全 文 ：ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.23No.22007February
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彩叶植物的叶片呈色相当复杂，与叶片细胞内
色素的种类、含量以及在叶片中的分布有关。叶片中
的色素主要有3大类：一为叶绿素类，主要有叶绿素
a、叶绿素 b；二为类胡萝卜素类，主要有类胡萝卜素
和叶黄素；三为类黄酮类色素，主要为花色素苷[1]。叶
绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，是植物叶片呈
现绿色的原因。类胡萝卜素为橙黄色，叶黄素为黄
色，由于普通叶片中叶绿素比类胡萝卜素多，所以叶
片总是呈现绿色。花色素苷是类黄酮次生代谢途径
中的产物之一，可反应大部分红、蓝、紫和红紫等颜
色[2]，是叶色和花色多彩形成的主要原因。
彩叶草（ ColeusblumeiBenth.）又名洋紫苏,锦紫
苏，原产于印尼、爪哇等地，为唇形花科鞘蕊花属多
年生草本植物。其叶色有绿、红、黄、紫等多种颜色，
常年似叶似花，是一种优良的观叶花卉。由于其叶色
的丰富多彩，就可作为研究彩叶植物多彩形成的一
种模式植物。
目前，类黄酮生物合成途径是研究得比较清楚
的次生代谢途径之一[3]。该途径的大多数关键酶基因
和调控基因都已被克隆，并已在花色基因工程的实
彩叶草叶片cDNA文库的构建与分析
祝钦泷,李艳冬,刘光德,郭余龙,眭顺照,李名扬
(西南大学花卉研究所，西南大学园艺园林学院，重庆400716)
摘 要:用植物(叶)总 RNA抽提试剂盒提取彩叶草红色品种顶部叶片总 RNA,用 SMARTcDNALi-
braryConstructionKit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为 1.2×106pfu/ml,扩增总文库滴度为
6.7×109pfu/ml,重组率达到 98%,插入片段在 0.5kb到 2kb之间,1kb以上的占 60%。通过 PCR检
测,从总文库中检测到了彩叶草CHS、DFR及ANS基因的特异片段。各项指标都表明,已获得较高质
量的cDNA文库,为彩叶草叶色基因的分离克隆,彩叶草类黄酮类色素合成的分子调控的研究奠定了
基础。
关键词:彩叶草;叶片;cDNA文库;叶色
中图分类号:Q7;S6 文献标识码:A
ConstructionandAnalysisofcDNALibraryfromtheLeafofColeusblumeiBenth.
ZhuQinlong,LiYandong,LiuGuangde,GuoYulong,SuiShunzhao,LiMingyang
(InstituteofOrnamentalPlants,ColegeofHorticultureandLandscape,SouthwestUniversity,Chongqing400716)
Abstract:TotalRNAwasextractedfromthetopleavesofredformaofC.blumeiusingPlantTotalRNA
Extractionkit,andcDNAlibrarywasconstructedwithSMARTcDNALibraryConstructionKit.Thetiterof
theprimarylibrarywas1.2×106pfu/ml,inwhich98% cloneswererecombinantandtheinsertedcDNA
fragmentsrangedfrom0.5kbto2kb,60%ofthemmorethan1kb.Theamplifiedlibraryhasatiterof
6.7×109pfu/ml.ThepositivesignalsofCHS,DFRandANSgeneweredetectedbyPCRintheamplified
library.ThedataindicatethatthecDNALibraryhashighquality,andprovidesausefultoolforcloning
leafcolorgenesandfurtherstudyonthemolecularmechanismsofthepigmentsbiosynthesisofthe
flavonoidsinC.blumei.
Keywords:ColeusblumeiBenth.,Leaf,cDNAlibrary,Leafcolor
基金项目:重庆市农业发展基金项目（ 20040054）。
第一作者简介:祝钦泷，男，1979年出生，博士研究生，专业方向：植物基因工程。Email:qinlong_zhu@126.com。通信地址：400716重庆市北碚区天生桥1
号西南大学园艺园林学院花卉研究所。
通讯作者:李名扬，1956年出生，男，教授，博士生导师，研究方向：农业生物技术。E-mail：limy@swau.cq.cn。
收稿日期:2006-11-13，修回日期：2006-11-16。
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际操作中取得了成功[4]，为研究和利用类黄酮次生代
谢的分子调控奠定了基础。与花色形成的分子调控
机理的研究进展相比，彩叶植物的呈色机理的研究
还处于起步阶段，主要集中于彩叶形成的生理变化、
生态影响因子和遗传稳定性上[5]。为了进一步从分子
水平上研究彩叶形成机理，本研究以彩叶草红色品
种顶部叶片为材料，构建cDNA文库，为分离克隆彩
叶草类黄酮类色素合成的关键酶基因如 CHS
(chalconesynthase)、DFR (dihydroflavonol4-reduc-
tase)、ANS（ anthocy-anidinsynthase）等，及利用基因
工程手段开展彩叶植物的分子育种研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
建库所用彩叶草（ C.blumei）红色品种为本实验
室保存。文库构建试剂盒 SMARTcDNALibrary
ConstructionKit(Catalog#:K1051-1)购自 CLOTECH
公司，包装蛋白 GigapackIIGoldPackagingExtract
（ Catalog#:200201）购自 Stratagene公司，小量植物
(叶)总 RNA抽提试剂盒(W6771)购自 WATSON(华
舜)公司，其他常规试剂及耗材均为国产。
1.2方法
1.2.1总 RNA的提取 取彩叶草红色品种顶部叶片
为材料，按叶片长度小于1cm、1~2cm、2~3cm三个标
准各取 100mg，混合共计 300mg，加入液氮迅速研
磨后，装于1个DEPC处理的5ml离心管中，立即加
入3mlRD液，用移液器抽打以悬浮混匀样品，接下
来的操作参照总RNA抽提试剂盒说明书进行，略有
改动：即按 3倍比例放大试剂用量，最后过同一吸附
柱。用岛津 BioSpec-miniDNA/RNA/Protein分析仪
检测 RNA的纯度及含量，用非变性琼脂糖凝胶电
泳，检测RNA的完整性。
1.2.2cDNA第一链的合成与 LD-PCR（ LongDistance
PCR）取 3μl（ 约 1.2μg）混合总 RNA，参照试剂盒
操作程序做反转录合成第一链cDNA。取7μlcDNA
第1链，按试剂盒操作程序，预热eppendorfMaster
CyclegradientPCR仪到 95℃进行 LD-PCR，合成双
链cDNA。条件为95℃ 1min，然后经历20个循环：
95℃ 15s，68℃ 6min。循环结束后至 4℃。取 5μl
LD-PCR产物，1.1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3cDNA的纯化与回收 取 50μlLD-PCR产物，
参照试剂盒操作程序，加入 2μl蛋 白 酶 K
（ 20μg/μl），于 45℃保育 20min进行消化。纯化回
收 cDNA，用 10μlSfiⅠ（ 20U/μl）于 50℃酶切 2h
产生粘性末端。标记16个1.5ml离心管，将酶切产
物过 CHROMASPIN-400柱，每管过柱收集物约
40μl，取 3μl电泳检测，收集大于 500bp的 cDNA
片段。
1.2.4cDNA与 λTripIEx2的连接与包装 取 1μl过
柱 cDNA，加入 1μlλTriplex2载体(500ng/μl)，
0.5μl10×连接缓冲液，0.5μlATP (10mmol/L)，
0.5μlT4DNAligase，1.5μl去离子水，16℃连接过
夜。连接产物于65℃失活15min后与噬菌体包装蛋
白进行体外包装。待一管25μl包装蛋白提取物刚开
始融化时加入连接产物 2.5μl，混匀，收集液体于管
底后在 PCR仪上于 22℃包装 2h，再向管中加入
500μl1×λdilutionbufer，混匀，加入20μl氯仿并
轻轻混匀，轻轻离心，上清贮存于 4℃，即为原始文
库。
1.2.5cDNA文库质量鉴定
（ 1）文库滴度测定。取1μl原始文库包装物用1
×λdilutionbufer稀释至 100μl，取其中的 10μl加
入到200μlXL1-blue/MgSO4重悬液，37℃恒温箱中
保温 15min，使 λ 与菌体吸附，再取 3ml
LB/MgSO4顶层琼脂，待其冷至约 45℃时迅速加入
XL1-blue/MgSO4/λ 混合物，迅速混匀，立即铺于一
个 9cmLB/MgSO4平板上，室温冷却 10min后于
37℃倒置培养8~18h，统计噬菌斑数并用下面公式
计算滴度：pfu/ml=numberofplaque×dilutionfactor×
103μl/ml/μlofdilutedphageplated。按每个 9cm平
板5×104个独立克隆扩增原始文库。单独收集每个
平板的裂解物，加入 1/10体积氯仿，混匀后 7500
r/min离心 10min，取上清作为一个亚文库，每个亚
文库取1ml混匀为总文库。取1μl总文库按上述方
法做梯度稀释，测定总文库滴度。每个亚文库及总文
库各取 1ml保存于 4℃备用，其余的均加入 7%
DMSO，保存于-70℃。
（ 2）文库插入片段大小及重组率检测。利用文库
载体 λTripIEx2的 MCS位点上的 Pλ1和 Pλ2引
物对原始文库进行PCR扩增，检测插入片段的长度
并估计文库重组率。从原始文库中随机挑选50个单
噬菌斑与100ml1×λdilutionbufer中，振荡洗脱，
于4℃冰箱中过夜。取3ml洗脱物为模板，以Pλ1
和Pλ2为引物，扩增条件：在95℃变性10min裂解
噬菌体后，再加入PCR反应混合物，并按以下程序扩
增：94℃预变性 4min；94℃变性 1min，56℃退火 1
min，72℃延伸2.5min，25循环；72℃延伸10min。
（ 3）文库覆盖度的检测。采用同源克隆的方法，
从彩叶草红色品种顶部叶片中分别简并扩增得到
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CHS、DFR、ANS三个基因的特异片段（ 结果未公布）。
根据这三个特异片段设计检测文库覆盖度的三对基
因特异引物，并以各自片段克隆质粒为阳性对照，以
95℃变性10min裂解的文库噬菌体作为模板。
CHS基因特异引物：PCHS15-GGACATCGT
GGTGGTAGAGG-3，PCHS25-GCTGTCGGG
CAGAATCGT-3。扩增条件：94℃变性 5min；
94℃变性 50s，58℃退火 1min，72℃延伸 1min，35
循环；72℃延伸10min。目的片段466bp。
DFR基因特异引物：PDFR15-GCCAAAGCC
AAGACTGTGAAGAA-3，PDFR25-AAATAC
ATCCATCCGGTCATCCT-3。扩增条件：94℃
变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延
伸1min，35循环；72℃延伸10min。目的片段145bp。
ANS基因特异引物：PANS15-ACATTCAGG
GCTATGGCAGCAAG-3，PANS25-AGGGCA
TTTCGGGTAGAAGTTTATC-3。扩增条件：
94℃变性3min；94℃变性1min，56℃退火50s，72℃
延伸 50s，35循环；72℃延伸 10min。目的片段
302bp。
2实验结果
2.1总 RNA的提取
提取的总RNA在非变性胶中，28SrRNA与18S
rRNA两条带的比例约为 2:1左右，没有明显的 5S
rRNA，说明所提取的总 RNA没有降解，完整性良好
（ 图 1,A）。经分光光度计测定，提取的总 RNA
OD260/OD280=1.889，表明RNA的均一性较好，纯度
较高，没有蛋白质的污染，完全符合建库要求。
2.2cDNA第一链合成及 LD-PCR
经LD-PCR，合成的双链cDNA产物大小主要集
中在0.5~3.0kb之间，呈弥散状，在1kb附近有较清
晰的丰富带产生(图 1,B)，说明 cDNA合成较好，符
合下一步操作要求。
2.3cDNA的纯化与回收
cDNA经分级后的 16管收集液电泳结果表明，
过柱分离的cDNA片段主要集中于第七到第九管中
(图2)，因此收集并回收第七到第九管的cDNA（ 约
120μl），用于连接实验。
2.4cDNA文库的质量鉴定
检测包装产物稀释后的原始文库滴度为 1.2×
106pfu/ml，扩增总文库滴度为6.7×109pfu/ml。从原
始文库中随机挑选50个单噬菌斑进行PCR鉴定，结
果插入片段分布在 0.5kb到 2kb之间，1kb以上的
占 60%（ 图 3），重组率达到 98%。以彩叶草 CHS、
DFR、ANS基因的特异引物从扩增总文库中分别扩增
(A).总RNA;(B).M.1kbPlusDNAMarker;1.彩叶草dscDNA
图 1总 RNA(A)与 LD-PCRcDNA(B)电泳
M：1kbPlusDNAMarker；1-16：各收集物编号
图 2dscDNA经 CHROMASPIN-400柱分离
出了 466bp、145bp、302bp的目的片段，并与各自的
阳性对照相同（ 图4），这表明文库具有较高的覆盖
率，足以获得目的基因。以上各指标都表明已获得较
高质量的cDNA文库。
3讨论
高效筛选目的基因的方法之一就是构建高质量
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的cDNA文库，而构建高质量的 cDNA文库的关键
是要保证文库的完整性与覆盖度。传统的 cDNA文
库构建方法[6](SuzukiYetal.,2001)，是用 Oligo(dT
)或随机引物作逆转录引物合成 cDNA，通过酶切削
平末端，并连接到适当的载体。这种方法虽然实用、
费用低，但其难以获得低丰度表达基因，且mRNA消
耗量大，文库筛选复杂、耗时。当mRNA过长或其二
级结构复杂时，Oligo(dT)引物不能合成完整 cDNA，
且在二链合成后，传统的cDNA克隆过程产生的粘
性末端使插入的 cDNA比原始 mRNA短 5~30bp[7]，
不易得到包括 5′端全长基因。因此，本实验选用
CLONTECH公司的 SMART（ SwitchingMechanism
At5endofRNATranscript）cDNA文库构建技术，
构建彩叶草cDNA文库。SMART技术能以微量的总
RNA（ >50ng）为起始材料，利用PowerScriptTM逆转录
酶(为具有点突变的MMOLLV逆转录酶，无RNaseH
活性)的SMART特性（ 在 mRNA反转录结束时自动
在第一链cDNA末端添加3个C的特性），自动地将
含有 SMART锚定序列的两端接头同时加在全长单
链 cDNA上 [8]。随后用 SMART锚定引物进行
LD-PCR合成 cDNA第二链，不完整的 cDNA和无
polyA的 cDNA因缺乏 SMART锚定引物而无法被
扩增，从而消除了基因组DNA和无polyA的RNA
污染，有效地保证了cDNA的完整性与覆盖度，使最
终获得的文库为高比例全长性文库 [9,10]。彩叶草
cDNA文库重组率达到98%，库容量为1.2×106，插
入片段最大可达2kb，并从文库中检测到了类黄酮
生物合成的关键酶基因CHS、DFR和ANS，为克隆彩
叶草类黄酮代谢途径中的主要基因，阐明其叶色多
彩的分子机理，并进一步利用这些基因开展彩叶植
物的分子育种研究打下了坚实的基础。
参考文献
[1] 何亦昆,代庆阳,苏学辉.雁来红叶色转变与超微结构及色素含
量的关系.四川师范学院学报(自然科学版),1995,16:195-197.
[2] TanakaY,TsudaS,KusumiT.Metabolicengineeringtomodify
flowercolor.PlantCelPhysiology,1998,11:1119-1126.
[3] Winkel-ShirleyB.Flavonoidbiosynthesis.Acolorfulmodelfor
genetics,biochemistry,cel biology,andbiotechnology.Plant
Physiol.2001,126:485-493.
[4] 张石宝,胡虹,李树云.花卉基因工程研究进展 I:花色.云南植物
研究,2001,23:479-487.
[5] 姜卫兵,庄猛,韩浩章,等.彩叶植物呈色机理及光合特性研究进
展.园艺学报,2005,32:352-358.
M,DL2000DNAMarker;+CK,阳性对照;-CK,阴性对照;CHS,查尔酮合酶;DFR,二氢黄酮醇-4-还原酶;ANS,花色素苷合成酶
图 4文库特异基因检测
M.DL2000DNAMarker；-CK.阴性对照；1~20.单噬菌斑编号
图 3cDNA文库插入片段大小及重组率检测
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[6] SuzukiY,YoshitomoK,MaruyamaK,etal.Constructionand
characterizationofafullength-enrichedanda5-end-enriched
cDNAlibrary.Gene.1997,200:149-156.
[7] DAlessioJM,GerardGF.Sond-strandcDNAsynthesiswithE.
coliDNApolymeraseIandRNaseH:thefateofinformationat
themRNA5terminusandtheefectofE.coliDNAligase.Nucleic
AcidsRes,1988,16:1999-2014.
[8] ZhuY Y,MachlederEM,ChenchikA.Li,etal.Reverse
transcriptase template switching:a SMARTTM approach for
ful-length cDNA library construction.Biotechniques,2001,30:
892-897.
[9] WelenreutherR,SchuppI,ConsortiumTGDNA,etal.SMART
amplificationcombinedwithcDNAsizefractionationinorderto
obtainlargeful-lengthclones.BMCGenomics,2004,5:36-43.
[10]金治平,赵德修,乔传令,等.水母雪莲愈伤组织 cDNA文库的构
建.植物学通报,2004,21(1):61-65.
（ 责任编辑：秦守亮）
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