全 文 ：中国农学通报 2012,28(24):207-212
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
紫苏(Perilla frutescens)是一种具有特异香气的唇
形科一年生草本植物，作为一种传统的药用植物在中
国已有两千多年的种植历史，因其具有的多种营养成
分和特有的活性物质，现作为一种多用途经济植物越
来越受到人们的关注 [1]。迷迭香酸(Rosmarinic acid，
RA)是紫苏中一种具有多方面生物活性的次生代谢产
物，其化学名称为[R(E)]α-[[3-(3,4-二羟基苯基)-1-氧
基金项目：国家高技术研究发展计划（“863”计划）“生物酶法食品添加剂和配料高效安全制造”(2007AA100401)。
第一作者简介：吕晓玲，女，1960年出生，安徽省人，教授，硕士，主要从事食品与生物化学方面的教学与研究工作。通信地址：300457天津经济技术
开发区第十三大街29号天津科技大学食品工程与生物技术学院，Tel：022-60601445，E-mail：lxling@tust.edu.cn。
收稿日期：2011-12-13，修回日期：2012-02-21。
紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析
吕晓玲 1，郝 磊 1，王 芳 1，黄 晨 2
（1天津科技大学，天津 300457；2天津出入境检验检疫局，天津 300461）
摘 要：为获得紫苏迷迭香酸合成途径中的酪氨酸氨基转移酶基因，本研究采用同源克隆的方法，根据已
报道的其他物种的TAT基因序列设计并合成简并引物，成功克隆得到了紫苏TAT基因片段（GenBank登
录号：JN032113.1），该片段长为579 bp，共编码193个氨基酸残基，并命名为PfTAT。氨基酸序列比对分
析发现其与彩叶草、丹参、拟南芥和罂粟的一致性分别为97%、94%、69%和58%，系统进化树分析表明
PfTAT与唇形科植物的亲缘关系最近。采用半定量RT-PCR法分析PfTAT在紫苏的根、茎、叶中均有表
达，且叶中的表达量较高，内源性植物激素信号分子对PfTAT表达量影响的实验表明，脱落酸、水杨酸处
理均能够不同程度得上调PfTAT转录水平的表达。
关键词：紫苏；迷迭香酸；酪氨酸氨基转移酶；基因克隆；序列分析；表达
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：2011-3725
Molecular Cloning and Expression Analysis of Tyrosine Aminotransferase Gene Fragment
in Perilla frutescens
Lv Xiaoling1, Hao Lei1, Wang Fang1, Huang Chen2
(1Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457;
2Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Tianjin 300461)
Abstract: The purposes of this paper was to obtain tyrosine aminotransferase (TAT) gene involved in
rosmarinic acid (RA) biosynthesis pathway from Perilla frutescens. According to a parallel analysis of the
amino acid sequence of TAT genes from other species, degenerate primers were designed and the fragment of
TAT gene in Perilla frutescens was successfully cloned by homology cloning method (GenBank accession No.
JN032113.1), and gene fragment was 579 bp encoding 193 amino acid protein. Sequence alignment revealed
that the deduced amino acid sequence of PfTAT was 97%, 94%, 69% and 58% identical to Coleus blumei,
Salvia miltiorrhiza, Arabidopsis thaliana and Papaver somniferum, respectively. Phylogenetic tree analysis
showed that PfTAT had the closest relationship with Lamiaceae plants. The PfTAT expressed in all the tested
tissues but at different levels with higher expression in leaf using the semi-quantitative RT-PCR analysis.
Further expression analysis revealsed that the signaling components such as abscisic acid (ABA) and salicylic
acid (SA) up-regulated the PfTAT transcript levels in different degree.
Key words: Perilla frutescens; rosmarinic acid; tyrosine aminotransferase; gene clone; sequence analysis;
expression
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代-2-丙烯基]氧基]-3,4-二羟基苯丙酸。
随着对紫苏中多种营养成分和生理活性物质的深
入研究，人们对迷迭香酸的研究也日益活跃，并且发现
其具有抗氧化[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、保护神经元
细胞[6]、抑制透明质酸酶等生物活性[7]，在药物、食品添
加剂、化妆品中的应用越来越受到人们的重视。但由
于紫苏生长的季节性强，易受环境条件的影响，并且紫
苏中迷迭香酸的提取工艺日趋成熟，其单位产量的提
升空间有限。目前国际上对于提高迷迭香酸产量的方
法也仅限于植物组织培养水平，使得迷迭香酸的大量
生产及广泛应用受到限制。
人们有关于迷迭香酸的生物合成途径的系统研究
开始于20世纪70年代，1970年，Ellis和Towers首次阐
述了迷迭香酸的生物合成途径，并推测生物合成迷迭
香酸的前体为苯丙氨酸和酪氨酸[8]。1994年，Petersen
等[9]通过对彩叶草的悬浮培养细胞的研究，全面地阐
述了迷迭香酸的生物合成途经，本途径包括酪氨酸支
路和苯丙氨酸支路 2条相互平行的支路，其中在酪氨
酸支路中，酪氨酸在酪氨酸氨基转移酶(TAT)的作用下
生成4-羟基苯丙酮酸，接下来在羟苯基丙酮酸还原酶
(HPPR)作用下生成 4-羟基苯乳酸；在苯丙氨酸支路
中，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)等的作用下经过
几步酶促反应生成 4-香豆酰CoA，2条支路的产物在
迷迭香酸合成酶(RSA)的催化作用下生成迷迭香酸。
随着人们对植物次生代谢产物基因工程的研究不
断深入，迄今为止已经从多种植物中分离克隆得到迷
迭香酸的生物合成酶基因，如丹参 [10]、彩叶草、拟南
芥[11]、马铃薯[12]、松树[13]、烟草[14]、大豆[15]和豌豆[16]等。对
紫苏中迷迭香酸生物合成途径苯丙氨酸支路中的苯丙
氨酸解氨酶基因(PAL)的相关研究已有报道[17]，但对紫
苏中迷迭香酸合成途径酪氨酸支路中的相关基因的研
究尚未见报道，本研究将对此酪氨酸支路中TAT的基
因片段进行克隆及表达分析，为完全阐明紫苏迷迭香
酸的生物合成途经及调控网络奠定基础，并为最终利
用基因工程手段提高紫苏中迷迭香酸的含量提供实践
经验。
1 材料与方法
1.1 材料
供试紫苏种子来自黑龙江省饶河县饶河农场，于
25℃的光照培养箱内培育 40天成幼苗，作为实验材
料。
1.2 试剂
RNAiso Plus，Ribonuclease Inhibitor，Reverse
Transcriptase M-MLV，Taq酶，DL2000 DNA Marker均
购自宝生物(TAKARA)公司；DNA凝胶回收试剂盒购
自爱思进生物技术有限公司；其他生化试剂均为市售
分析纯。
1.3 总RNA的提取及cDNA的合成
高质量的RNA是进行进一步分子生物学实验的
基础，使用RNAiso Plus提取试剂盒提取得到紫苏真
叶中的总RNA。取5 μL作为模板与1 μL的Oligo(dT)
18 Primer (50 μmol/L)混合，70℃保温 10 min后，迅速
在冰上急冷 2 min，然后依次加入 5×M-MLV Buffer，
dNTP Mixture，RNase Inhibitor，RTase M-MLV，添加蒸
馏水定容至 20 μL，离心混匀。cDNA合成的条件为：
42℃孵化 1 h，70℃保温 15 min后冰上冷却，于-20℃保
存备用。
1.4 引物设计
根据已报道的其他物种的TAT基因进行同源序
列的比对，并根据保守区域设计合成简并引物，上游
PfTAT-F：5’-CCGACNACCATAACGATT-3’，下 游
PfTAT-R：5’-AGCCTCTTAGCNGTCTCAGC-3’；根据
已报道的紫苏看家基因β-Actin序列(AB002819.1)设计
引物，上游ACTIN-F：5’-ATCTGGCACCACACCTTT-
3’，下游 ACTIN-R：5’-TCACGACCAGCAAGATCC-
3’。所有引物由上海生物工程技术有限公司合成。
1.5 目的基因片段的克隆
以反转录合成的cDNA作为模板，以引物PfTAT-F
和PfTAT-R进行PCR反应，扩增采用20 μL反应体系：
cDNA 2 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，引物PfTAT-F和
PfTAT-R各 2 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+）2 μL，Taq酶
0.2 μL，DEPC H2O 9.8 μL。PCR反应条件为：94℃预变
性2 min；94℃变性30 s，56℃退火50 s，72℃延伸 30 s，
共进行35个循环；然后72℃保持10 min。扩增产物用
2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并采用DNA凝胶回收试
剂盒回收目的扩增产物后送至上海生物工程技术有限
公司进行正反双向测序。
1.6 目的基因的生物信息学分析
利用 ClustalW2 在线工具 (http://www.ebi.ac.uk/
Tools/clustalw2/index.html)进行氨基酸序列的同源性
分析；然后使用Clustalx1.83对所得目的基因和其他植
物已知的基因序列进行多序列比对分析，通过
MEGA4.0软件NJ(Neighbor-Joining)法构建目的基因
的系统进化树。
1.7 目的基因的表达分析
分别从紫苏的根、茎、叶中提取总RNA，反转录合
成 cDNA，并以紫苏 β-ACTIN 作内标参照，采用
RT-PCR的方法比较分析PfTAT基因在紫苏中的空间
·· 208
吕晓玲等：紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析
表 达的差异。使用 200 μmol/L 水杨酸 (SA)和
100 μmol/L脱落酸(ABA)处理紫苏叶片，提取处理后
各时间段(4、8、24、48 h)的叶片总RNA，并提取未经处
理的叶片RNA作为对照，以紫苏β-ACTIN扩增序列作
为内参，采用半定量RT-PCR的方法考察不同处理对
PfTAT基因表达的影响。
2 结果与分析
2.1 紫苏叶片总RNA的提取
提取紫苏叶片的总RNA，取 2 μL RNA溶解液上
样电泳，电泳检测结果如图1所示，其中28S、18S条带
清晰，并且 28S条带的亮度大约是 18S条带亮度的 2
倍，说明提取的紫苏组织中总RNA完整性良好，可以
进行后续实验或者置于-80℃保存备用。
2.2 目的基因的克隆
根据已报道的唇形科植物的TAT核苷酸序列设
计的特异性引物，以紫苏叶片的cDNA为模板，扩增得
到特异性条带，见图 2，产物片段长度与预期相符，电
泳纯化以后进行测序，测得目的序列长度为579 bp，共
编码 193个氨基酸残基，并命名为PfTAT，将PfTAT基
因序列提交至GenBank数据库，登录号为 JN032113.1。
2.3 PfTAT基因的序列分析
通过ClustalW2在线分析工具对PfTAT和其他物
种的TAT进行的氨基酸序列比对发现PfTAT氨基酸序
列 与 彩 叶 草 CbTAT (AJ458993)，丹 参 SmTAT
(DQ334606)，拟南芥AtTAT (BAB10727)和罂粟PsTAT
(GU370929)的氨基酸序列一致性较高（图 3），分别为
97%、94%、69%和58%，故推断PfTAT为紫苏中的TAT
基因开放阅读框的一部分。
利用Clustalx1.83和MEGA4.0软件构建了 PfTAT
28 S
18 S
5 S
图1 紫苏叶片总RNA
M
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1
M. DNA Marker DL2000；1. PfTAT基因的PCR产物
图2 PfTAT基因片段扩增结果
图3 PfTAT氨基酸序列与其他植物的TAT氨基酸序列的比对结果
·· 209
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
与其他物种TAT蛋白的系统进化树[18-20]，如图 4，用以
分析PfTAT蛋白与其他物种的TAT蛋白之间的进化关
系。根据进化树的分析结果表明，所分析的这些蛋白
具有明显的种属特性，由肺炎克雷伯菌和大肠杆菌组
成的原核生物聚为一族，所有的植物聚为一族，在所分
析的植物中，拟南芥、大豆、紫花苜蓿形成了一个分支；
唇形科植物彩叶草、丹参和紫苏的进化距离较近，物种
之间的差异最小从而形成了一个分支，说明克隆得到
的 PfTAT基因片段是 TAT基因家族成员之一，推测
PfTAT蛋白与彩叶草和丹参的TAT蛋白执行相似的生
物学功能。
2.4 PfTAT基因的表达分析
采用半定量RT-PCR的方法对PfTAT基因在紫苏
根、茎、叶中的表达情况进行了分析，实验结果（图5A）
Glycine max
Medicago truncatula
Arabidopsis thaliana
Salvia miltiorrhiza
Coleus blumei
Perila frutescens
Papaver somniferum
Klebsiela pneumoniae
Escherichia coli100
91
100
99
92
68
lycine max
edicago truncatula
idopsis thali n
alvia miltiorrhiza
leus blumei
eerilla fr t cens
apaver somniferum
l siella pneumoniae
scherichia coli
TAT蛋白所属物种及 GenBank登录号：大豆/Glycine max (Q003328)；紫花苜蓿/Medicago truncatula (DQ006809)；拟南芥/Arabidopsis thaliana
(BAB10727)；丹参/Salvia miltiorrhiza (DQ334606)；彩叶草/Coleus blumei (AJ458993)；罂粟/Papaver somniferum (GU370929)；肺炎克雷伯菌/
Klebsiella pneumoniae(AF074934)；大肠杆菌/Escherichia coli(CAA27278)
图4 采用Neighbor-joining法构建的PfTAT和其他TAT蛋白的系统进化树
表明，PfTAT基因在紫苏的根、茎、叶中都有不同程度
的表达，且在叶片中的表达水平最高，其次是茎和根。
植物激素对 PfTAT表达的实验发现，100 μmol/L的
ABA能够上调PfTAT的转录水平，并在24 h达到高峰
后有所下降（图5B）；200 μmol/L SA也能够诱导PfTAT
的转录调节，且随着诱导时间的延长发生变化（图
5C）。可见紫苏的 TAT基因的表达受到信号分子如
ABA和 SA的调控，推测 PfTAT基因的启动子调控区
域具有与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件。
3 结论与讨论
本研究采用同源克隆的方法首次从紫苏中扩增得
到TAT基因片段 PfTAT，通过与其他物种TAT氨基酸
序列比对及进化树分析表明，发现所得片段与已报导
的其他植物中的TAT基因相应序列具有较高的一致
A
PfTAT
ACTIN
根 茎 叶
根 茎 叶
0
10
20
30
40
50
60
70
80
相
对
表
达
量
/%
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吕晓玲等：紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析
性，由此推断克隆得到的片段是紫苏 TAT的基因片
段，并且发现紫苏TAT基因与唇形科其他植物的亲缘
关系较近。
同时，研究还采用半定量 RT-PCR的方法分析
PfTAT在紫苏中的空间表达情况，结果发现 PfTAT是
一个组成型表达基因，且在叶中的转录表达最高，茎中
次之，在根中也有一定的表达。内源性的植物激素可
能诱导植物次生代谢产物的生成，目前已被实验证实
了的可诱导植物提高次生代谢产物的内源植物激素有
百余种，因此，人们可以通过对植物施加各种各样的信
号诱导来促进目标次生代谢产物的生成[21-22]。本实验
以紫苏叶片作为研究对象，考察了 ABA和 SA对
PfTAT基因调控的影响，发现ABA和 SA分别能够在
不同的测定时间点对PfTAT在转录水平上起到诱导表
达的作用。研究紫苏PfTAT基因在诱导因素下的表达
将为进一步阐述迷迭香酸生物合成途经的机制提供理
论基础。
本实验的研究将为下一步采取RACE等方法获得
紫苏 TAT基因片段的旁侧序列，并最终获得其全长
cDNA基因序列及对其进行更深入的生物信息学分析
和表达分析提供了实践经验，且为采用基因工程手段
提高紫苏次生代谢产物的产量提供理论基础，具有潜
在的重要意义。
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PfTAT
ACTIN
B
0 h 4 h 8 h 24 h 48 h
0 4 8 24 480
10
20
30
40
50
60
70
时间/h
相
对
表
达
量
/%
PfTAT
ACTIN
0 h 4 h 8 h 12 h2 h
C
0 4 8 24 480
10
20
30
40
50
60
70
时间/h
相
对
表
达
量
/%
图5 不同组织和处理条件下PfTAT的表达情况
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