资助项目(102097);广州市科技局资助项目(2007Z2-E5061)作者简介:赖宇红(1969-), 女 , 副主任中药师 , 从事药品 、保健食品检验和质量控制研究;Tel:020-81853845, E-mail:laiyuhong@gd-da.gov.cn。
　　冬虫夏草是我国传统名贵野生中药材 。随着人
民生活水平的不断提高 ,自我保健意识的增强 ,对冬
虫夏草的需求量越来越大 ,逐渐造成野生资源的匮
缺 。为了扩大药源 ,人们一方面致力于冬虫夏草的
人工培养研究 ,另一方面则着手寻找并研究其类似
品 ,主要有亚香棒虫草 、凉山虫草 、蝉花等。为解决
天然虫草来源紧张问题 ,以人工发酵培养虫草菌丝
体已获成功 ,数种人工虫草产品已投入市场 。冬虫
夏草的类似品虽然被认为有相似的功效 ,但作为替
代品 ,价格上远远不及天然虫草 。因此 ,本研究收集
了冬虫夏草正品 、分枝虫草 、亚香棒虫草 、凉山虫草 、
人工培植虫草花等 13份样品 ,分析它们的 HPLC指
纹图谱 ,用相似度软件评价色谱的整体相似性 ,并尝
试分别以轮廓图 、雷达图 、星座图〔1-4〕在二维平面上
直观表达多个已知特征峰的绝对含量特点 、相对比
例特点和分类结果 ,为深入研究提供线索。
1　实验部分
1.1　实验药材　1#、2#、3#样 ,购自广州清平市场 ,
经鉴定为冬虫夏草正品 ,即麦角菌科真菌冬虫夏草
菌 Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠娥科
昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体 ,三份样品
的虫体大小有差异 。 4#样由湖南常德药检所收购 ,
虫体与菌种均未获鉴定 ,子座分枝明显 ,故暂称为
“分枝虫草 ”。 5#样由湖南药检所收购自长沙地区 ,
·1142· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 8期 2008年 8月