全 文 ： 2010, Vol. 31, No. 05 食品科学 ※生物工程206
芦荟过氧化氢酶的分离纯化和性质研究
朱 鸿，李想韵，邓 玉，王 松，付伟丽，唐靓婷，郜赵伟，唐云明 *
(西南大学生命科学学院，重庆市甘薯工程研究中心，三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715)
　　
摘 要：目的：获得库拉索芦荟过氧化氢酶纯品并对其性质进行研究。方法：采用硫酸铵分级沉淀，DE AE -
Sepharose阴离子交换层析，CM-Sepharose阳离子交换层析和 Sephacryl S-200凝胶层析对酶蛋白进行分离纯化，采
用 SDS-PAGE鉴定酶的纯度、分子质量。结果：从芦荟中分离纯化获得电泳纯的过氧化氢酶，纯化倍数为 228.05
倍，酶活力回收率为 14.10%，比活力达 17427.30U/mg。该酶的分子质量为 239.90kD，亚基分子质量为 60.60kD。
推测该酶由 4个相同亚基构成。该酶最适温度为 45℃，最适 pH值为 7.5，以过氧化氢为底物测定该酶的表观 Km为
34mmol/L。结论：成功分离纯化获得过氧化氢酶，该酶具有良好的热稳定性和酸碱耐受性。
关键词：芦荟；过氧化氢酶；分离纯化；性质
　　
Isolation, Purification and Enzymological Characterization of Catalase from Aloe
ZHU Hong，LI Xiang-yun，DENG Yu，WANG Song，FU Wei-li，
TANG Liang-ting，GAO Zhao-wei，TANG Yun-ming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering
Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)
Abstract ：Objective: To obtain catalase from aloe and explore its enzymaological properties. Methods: Catalase was isolated
and purified through fractional ammonium sulfate precipitation, ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose, ion-
exchange chromatography on CM-Sepharose and gel filtration on Sephacryl S-200. SDS-PAGE was used to identify the purity
and relative molecular mass of the catalase. Results: Aloe catalase revealed a 228.05-fold purification and a recovery rate of
activity of 14.10%. The specific activity of the purified aloe catalase was measured to be 17427.30 U/mg. Aloe catalase was
characteristic of 239.90 kD relative molecular mass and 60.60 kD molecular mass of subunit. This demonstrates that the enzyme
consists of four identical subunits. Moreover, the optimal reaction temperature and pH of the enzyme were 45 ℃ and 7.5, and
its apparent Km towards hydrogen peroxide as the substrate was 34 mmol/L. Conclusion: Aloe catalase has been successfully
isolated and purified, which exhibits excellent thermostability and acid-alkali tolerance.
Key words：aloe；catalase；purification；characterization
中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)05-0206-05
收稿日期：2009-06-10
基金项目：重庆市科委科技攻关项目(CSCT，2004AC1012)
作者简介：朱鸿(1985—)，男，硕士研究生，主要从事酶与酶工程研究。E-mail：solary@swu.edu.cn
*通信作者：唐云明(1960—)，男，教授，博士，主要从事酶与酶工程研究。E-mail：tbr ight@swu .edu .cn
芦荟(Aloe barbadensis Miller)是一种多年生百合科
多肉质的草本植物，它是一种集药用、美容、保健、
观赏于一身的纯天然绿色植物。自古以来，在中国民
间就被广泛用于护发、治疗皮肤疾病。芦荟的汁液中
含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、活性
酶以及对人体十分有益的微量元素。
过氧化氢酶(Catalase，EC1.11.1.6)又称触酶，是一类
广泛存在于动物、植物以及微生物体内的末端氧化酶[1]。
该酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关
键酶之一，并在食品、医药、纺织、造纸、环保等
行业具有重要的应用[ 2 -3 ]。它是一种抗氧化剂，催化细
胞内过氧化氢发生歧化反应，使之转化为氧气和水，防
止细胞的过氧化。因此它与 SOD、POD、ASP一起被
称为生物体的酶保护系统[4 ]。
近几年，过氧化氢酶在各个行业都得到广泛的应
用，特别是在纺织印染业和食品业。但是，目前纺织
印染企业与食品企业生产所用的过氧化氢酶产品几乎都
依赖进口，市场为外商垄断。因此国内高品质过氧化
207※生物工程 食品科学 2010, Vol. 31, No. 05
氢酶制品的研制是市场的需要，也是企业降低成本的需
要。在国内，发酵法尚处于实验室研究阶段，并无工
业化生产。从动物原料中提取过氧化氢酶的研究于近几
年才得到重视，而植物材料杂蛋白含量较动物原料少，
分离纯化更简单。目前对芦荟过氧化氢酶的分离纯化尚
未见报道。因此本实验以芦荟为原料对其过氧化氢酶进
行分离纯化和性质研究，为规模化生产该过氧化氢酶制
品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)采自西南大学
校园，以其叶片作为提取过氧化氢酶的材料。
DEAE-Sepharose、CM-Sepharose、Sephacryl S-
200、分子量标准品 GE Healthcare公司；三羟甲基氨
基甲烷 Farco公司；蛋白质SDS-PAGE标准品 Promega
公司；丙烯酰胺、甲叉 -双丙烯酰胺 Fluka公司；其
他试剂均为国产分析纯。
缓冲液系统：pH7.2磷酸缓冲液；pH8.0 Tris-HCl缓
冲液；pH3.0～7.0柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液；pH9.0～10.5
甘氨酸 -NaOH缓冲液。
1.2 方法
1.2.1 粗提液的制备
称取新鲜芦荟叶 168g，用自来水洗净，再用消毒
双蒸水清洗数次。剪碎，然后以 1:1(m/V)的比例加入已
经预冷的 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2)。匀浆后，4℃
冰箱静置抽提 1h，12000× g离心 1h，收集上清液即
得粗提液。
1.2.2 硫酸铵分级沉淀
粗提液加入固体硫酸铵至 30%饱和度，4℃冰箱静
置 2h后，12000× g离心 30min，收集上清液。再加
入硫酸铵至 40%饱和度，4℃冰箱静置 2h，12000× g
离心 30min，沉淀用 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2)溶
解，4℃蒸馏水透析过夜即得到初酶液。
1.2.3 DEAE-Sepharose离子交换层析
DEAE-Sepharose离子交换柱按产品说明书要求处
理。装柱后，用 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)平衡 4个
柱体积，酶液样品上DEAE-Sephrose柱(2.6cm× 14cm)，
每次上样 10mL，用0～1.0mol/L线性梯度的NaCl溶液(内
含 0.05mol/L，pH7.2的磷酸缓冲液)进行梯度洗脱，流
速 30mL/h，每管收集 5mL，紫外检测波长为 280nm。
最后需测定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量，收集活性
较高的各管酶液，4℃透析过夜，冷冻浓缩后进行阳离
子交换层析。
1.2.4 CM-Sepharose离子交换柱层析
CM-Sepharose离子交换柱按产品说明书要求处理。
上柱样品和装柱后的操作方法同 1.2.3节。收集活性较高
的各管酶液，透析、冷冻浓缩后进行凝胶过滤。
1.2.5 Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析
Se phac ryl S-200 凝胶柱按产品说明书进行装柱
(16mm× 835mm)处理后，每次上样 3mL。用磷酸缓
冲液(0.05mol/L，pH7.2)进行洗脱，流速 18mL/h，每管
收集 3mL。测定每管过氧化氢酶活性和蛋白质含量；收
集活性较高的各管酶液，4℃透析，冷冻干燥，得到
过氧化氢酶纯品。
1.2.6 过氧化氢酶活性的测定
参照文献[5]略有改动，以过氧化氢为底物，采用
钼酸铵终止法进行测定。酶反应总体积为 1.2mL，取
0.16mol/L过氧化氢(用 pH7.2，0.05mol/L的 PBS配成)
溶液 1mL，37℃水浴保温 5min，加入 200μL过氧化氢
酶液，立即混匀，并开始计时 1min，然后加入 1mL
32 .4mm ol / L 的钼酸铵溶液终止反应，室温下在波长
405nm处测定其OD值。以先加入钼酸铵，再加入酶液
为对照。以每分钟催化分解 1μmol过氧化氢所需的酶量
为一个酶活力单位。
1.2.7 蛋白质含量的测定
采用 Lowery法[6]和分光光度法[7]，以牛血清白蛋白
为标准样品。
1.2.8 芦荟过氧化氢酶的纯度鉴定
采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定[ 8 ]，
SDS-PAGE采用 12%的凝胶。
1.2.9 芦荟过氧化氢酶的分子量测定
分子量测定采用凝胶过滤法[9-10]。芦荟过氧化氢酶
亚基分子量的确定采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测
得，凝胶浓度为 1 2 %。
2 结果与分析
2.1 芦荟过氧化氢酶的分离纯化
图1 DEAE-Sepharose离子交换层析图谱
Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatogram for the first
catalase purification
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
蛋白含量
酶活力
蛋
白
含
量
/(
m
g/
m
L
)
体积 /mL
0 50 100 150 200 250 300 350
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
过
氧
化
氢
酶
活
力
/
U
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
N
aC
l浓
度
/
(
m
o
l
/
L
)
2010, Vol. 31, No. 05 食品科学 ※生物工程208
芦荟初酶液经DEAE-Sepharose柱层析的洗脱图谱
如图 1所示；所得过氧化氢酶酶液经 CM-Sepharose离
子交换柱层析的洗脱图谱见图 2；再经 Sephacryl S-200
凝胶过滤结果见图 3。最后所得过氧化氢酶经SDS-PAGE
鉴定(图 4)达到电泳纯。整个纯化结果见表 1。以该纯
品为对象进行芦荟过氧化氢酶性质研究。
纯化步骤
蛋白质量/ 酶总活 比活力/ 回收率/ 纯化
m g 力 /U (U/mg) % 倍数
粗酶液 1278.90 97728.25 76.42 100.00 1.00
30%硫酸铵沉淀 1049.40 94380.00 89.94 96.60 1.18
40%硫酸铵沉淀 154.36 92782.40 601.05 94.90 7.87
DEAE-Sepharose 离子交换层析 28.00 35122.00 1261.60 35.90 16.51
CM-Sepharose 离子交换层析 8.61 28744.71 3468.10 29.40 45.38
Sephacryl S-200凝胶层析 0.79 13808.39 17427.30 14.10 228.05
表1 芦荟过氧化氢酶的纯化
Table 1 Summary of isolation and purification of catalase from aloe
通过匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、
DEAE-Sepharose离子交换层析、CM-Sepharose离子交
换层析及 Sephacryl S-200凝胶过滤层析，从库拉索芦荟
(Aloe barbadensis Miller)中纯化出电泳纯的过氧化氢酶，
回收率为 14.10%，纯化倍数为 228.05，比活力达到了
17427.30U/mg。在纯化过程中采用 pH7.2缓冲体系，使
用DEAE-Sephrose离子交换柱层析和CM-Sephrose离子
交换层析联用方法，层析图谱表明目的蛋白均形成穿流
峰，没有被两种离子交换树脂吸附。推测该过氧化氢
酶等电点在 pH7.2附近。在 pH7.2条件下，目的蛋白只
有少量带电荷基团，两种离子交换树脂不能有效吸附目
的蛋白。后续实验中调整缓冲体系 pH值为 8.0和 5.6分
别过DEAE-Sepharose离子交换层析和 CM-Sepharose离
子交换层析，目的蛋白可以被层析吸附但离子层析回收
率不超过 10 %，且回收蛋白比活力低。所以本实验采
用 pH7.2缓冲体系，利用大量杂蛋白被吸附，目的蛋白
首先洗脱出来的现象进行分离纯化，提高回收率和纯化
倍数。且在该条件下实验重复性好。最后使得纯化倍
数达到 228.05倍，比活力达 17427.30U/mg。
2.2 芦荟过氧化氢酶的性质
2.2.1 芦荟过氧化氢酶分子质量和亚基分子质量
经 Sephacryl S-200凝胶过滤法测定芦荟过氧化氢酶
的全酶分子质量为 239.90kD。经 SDS-PAGE测定其亚基
分子质量为 60.60kD，说明芦荟过氧化氢酶由 4个相同
的亚基组成。Switala等[11]研究表明，过氧化氢酶分子
质量一般为 200～340kD，芦荟过氧化氢酶分子质量符
合 Switala等[11]的研究。本结果与鸭肝过氧化氢酶亚基
分子质量[12](62.5kD)和枯草芽孢杆菌过氧化氢酶亚基分子
质量[13](63kD)比较相近，但与贻贝过氧化氢酶亚基分子
质量[14](76kD)有一定的差异，这说明种属之间的不同可
能会导致相对分子量之间的差异。
2.2.2 芦荟过氧化氢酶的最适反应 pH值
pH值是影响酶活力的主要参数之一，在pH3.0～10.6
的范围内进行芦荟过氧化氢酶催化过氧化氢反应，考察
过氧化氢酶催化反应的最适 pH 值范围。以酶活力最高
值为 100%，计算不同 pH 值条件下的相对酶活力，结
M. 标准蛋白；1. 磷酸酶 b 97.20kD；2. 牛血清白蛋白 66.40kD；
3. 卵清蛋白 44 .30kD；4. 碳酸酐酶 29 .00kD；5. 胰蛋白
酶 20 .1 0kD；6 . 溶菌酶 14 .30kD；S. 芦荟过氧化氢酶。
图4 SDS-PAGE电泳图
Fig.4 SDS-PAGE pattern of finally purified catalase from aloe
6
5
4
3
2
1
S M
图5 pH值对芦荟过氧化氢酶相对酶活力的影响
Fig.5 Effect of pH on aloe catalase activity
100
80
60
40
20
0
相
对
酶
活
力
/%
pH
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
图2 CM-Sepharose离子交换层析图谱
Fig.2 CM-Sepharose ion-exchange chromatogram for the second
catalase purification
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
蛋
白
含
量
/(
m
g/
m
L
) 蛋白含量
酶活力
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
N
aC
l浓
度
/
(
m
o
l
/
L
)
体积 /mL
0 50 100 150 200 250 300 350
400
350
300
250
200
150
100
50
0
过
氧
化
氢
酶
活
力
/
U
图3 Sephacryl S-200凝胶过滤层析
Fig.3 Sephacryl S-200 gel filtration chromatogram for the third
catalase purification
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
蛋
白
含
量
/(
m
g/
m
L
)
体积 /mL
0 50 100 150 200 250 300
350
300
250
200
150
100
50
0
过
氧
化
氢
酶
活
力
/
U
蛋白含量
酶活力
209※生物工程 食品科学 2010, Vol. 31, No. 05
果见图 5。由图 5 可见，该酶的最适 pH 值为 7.5，pH
值在5.5～8.5的范围内过氧化氢酶的相对酶活力达50%以
上，超出该范围酶活性急剧下降。
2.2.3 芦荟过氧化氢酶在不同 pH值下的稳定性
酶在不同 pH值环境下的稳定性是酶应用的重要指
标。将纯化的酶液与 pH3.0～10.5的缓冲体系相混合，
4℃放置 24、48、72h后，取适量酶液在最佳反应条件
pH7.5时测定酶活。以酶活性最高值为 100%，计算不
同 pH 值条件下的相对酶活力，结果见图 6。该过氧化
氢酶在所测 pH 值范围内能较好地保持其酶活性，表明
该酶的酸碱耐受性较强；7 2 h 孵育后，酶活性有所降
低，但相对酶活力仍在 40%以上；pH6.0～7.0时，酶
活性最稳定。
2.2.4 芦荟过氧化氢酶的最适反应温度
分别测定过氧化氢酶在 20～70℃下的酶活力，其他
条件不变。以酶活力最高值为 100%，计算在不同温度
下的相对酶活力，结果见图 7。最适温度为 45℃。40～
55℃的范围内过氧化氢酶的相对酶活力均在 90%以上。
2.2.5 芦荟过氧化氢酶热稳定性
酶液在 4～80℃温度下分别孵育 10、30、60min后
测定活性。4℃的酶活力为 100%，不同孵育条件下酶
的相对酶活力见图 8。4℃、20～80℃下，酶活力稳定，
保温 60min活性保留原有酶活力的 80%以上；60℃时
10min酶活力保持在 80%以上，随着温度的升高，酶活
力逐渐降低，温度至 70℃时，酶完全失活。表明该酶
具有较高的热稳定性。
2.2.6 酶反应动力学性质
用 5.0～30.0mmol/L的过氧化氢在 pH7.5，45℃条件
下与酶作用 1min，用 Lineweaver-Burk双倒数[15]作图法
求得该酶的表观 Km为 34mmol/L，如图 9。该酶的Km大
于蚯蚓[16]过氧化氢酶Km和鸭肝[12]过氧化氢酶Km，说明
该过氧化氢酶与底物过氧化氢结合专一性较高。
3 结 论
芦荟的开发已广泛引起全世界的关注，本研究选用
库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)，从中提取的过氧
化氢酶比活力高，具有较高的 p H 值耐受性和热稳定
性，表明芦荟过氧化氢酶具有较高的利用价值。该材
料种植广泛，四季易得，杂蛋白含量相对较少，易纯
化出高品质过氧化氢酶。并且可通过无性繁殖快速扩大
芦荟种植规模，为纯化过氧化氢酶提供可靠材料来源，
可有效降低工业生产成本。国家食品药品监督管理局规
定芦荟中仅有库拉索芦荟可用于食品生产加工。说明该
材料安全，从中纯化出过氧化氢酶是高效，无毒的生
物催化剂。该酶在食品、造纸、纺织、化工及废水
处理等行业有广泛的应用前景。因此研究开发其工业应
用价值具有较重要的科学意义和实践价值。
图8 芦荟过氧化氢酶的热稳定性
Fig.8 Thermal stability of aloe catalase
4℃
30℃
40℃
50℃
60℃
保温时间 /min
0 10 20 30 40 50 60 70
100
80
60
40
20
0
相
对
酶
活
力
/%
图9 芦荟过氧化氢酶催化过氧化氢的 Lineweaver-Burk双倒数图
Fig.9 Lineweaver-Burk plot of aloe catalase towards H2O2 as the
substrate
0.0009
0.0008
0.0007
0.0006
0.0005
0.0004
0.0003
0.0002
0.0001
0
y=0.0034x+0.0001
R2=0.9948
l/
[V
]/
(m
in
/m
m
ol
)
l/[S]/(L/mmol)
－ 0.05 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
图6 不同pH值下芦荟过氧化氢酶的稳定性
Fig.6 pH stability of aloe catalase during storage at 4 ℃
24h
48h
72h
100
80
60
40
20
0
相
对
酶
活
力
/%
pH
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
图7 温度对芦荟过氧化氢酶活力的影响
Fig.7 Effect of temperature on aloe catalase activity
温度 /℃
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
100
80
60
40
20
0
相
对
酶
活
力
/%
2010, Vol. 31, No. 05 食品科学 ※生物工程210
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