全 文 ：书江西农业学报 2015，27(1) :28 ～ 31
Acta Agriculturae Jiangxi
海南槟榔炭疽病病原菌的鉴定
朱 辉，宋薇薇，余凤玉，刘 丽，覃伟权*
收稿日期:2014 － 07 － 11
基金项目:海南省重大项目“南药、黎药产业化关键技术研究”(ZDZX2013008) ;海南省重点项目“棕榈植物病虫害远程便捷识别系统的
开发及应用研究”(ZDXM20130049)。
作者简介:朱辉(1983─) ，男，助理研究员，硕士，从事槟榔有害生物综合治理研究。* 通讯作者:覃伟权。
(中国热带农业科学院 椰子研究所、海南省热带油料作物生物学重点实验室，海南 文昌 571339)
摘 要:研究了海南槟榔炭疽病的症状及其病原菌的形态特征、致病性，并分析了病原菌的 rDNA － ITS 序列。结果表
明:从海南槟榔的 5 个主要栽培区采集的 26 份病样中均获得了相似的分离物;病原菌分生孢子长卵圆形或圆柱形，大小为
(12． 0 ～ 21． 3)μm ×(3． 5 ～ 6． 0)μm，经回接后形成的症状与田间典型症状一致;病原菌在系统进化树上与胶孢炭疽菌处在
同一分支，同源性达 100%。综合该病原菌的形态特征、致病性和 rDNA － ITS区段的分析结果，将海南槟榔炭疽病的病原鉴
定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。
关键词:槟榔;炭疽病;病原菌;鉴定;rDNA － ITS序列
中图分类号:S763． 729． 1 文献标志码:A 文章编号:1001 － 8581(2015)01 － 0028 － 04
Identification of Pathogen of Arecanut Anthracnose in Hainan
ZHU Hui，SONG Wei － wei，YU Feng － yu，LIU Li，QIN Wei － quan*
(Coconut Ｒesearch Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences;
Hainan Key Laboratory for Biology of Tropical Oil Crops，Wenchang 571339，China)
Abstract:The symptoms of arecanut anthracnose in Hainan as well as the morphological characteristics and pathogenicity of
pathogen of this disease were studied，and the ribosomal DNA － ITS sequence of this pathogen was analyzed． The results indicated
that similar isolates were all obtained from 26 diseased arecanut samples collected from 5 main cultivating regions of Hainan;the
conidia of this pathogen were oval or cylindrical，and their size was (12． 0 ～ 21． 3)μm ×(3． 5 ～ 6． 0)μm;after being inoculated，
this pathogen caused the same symptoms as the typical symptoms in field diseased samples;the pathogen was in the same branch
with Colletotrichum gloeosporioides in phylogenetic tree，and the homology of this two reached 100% ． According to the morphological
characteristics，pathogenicity and rDNA － ITS sequence of the pathogen of arecanut anthracnose in Hainan，it was identified as Col-
letotrichum gloeosporioides．
Key words:Arecanut;Anthracnose;Pathogen;Identification;rDNA － ITS sequence
槟榔(Areca catechu L．)属棕榈科木本植物，原产
于东南亚马来西亚、印尼等国家，主产于印度和巴基斯
坦。槟榔在我国已有 1000 多年的栽培历史，除了作为
热带地区绿化观赏植物外，还是我国重要的南药植物
之一，其果实、种子、果皮、花均可入药，为“四大南药”
之首，具有较高的经济价值。目前，海南省为我国槟榔
的主产区，其总产量占我国大陆槟榔总产量的 95%以
上。截止至 2013 年底，海南槟榔种植面积已达 87000
hm2，收获面积达 56000 hm2，槟榔产值达 36 亿元，槟榔
种植产业已成为海南省热带作物中排名第二的支柱产
业，是海南 50 多万农户的重要经济来源之一。槟榔炭
疽病是槟榔生产上普遍发生的重要病害，可造成幼苗
生长衰退，甚至死亡;成龄结果树的叶片、花序、果实等
也可染病，感病后落花落果，产量大幅下降。近年来随
着槟榔种植面积的持续增加，炭疽病的发生为害日益
加重，部分地区发病率可达 90%，严重影响了槟榔的产
量和品质。为了明确海南槟榔炭疽病的病原，为该病
的诊断提供理论依据，从而开展更为有效的防治工作，
笔者对海南槟榔炭疽病的发生为害情况进行了调查，
并利用传统形态学鉴定方法，结合 rDNA － ITS 区段的
序列测定分析，对该病的病原菌进行了系统研究和
鉴定。
1 材料与方法
1． 1 病害调查与病样采集
2013 年 2 ～ 12 月，对海南琼海、万宁、陵水、三亚、
琼中等 5 个市(县)的槟榔栽培基地炭疽病的发生和为
害情况进行了调查，对田间发病植株的叶片、果实的症
状进行观察、记录和拍照，并采集样本。
1． 2 病原菌的分离和纯化
采用常规的组织分离法［1］分离病原菌。选取具有
典型症状的发病槟榔叶片和果实，将病健交界处的组
织切成 3 mm ×3 mm的小块，先浸入 70%的酒精 1 ～ 3
min，再用 5%次氯酸钠溶液消毒 1 min，用灭菌蒸馏水
冲洗 3 次后置于 PDA 平板上，每皿接 2 个点，在 25 ℃
培养箱内培养，经单孢分离获得纯化菌株，转接入斜面
后 4 ℃保存备用。
1． 3 致病性测定
采用离体组织接种法。将病原菌在 PDA 平板上
25℃下培养 7 d后，用直径为 6 mm的打孔器在菌落的
边缘打取菌饼。选取完全展开、健康完好的“热研 1
号”槟榔离体叶片，表面消毒后设划伤和非划伤 2 个处
理进行接种;以同样大小的 PDA 培养基块做对照，在
25 ℃持续光照条件下保湿培养。3 d 后移去病原菌菌
丝块和培养基块，间隔 1 ～ 2 d 观察 1 次离体叶片的发
病情况。从叶片病斑上重新分离病原菌，观察其分生
孢子的形状及菌落特征，并与接种菌株进行比较。
1． 4 病原菌形态学的特征观察
将病原菌接种于 PDA平板上，在 25 ℃下培养。从
第 2 天开始每日观察记载菌落特征，包括菌落的形状、
颜色，气生菌丝的疏密程度等;7 d 后观测病原菌的形
态特征，包括菌丝的颜色、分隔情况，分生孢子的形态、
数量和大小等。
1． 5 病原菌 rDNA － ITS序列的扩增与分析
1． 5． 1 病原菌核酸的提取 采用 PD(马铃薯 200 g、
葡萄糖 20 g、蒸馏水 1000 mL)培养基培养病原菌的菌
丝，经 25 ℃、120 r /min振荡培养 6 d 后过滤收集菌丝
体，经低温干燥处理后置 － 70 ℃冰箱中保存。核酸提
取参考 Lee等［2］的方法并加以改进;提取获得的基因
组 DNA经电泳检测和浓度测定后，被稀释至约 15 ng /
μL，备用。
1． 5． 2 rDNA － ITS 区段的扩增与序列测定 应用真
菌 rDNA － ITS 区通用引物对(ITS1 / ITS4)扩增病原菌
的转录间隔区和 5． 8S rＲNA区段［3］。PCＲ扩增采用如
下 50 μL 反应体系:10 × PCＲ buffer 5 μL、MgCl2 4． 0
μL、dNTP 1． 0 μL、ITS1 和 ITS4 引物各 2． 0 μL、DNA聚
合酶 0． 5 μL、模板 DNA溶液 2 μL，加超纯水至 50 μL。
PCＲ扩增反应条件为:94 ℃变性 5 min，94 ℃变性 40
s，52 ℃退火 1 min，72 ℃延长 1 min，共 32 个循环;最后
72 ℃延长 8 min。PCＲ产物经凝胶电泳检测后，直接交
由上海英骏生物公司进行序列测定。
1． 5． 3 病原菌 rDNA － ITS 序列的同源性比较 将所
测序列与 GenBank 核酸数据库中相关菌株的序列进行
相似性比对，即应用 ClustalX 2． 1 软件将病原菌的 rD-
NA － ITS序列与 GenBank 中 11 个炭疽菌属真菌的对
应序列进行相似性比对;应用 Mega 6． 06 软件，采用邻
近相邻法(Neighbour － Joining，NJ)，以 1000 为重复值
进行 Bootstrap检验，构建系统进化树。
2 结果与分析
2． 1 槟榔炭疽病的危害与症状特点
槟榔炭疽病在海南主要槟榔种植区均有发生，严
重发病的槟榔园病叶率可达 85% ～ 90%，幼苗和成龄
槟榔树均可受害。在高温高湿的 8 ～ 10 月份，该病危
害最为严重。发病初期叶片呈现暗绿色水渍状小圆
斑，随后变褐色，边缘有黄晕。随后病斑进一步扩展，
形状呈圆形、椭圆形或不规则形，病斑长 0． 5 ～ 20． 0
cm，病斑中央变褐色，边缘黑褐色;发病后期叶片病斑
累累(图 1)，病部表面产生少量小黑粒，重病叶片整体
变褐枯死;幼芽受害后腐烂或枯萎。青果感病后，果皮
表面呈圆形或椭圆形的病斑，病斑黑色凹陷。成熟果
实上的病斑近圆形，褐色、凹陷;病斑进一步扩展，使果
实腐烂。
图 1 槟榔炭疽病病叶的受害症状
2． 2 病原菌的分离和纯化结果
从海南槟榔的主要栽培区共采集了 26 个炭疽病
样本，采用常规方法进行病原菌分离，在 25 ℃下培养 3
d后，各样本均分离到近似的白色绒毛状的菌落，随后
菌落颜色加深，后期长出橘红色孢子团;采用单孢分离
技术共获得了 15 个来自不同采集地的病原菌纯培养
菌株，编码为 BLTJ01 ～ BLTJ15。
2． 3 病原菌的致病性
将纯化获得的各个菌株再次接种到无病的槟榔叶
片上，15 d后，接种叶片全部发病，有伤口的叶片发病
明显，观察到的症状与田间相同;无伤口的叶片发病较
轻;对照不发病。对发病部位进行病原菌再次分离，获
得与原始菌株基本相似的分离物。按照柯赫氏法则，
证实了所得分离物为槟榔炭疽病的病原菌。
2． 4 病原菌的形态学鉴定结果
获得的 15 个病原菌菌株的培养性状基本一致，能
够在 PDA培养基上良好生长，菌丝绒毛状，初为白色，
后转为灰白色。菌落圆形或近圆形，灰白至浅暗绿色，
正面呈现微弱同心轮纹，在培养后期可看见大量明显
的桔红色分生孢子团。
病原菌的分生孢子盘无刚毛，呈盘形，大小为 73 ～
262 μm;分生孢子圆柱形或长卵圆形，单细胞，无色，内
921 期 朱辉等:海南槟榔炭疽病病原菌的鉴定
部含两个油球，大小为(12． 0 ～ 21． 3)μm ×(3． 5 ～ 6． 0)
μm(图 2)。
图 2 槟榔炭疽病菌的分生孢子
根据病原菌的致病性、培养性状和形态特征，依据
柯赫氏法则，参照 Sutton［4］的分类标准，将海南槟榔炭
疽病的病原初步鉴定为胶孢炭疽菌 Colletotrichum
gloeosporioides (Penz．)Sacc．。
2． 5 病原菌 rDNA － ITS 的序列分析与同源性比较
结果
为了进一步明确病原菌的归属，本研究对所获菌
株 BLTJ01 的 rDNA － ITS 序列进行了测定和同源性分
析比较。利用真菌通用引物 ITS1 / ITS4 对菌株 BLTJ01
的 rDNA － ITS区进行扩增，获得了约 600 bp 大小的单
一条带。测序分析结果表明，该条带全长 574 bp (Gen-
Bank登录号:KJ719315)。将该段序列在 GenBank 中
进行 BLAST分析，发现其与炭疽菌属真菌的同源性最
高，其中与胶孢炭疽菌或其有性态围小丛壳的 ITS 序
列同源性为 99% ～100%。
利用 ClustalX软件将序列进行匹配排列，进一步
应用 Mega软件进行同源性比较，构建分子系统进化
树。结果(图 3)表明，菌株 BLTJ01 与 GenBank 中胶孢
炭疽菌(GenBank 登录号:GQ120479)同处系统发育树
的一个分支，遗传距离最近;其与胶孢炭疽菌的其它菌
株(GenBank 登录号:GU066671、KC010549、KC816040)
或围小丛壳菌(GenBank 登录号:AB218991)的遗传关系
也较近;与炭疽菌属内其它真菌的遗传关系较远。
综合病原菌形态学特征及 rDNA － ITS 序列分析结
果，将海南槟榔炭疽病的病原鉴定为胶孢炭疽菌(Col-
letotrichum gloeosporioides)。
图 3 基于菌株 BLTJ01 和其它炭疽菌属真菌 rDNA － ITS序列构建的系统进化树
3 结论与讨论
炭疽菌是一类在全球范围内广泛分布的植物病原
菌，该类病原物由于形态相似、种间差异微小、分类特
征不稳定等原因，通过传统的形态学鉴定方法对其进
行鉴定难度较大［5］。近年来，从分子水平上对真菌进
行鉴定分类及系统发育研究受到众多学者的普遍关
注。转录间隔区(ITS)是介于 18S rDNA、5． 8S rDNA和
28S rDNA 之间的区域，由于进化速度较快，炭疽菌属
种之间的 ITS 序列存在着较为丰富的变异，而种内不
同菌株之间变异极小，极其保守［6 － 7］。因此该区域为
开展真菌系统发育、分类鉴定和分子检测等方面的研
究提供了较好的指标［8］。
本研究将引起海南槟榔炭疽病的病原菌鉴定为胶
孢炭疽菌(C． gloeosporioides) ，这与 Hegde 等报道的印
度槟榔炭疽病的病原相同［9］，与黄朝豪等报道的海南
槟榔炭疽病的病原刺盘孢(Colletotrichum sp．)在形态
特征上基本一致［10］，但本研究并未发现在分生孢子盘
周围产生刚毛，这可能与培养基、温湿度等环境条件的
不同有关。
本研究通过对海南槟榔炭疽菌 rDNA － ITS 序列进
行测定和分析，从 DNA水平上将引起海南槟榔炭疽病
03 江 西 农 业 学 报 27 卷
的病原鉴定为胶孢炭疽菌，进一步为形态学鉴定结果
提供了佐证，为开展该病害的防治和发生规律研究提
供了理论依据。
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