全 文 ：第 30 卷　第 4 期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol.30　No.4
　2010 年 4 月 Journal of Central South University of Forestry &Technology Apr.2010
也门铁 ISS R-PCR反应体系的优化及应用
刘和平1 , 2 ,何业华1 ,胡桂兵1 ,林顺权1 ,黄建峰1 ,谢志亮1 ,林剑波2
(1.华南农业大学 园艺学院 , 广东　广州 510642;2.阳江职业技术学院 , 广东　阳江 529566)
摘　要:　运用单因素试验法对影响也门铁 ISS R-PCR扩增的各个因素进行了优化 ,优化体系为:25μL 反应体系
中 , Taq 酶浓度 0.04 U ·μL -1 、dNTPs 浓度 0.18 mmol · L-1 、引物浓度 0.4 μmo l· L-1 、Mg 2+浓度 2.0
mmol· L-1 、模板浓度 0.8 ng·μL-1 、甲酰胺浓度 1.6%、1×buffe r ,最后用 dd H2O 补足到 25 μL 。利用优化体系
和筛选的引物对也门铁及其嵌合体品种进行了 ISSR 扩增分析。
关键词:　生物科学与技术;也门铁;嵌合体;ISSR
中图分类号:　Q78;S792 文献标志码:　A 文章编号:　1673-923X(2010)04-0050-06
Optimization and application of inter simple sequence repeat
reaction system of Dracaena f ragrans
LIU H e-ping 1 , 2 , HE Ye-hua1 , HU Gui-bing1 , LIN Shun-quan1 , HUANG Jian-fe ng 1 ,
XIE Zhi-liang 1 , L IN Jian-bo2
(1.Colleg e of H or ticulture , South China Agricultural Univer sity , Guang zhou 510642 , Guangdong , China;
2.Yang jiang Vocational and Technical Colleg e , Yang jiang 529566 , Guangdong , China)
Abstract:The optimization of main influential fac tors of ISSR reaction system in Dracaena fragrans was studied.
The results show tha t the optimum concentr ations of components such as Taq DNA polymerase , dNTPs , pr ime r ,
Mg2+ , templa te DNA , formamide , 10×buff er(without Mg2+), in 25 μL reaction system were 0.04 U·μL -1 ,
0.18 mmol· L -1 , 0.4 μmol· L -1 , 2.0 mmol· L -1 , 0.8 ng·μL-1 , 1.6%, 2.5 μL , r espectively.Amplifica-
tions of 3 var ieties of Dracaena fragrans were achieved by using this optimum system.
Key words:biologic al science and technology;Dracaena fragrans ;chimera;ISSR
收稿日期:2009-10-29
基金项目:广东省科技攻关项目 ,项目编号 2006B20101003
作者简介:刘和平(1976-), 男 ,博士 , 讲师/工程师 ,湖南衡阳人 , 主要从事观赏植物生物技术 、栽培应用等教学 、科研工作;电话:
13922001953;Emai l:hort liu@yahoo.com.cn
通讯作者:何业华(1960-),男 ,湖南汉寿人 ,博士 ,教授 ,博士研究生导师 ,主要从事园艺植物生物技术研究 , 近年来在菠萝体细胞胚发生
体系及其遗传转化 ,龙血树属植物生物技术 ,黄皮离体培养及染色体分析 ,三华李品种改良等方面的取得了较好进展;电话:13660801794;
Email:heyeh ua@scau.edu.cn
　　ISS R(Inte r Simple Sequence Repeat ,简单序
列重复间区)是一种新型的 DNA 分子标记技术[ 1] ,
是利用基于 SSR(简单序列重复)而设计的寡核苷
酸引物来检测 2 个 SSR 之间的一段短 DNA 序列
差异。 ISS R技术具有 RAPD 和 SSR的优点 ,重复
性高 、操作简单以及模板 DNA用量少。目前 ISS R
分子标记多用于作物遗传多样性分析 、遗传图谱绘
制 、品种鉴定等多个方面 ,近些年的应用发展较快 。
也门铁 Dracaena fragrans ,又称香龙血树 、千
年木等 ,是龙舌兰科龙血树属常绿乔木 ,原产于几
内亚 ,20世纪 80年代初开始引进我国。也门铁叶
宽条形 、植株深绿而有光泽 、极其耐荫 、四季常青 、
管理简便 、生长慢 、寿命长 ,已成为我国重要的室内
观叶植物 ,我国市场上主要有 3个也门铁品种 ,即
金心也门铁 Dracaena f ragrans cv.massangeana
(简称“金心”)、金边也门铁Dracaena f ragrans cv.
l indenii(简称 “金边”)和普通也门铁 Dracaena
f ragrans(简称“普通”),前两个品种是普通也门铁
的嵌合体变异[ 2-3] 。目前 ,有关也门铁及其嵌合体
离体繁殖技术的报道很多[ 2-3] ,但对其嵌合现象分
子机理的研究报告基本没有。
由嵌合体导致的花叶等彩斑现象是观赏植物
重要的经济性状 ,从观赏植物的角度看 ,彩斑的形
成可以极大地提高植物的观赏价值。尽管彩斑是
自然界一个普遍的现象 ,但其形成机理却一直不太
清楚 ,更较少从分子方面寻找机理 。
本实验以也门铁基因组 DNA 为模板 ,建立和
优化了适合也门铁 ISS R分析的体系 ,利用优化体
系对也门铁及其嵌合品种进行了 ISS R扩增 ,旨在
为 ISS R等分子标记技术应用于也门铁及其近缘植
物开展研究提供参考 ,也为 ISS R等技术应用在其
他花叶和嵌合体彩斑 、条斑等观赏植物上的研究提
供参考。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
供试材料是 2年生盆栽金心也门铁 、金边也门
铁和普通也门铁 。
DL 2000 M arker 、Taq DNA 聚合酶 、dN TPs 、
buf fer 、Mg2+等购自 Takara公司 ,甲酰胺为鼎国生
物技术有限公司产品 ,琼脂糖购自西班牙 Biow est
公司 ,100条 ISS R引物参照加拿大哥伦比亚大学
(UBC)提供的序列由上海生工生物工程有限公司
合成 。
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取
采用改良 CTAB 法提取叶片基因组 DNA ,
0.8%的琼脂糖凝胶电泳 ,与λDNA Marker 浓度梯
度进行对比检测纯度及完整性 , 并调整基因组
DNA 浓度至 5 ng ·μL -1 。
金边也门铁分别提取叶片黄色部分和绿色部
分的基因组 DNA 。
1.2.2　ISSR- PCR原初扩增体系及反应程序
参考山楂 、苹果 、莲雾 、荔枝等植物的 ISS R体
系[ 4-7] ,初步设定也门铁扩增体系为:Taq DNA 聚
合酶 浓度 0.05 U · μL-1 、 dN TPs 浓 度 0.3
mmo l·L-1 、引物浓度 0.4 μmol ·L -1 、Mg2+浓度
2.0 mmol·L-1 、模板浓度 1 ng ·μL -1 、甲酰胺浓
度 0%, 1×buffer加 2.5μL ,最后用 ddH2O补足到
25μL。
PCR扩增程序为:94 ℃, 5 min;按 94 ℃、1
min , 48 ～ 62 ℃、l min , 72 ℃、1.5 min , 35 个循环;
72 ℃,10 min;18 ℃,30 min ,保存 。
扩增结束后向 PCR 管中加入 3 μL 上样缓冲
液 ,混匀 ,取 20 μL 点样 , 1.5%～ 1.8%凝胶电泳
2.5 ～ 3 h ,EB染色后在自动凝胶成像系统上观察并
拍照记录。
1.2.3　ISSR-PCR反应体系优化
在原初扩增体系的基础上采用单因素试验法 ,
对主要参数设置了如下:引物设置 0.1 、0.2 、0.3 、
0.4 、0.5 μmol ·L-1 5个梯度;dN TPs设置 0.12 、
0.16 、0.20 、0.24 、0.28 、0.32 mmol ·L-1 6个梯度;
Taq DNA 聚合酶设置 0.02 、0.03 、0.04 、0.05 、0.06
U ·μL-1 5个梯度;Mg2+浓度设置 1.0 、1.5 、2.0 、
2.5 、3.0 mmol·L-1 5个梯度;模板设置 0.4 、0.6 、
0.8 、1.0 、1.2 ng ·μL-1 5个梯度;甲酰胺设置 0%、
0.8%、1.6%、2.4%和 3.2%5个梯度 。其他条件 、
程序与原初反应一样 。
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA 纯度及浓度检测
如图 1所示 ,采用改良 CTAB法提取的也门铁
基因组 DNA 电泳检测时主带明显 ,无弥散的荧光
出现 ,加样孔清晰 ,表明所提取的 DNA 样品较纯 ,
基本没有多糖等杂质 ,无降解和 RNA 污染 ,且各品
种基因组 DNA 的泳动距离基本一致 。说明所提基
因组 DNA 完整性好 ,纯度较高 , 完全符合 ISSR-
PCR实验的要求。
根据提取的基因组 DNA 原液的检测情况 ,用
灭菌双蒸水进行稀释 ,稀释后的检测情况如图 2所
示 ,最后调整基因组 DNA浓度为 5 ng ·μL-1 。
2.2　Mg 2+浓度优化
本研究利用普通也门铁基因组 DNA为模板 ,对
51第 4 期　 　刘和平 ,等:也门铁 ISSR-PCR反应体系的优化及应用
泳道 1～ 6:λDNA 标准(依次为 50 、75 、100 、125 、150 、200
ng);泳道 7～ 10:普通(依次为 1 、2 、3 、4μL);泳道 11 ～ 14:
金心(依次为 1 、2 、3 、4μL);泳道 15～ 18:金边(依次为 1 、
2 、3 、4μL)
图 1　基因组 DNA电泳图
Fig.1　The electrophoretogram of genome DNA
泳道 1～ 5:λDNA标准(依次为 12.5 、25 、50、100、150 ng);泳
道 6～ 8:普通(依次为 2 、4 、8μL);泳道 9～ 11:金心(依次为
2 、4 、8μL);泳道 12～ 14:金边(依次为 2 、4 、8μL)
图 2　基因组 DNA 稀释后电泳图
Fig.2　The electrophoregram of diluted samples
不同浓度的 Mg2+进行 ISSR扩增。从图 3可以看
出 ,Mg2+浓度低于 1.5 mmol·L-1时 ,扩增条带少;
Mg2+浓度高于 2.5 mmol ·L-1时 ,非特异性条带增
加 ,且条带变得不清晰 。Mg2+浓度在 1.5 ～ 2.0
mmol·L-1时 ,扩增的条件清晰 、稳定 ,非特异性带
少。本研究采用的 Mg2+浓度为 2.0 mmol·L-1 。
2.3　dN TPs浓度优化
本试验设计了 0.12 、0.16 、0.20 、0.24 、0.28 、
0.32 mmol·L -1共 6个 dN TPs浓度梯度。从 IS-
SR扩增结果(见图 4)可以看出 ,当 dN TPs浓度低
于 0.12和高于 0.24 mmol · L-1时 ,条带较少 ,且
条带变弱 。dN TPs浓度在 0.16 ～ 0.20 mmol·L-1
时 ,扩增的条件多 、稳定 、清晰 ,本研究确定 dN TPs
的浓度为 0.18 mmo l·L-1 。
2.4　Taq DNA聚合酶浓度优化
本实验设置了 5 个 Taq DNA 聚合酶浓度梯
度 ,分别为 0.02 、0.03 、0.04 、0.05 、0.06 U ·μL-1 。
从扩增结果(见图 5)可以看出 , 5 个浓度都能扩增
出条带 , 但当 Taq DNA 聚合酶浓度高于 0.06
M:DL2000 Mark er;泳道 1 ～ 5:Mg2+梯度(分别为
1.0 、1.5 、2.0 、2.5 、3.0 mmol· L -1);泳道 7～ 11:重
复泳道 1～ 5
图 3　不同浓度 Mg 2+ ISSR扩增结果
Fig.3　The result of ISSR amplification with dif-
ferent concentration of Mg2+
M:DL2000 Marker;泳道 1 ～ 6:dN TPs梯度(分别为
0.12 、0.16 、0.20 、0.24 、0.28 、0.32 mmol · L -1);泳
道 8 ～ 12:dNT Ps 梯度(分别为 0.16 、 0.20 、0.24 、
0.28 、0.32 mm ol· L -1)
图 4　不同浓度 dNTPs ISSR扩增结果
Fig.4　The result of ISSR amplification with dif-
ferent concentration of dNTPs
U ·μL-1时 ,条带拖带比较严重 ,非特异扩增增加;
Taq DNA 聚合酶浓度为 0.04 U ·μL-1时 ,条带相
对明亮 、清晰 ,所以本研究确定 Taq DNA 聚合酶的
浓度为 0.04 U ·μL -1 。
2.5　模板浓度优化
本实验设置了 5个模板浓度梯度进行优化反
应(见图 6)。结果显示:在 25 μL 的反应体系中 ,当
模板浓度低于 15 ng 时 ,条带弱 、不清晰 ,扩增条带
52 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报　　　　 　第 30 卷
少;当模板浓度高于 30 ng 时 ,条带开始出现较多的
拖带 ,非特异性扩增增多 。当模板浓度在 15 ～ 25
ng 时 ,扩增条带清晰 、稳定 、条带多 ,本研究确定 20
ng ·(25μL)-1(即 0.8 ng ·μL-1)为优化体系模板
DNA 的浓度。
M:DL2000 Marker;泳道 1～ 5:Taq梯度(分别为 0.02 、0.03 、
0.04 、0.05 、0.06 U ·μL -1);泳道 7～ 11:重复泳道 1～ 5
图 5　不同浓度 Taq酶 ISSR 扩增结果
Fig.5　The result of ISSR amplification with different
concentration of Taq DNA polymerase
M:DL2000 Marker;泳道 1 ～ 5:模板梯度(分别为 0.4 、0.6 、
0.8 、1.0 、1.2 n g·μL -1)
图 6　不同浓度模板 ISSR扩增结果
Fig.6　The result of ISSR amplification with different
concentration of template DNA
2.6　引物浓度优化
本实验设置了 5个引物浓度梯度进行优化反
应(见图 7), 结果显示:引物浓度为 0.1 ～ 0.5
μmol·L-1时均能扩增出条带 ,但在引物浓度低于
0.2 μmo l· L-1时 , 扩增条带少 ,引物浓度为 0.3
μmol·L-1时 ,分子量小的条带不清晰 ,引物浓度在
0.4 ～ 0.5 μmo l·L -1时 ,扩增条带清晰 、稳定 ,故本
试验最后确定引物浓度 0.4 μmo l·L-1为 ISSR反
应的最适引物浓度。
M :DL2000 Marker;泳道 1～ 5:引物梯度(分别为 0.1 、
0.2 、0.3 、0.4 、0.5μmol· L-1)
图 7　不同浓度引物 ISSR扩增结果
Fig.7　The result of ISSR amplification with dif-
ferent concentration of primer
2.7　甲酰胺浓度优化
本试验设置了 0 、8 、1.6 、2.4和 3.2%5个甲酰
胺浓度梯度(见图 8)。结果表明 ,加入甲酰胺的扩
增条带亮度增强 ,背景噪音干扰明显降低;当甲酰
胺浓度高于 2.4%时 ,条带(主要是弱带)减少;甲酰
胺浓度在 0.8%～ 1.6%之间 ,扩增条带清晰 ,背景
干扰少。本试验确定甲酰胺浓度为 1.6%。
M:DL2000 Marker;泳道 1～ 5:甲酰胺梯度(分别为 0 、
0.8%、1.6%、2.4%、3.2%);泳道 7～ 11:重复泳道 1～ 5
图 8　不同浓度甲酰胺扩增结果
Fig.8　The result of ISSR amplification with dif-
ferent concentration of formamide
2.8　引物退火温度优化
从图 9可以看出 ,退火温度升高 ,小片段增加。
引物 835在退火温度为 48 ℃时 ,扩增条件少且模
糊;当退火温度在 52 ℃时 ,条带较清晰 ,所以引物
53第 4 期　 　刘和平 ,等:也门铁 ISSR-PCR反应体系的优化及应用
835 适宜的退火温度为 52 ℃, 而其 Tm 值是
56.16 ℃。
M :DL2000 Marker;泳道 1～ 3:48℃(依次为普通 、金
心 、金边);泳道 4～ 6:50℃(依次为普通 、金心 、金边);
泳道 7～ 9:52℃(依次为普通 、金心 、金边)
图 9　退火温度对引物 835扩增的影响
Fig.9　Effect of annealing temperature on ampli-
fication of primer 835
2.9　优化体系稳定性检测
对优化后的体系进行稳定性检测 ,从图 10 可
以看出 ,优化后体系重复性好 ,能扩增清晰 、稳定的
条带 ,且背景清楚 、干扰少 。
M:DL2000 Marker;泳道 1～ 3:普通
图 10　ISS R优化体系稳定性检测
Fig.10　Examination of stability of optimized ISSR system
2.10　引物的筛选
利用优化的体系对 100条 ISSR进行筛选。部
分引物筛选扩增的效果如图 11所示。
M:DL2000 M arker;泳道 1～ 4:引物 869;泳道 5～ 8:引物
810;泳道 9～ 12:引物 821;泳道 13～ 16:引物 811;泳道 17
～ 20:引物 815(每条引物的 4条泳道为 4个重复)
图 11　部分引物筛选效果
Fig.11　The PCR results of some primers
2.11　ISSR扩增的应用
利用优化体系筛选出能扩增清晰 、稳定条带的
引物 36条 。利用这些引物对 4 份材料(普通 、金
心 、金边绿色部分 、金边黄色部分)进行扩增(见图
12),都能扩增出清晰 、稳定的条带 ,且分子量主要
集中在 250 ～ 2 000 bp 之间 ,但没有多态性位点 。
M:DL2000 Marker;泳道 1～ 4:引物 820;泳道 5～ 8:引物
825;泳道 9～ 12:引物 828;泳道 13～ 16:引物 841;泳道
17～ 20:引物 842;泳道 21～ 24:引物 847(每条引物的 4
个泳道分别为模板普通 、金心 、金边绿部 、金边黄部)
图 12　ISSR扩增部分结果
Fig.12　Results of ISSR-PCR with some primers
3　结论与讨论
通过单因子试验法 ,得到也门铁 ISSR-PCR反
应体系优化如下:在 25 μL 反应体系中 , Taq DNA
聚合酶浓度是 0.04 U ·μL-1 、dN TPs 浓度是 0.18
mmo l·L-1 、引物浓度是 0.4 μmo l· L-1 、Mg2+浓
度是 2.0 mmol ·L-1 、模板浓度是 0.8 ng ·μL-1 、
甲酰胺浓度是 1.6%、1×buffer ,最后用 dd H 2O 补
足到 25 μL。用优化体系扩增的条带清晰稳定。
本试验发现 ,在反应体系中加入 1.6%的甲酰
胺 ,可以降低电泳检测的背景干扰 ,且对扩增的条
带数量影响不大 ,但要考虑浓度 ,甲酰胺浓度太高
(大于 4%)则扩增条带数减少。这与在莲雾上的
ISSR-PCR结果一致[ 6] 。
54 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报　　　　 　第 30 卷
PCR的退火温度依赖于引物长度 、序列 、碱基
组成和引物的浓度[ 8] 。 ISSR引物在合成时都会提
供一个退火温度的理论值(Tm),但实际温度与理论
值并不相同 ,典型的退火温度比 Tm 值低 5 ℃,并且
一般在 55 ～ 70 ℃效果好 ,较高的退火温度会增强
引物的准确复性 ,因而提高了扩增带型的分辨率与
特异性。在本研究中 ,引物 835 扩增也门铁的适宜
退火温度为 52 ℃,而其 Tm 值是 56.16 ℃。
本研究发现 ,引物 801 、802 、803 、804 、805 、806 、
831 、833 、837 、838 、839 、871 、872 、882 、883 等 15个
引物无法扩增出产物 ,这与在莲雾 、苹果等上的 IS-
SR结果基本一致[ 5-6 , 9-16] 。
利用优化的体系筛选 100条引物 ,得到能扩增
出稳定 、清晰条带的引物 36条 ,利用这些引物对也
门铁及其嵌合品种进行 ISSR 扩增 ,没有得到多态
性位点。所以也门铁及其嵌合体品种之间在 ISS R
上没有差异 ,金边也门铁叶片的黄色部分和绿色部
分之间在 ISSR上也没有差异。
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[本文编校:邱德勇]
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