全 文 ：第 0 1卷 第 1期 Vo l 。 0 1
1 9 89年 a月
热 带 作 物 学 报
C HI NE SE J OU R N AF L O TROPI C AL CRO P S Mr a
No
。
1 9 89
海南岛槟榔细菌性条斑病病原菌鉴定`
文衍堂 洪祥千
华南热带作物学院位保本 )
摘 要
1 95 8一 1牙 86年 , 先后在海南岛电昌 、 谈水 、 三亚等县 ( 市 ) 一些槟榔园发现槟榔叶片发生一
种细菌病害 , 通过对致病菌株的形态 、 染色反应 、 培养性状 、 生理生化特性、 寄主范围么及血清
学反应的测定 , 本病原菌的主要性状与R ao ( 1 9了6 ) 等在印度报道的槟榔细菌性条斑病菌相符 ,
故确认引起海南岛槟榔叶片的细菌性条斑病病原菌属于 X a n t h o ln o n a s c a rn P e s t r i s v , · a r e c a e
( R a o & M o五a 。 ) D y e 。
关恤烟 . 槟榔 ; 细菌性条斑 , 病原鉴定 , 血清学反应
槟榔 ( A r e c a c at e c h u L 。 ) 是一种经济价值很高的热带药用植 物。 1 9 8 5一 1 9 8 6年 我 们
先后在屯 昌县海南药材场 、 陵水县岭门药材场和三亚市南岛农场发现槟榔叶片发生一种细菌
性条斑病 。 本病从苗圃的幼苗到大田 的结果树皆有发生 , 但以幼树发病较重 。 在屯昌县海南
药材场调查 , 重病区株发病率达 9 9。 2% , 重病株多数叶片枯死 , 严重影响槟榔生长 。 槟榔细
菌性条斑病在印度早有报道 , R a 。 ( i 。了6 )等把本病原菌鉴定为 X a n t h o m 。 n a s 。 r e c a e 〔 i 〕 。
D y
e ( 1 9 8 0 )把该病原菌归属于 X 。 e a m p e , t r i s的一个致病变种 , 即 X 。 c a m p e s t r i s p v . a r e 。 a e
( R ao & M ho an ) D ye 〔“ 〕
。我国至今尚未鉴定过槟榔细菌性病二害的病原菌。 我 们 对 本病
的症状 、 病原菌的细菌学性状 、 寄主范围以及血清学反应做了测定 。
本文是报道对本病所做的鉴定结果 。
材料与方法
病叶样本取自上述三个种植槟榔农场的苗圃幼苗 、 大田幼树或结果树。 用 划线分离法 ,
分离出菌株 6 个 , 纯化后分别编号为 A Z、 A 7 、 A S , . A 10 、 A l l 、 A 1 3 。 按照柯赫 氏 准则 ,
将上述菌株用喷雾法或针刺法接种在健康的槟榔叶片上 , 作致病性验证 。 喷雾法接种的植株
( 幼苗 ) 在接种前用聚 乙烯薄膜袋套住保湿 24 小时 , 喷雾接种后仍保湿 36 小时 。 供接种的菌
株在 Y D C培养基上培养 48 小时 ( 邓~ 30 ℃ ) , 配成每毫升含 1 。 6 x 10 . 个菌体的悬浮 液 供 喷
雾接种 。 针刺法接种是在槟榔健叶上涂上经培养 48 小时的菌苔 , 用 灭菌束针轻刺几下 , 敷上
湿棉花保湿 , 用灭菌水以同法作对照接种 , 接种后每天观察一次 , 直至症状出现 。 采用常规
方法鉴定 〔 ” , ` 〕 。 取上述 6 个菌株中的 2 个 菌株作常规的细菌学性状测定 , 其余 菌 株采用
血清学反应鉴定 。 常规测定的项 目包括菌体形态 、 染色反应 、 培养性状和生理生化性状等。
本文于 1 9 8了年 6 月 2 日收到。
. 参加试脸工作的有吴先佑 、 黄红 、 伍筱影同志 。
翔 热 带 作 物 学 报 10卷
供试菌株在 Y D C培养基培养 24 一 36小时 , 用无菌蒸馏水屺成每毫升约含 3 x 1 0 “ 个菌体的悬
浮液 , 液体培养测定的项目均用 2 毫升灭菌滴管接种 , 每支液体培养测定试 管 接 种 菌液 1
滴 。 液体培养或斜面培养的试管每项接种 3 支 , 平板培养每项接种 3 皿 , 并以无菌蒸馏水作
对照接种 。 同时 , 根据某个测定项 目的需要 , 设阳性反应的菌种作阳性反应对照接种 。 接种
后除有说明外 , 均置 28 ~ 30 ℃ 恒温箱培养 , 按测定项目的要求决定培养日期 。
供寄主范围测定的植物系不同属的棕桐科植物 , 即红椰子 ( C oc os sP . ) 、椰子 ( C o c os
n o e i f e r a )
、 糖椰子 ( B o r a s s u s f l a b e l l i f e r ) 、 矮椰子 ( C o e o s : p . ) 、 三药槟榔 ( A r e e a
t r i a n d r a )
、 油棕 ( E l a e i s g u i n e e n s i s ) 、 王徐 ( R o y s t o n e a .l e g i a ) 、 蒲葵 ( L i r i s t o n a
e h i n e n s i : ) 和金山葵 ( A r e c a s t r u o s p 。 ) 。 每洲,供试植物选 3 权是,每株选一片新抽叶片供针
刺法接种 , 供试菌株A Z, 菌体悬浮液每毫升约含4 . 6 火 1。 “菌沐 , 菌液装入具 软木 塞的 灭菌
试管内 , 软木塞外端插上接种针数枚 , 软木塞中央具一小孔 , 接种时菌液可通过小孔流出 ,
并沿针体流至针尖 , 只要刺伤叶片 , 菌液即可进入伤 口 , 加快按种进程 . 接种时 , 同株的另
一健叶用无菌水作对照 。 接种后分别于第 3 天 、 第 1。夭 , 第 20 天观察 , 以最后一次观察为准。
血清学反应试验 , 以菌株 A Z和 A S作为抗原免疫家兔 , 菌液每毫升约含 10 x 1 0 .个菌体 ,
菌液置 10 0℃水浴锅灭活 60 分钟 ,选两只健康家兔作耳静脉或肌肉的免疫注射 。 注 射 程序为三
天注射一次 , 共注射 6 次 , 各次注射剂 量 依次为 。 。 2 , 0 . 5、 1 。 o , 1 . 5 , 2 , 0 , 3 . 0 , 4 . 0毫升。 免
疫后 , 从耳脉和心脏取血 ,血液置冰箱过夜后 , 取上清液经 3。。 o tP m离心 20 分钟 , 弃去 沉 淀 物
取上清液即抗血清 。 将抗血清装入灭菌的安甄瓶中 ,加入 0 . 05 %叠氮钠作防腐剂 , 存放冰箱备
用 。 抗血清的凝集效价分别为 5 1 2 0和 1 2 8 。。 血清学反应采用琼脂免疫双扩散法测定。 供测菌
株除 A Z和 A S外 , 还有A 7、 A l 。、 A 1 1、 A 1 3 , 同时还以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 ( 亦称
甘 兰 黑腐病菌 ) ( X . c a m p e s t r i s p 二 . c a m p e s t r i s ) 、 水稻细菌性条斑病菌 ( X . e a m p e s t r i s p v .
o r y z i e o l。 ) 、 木薯叶疫病菌 ( X . 。 a 二 p e s t r i s p v 。 。 a n i h o t i s ) 、 马铃薯青枯病菌 ( P s e u d o m o n a s
s o l a n a e e a r . i m )
、 丁香疫病菌 ( P . s y r s n g a e p , . s y r i n g a e ) 、 白菜软腐 病 菌 ( E r w i n i a
c a r o t o v o r a )
、 胡椒细菌性叫·斑病菌 ( X 。 e a m p e s t r i s p , 。 b a 士l i e o l a ) 和水稻白 叶枯病菌
( x
. c a
mP
e s it : p v
,
Qr y
z 。 e )作对照菌侏参试 , 以测定本病原菌在血清学反应中的亲缘关系 。
结 果
症伏描述及显微镜诊断 : 本病主要为害叶片 , 但也能为害叶鞘 , 在裂片上常见的症状是
1 ~ 4 毫米宽 、 5 ~ 10 毫米长 、 暗绿 色至浅渴色的水溃状条斑 , 条斑穿透叶片两面 。 条斑沿
叶脉间扩展 , 扩展部位半透明 , 数个斌奈斑可汇合成 , }交条斑。 在有利于病害发展的情况下 ,
同一张裂片可出现许多细长的暗绿色 水 流 状条斑 , 乐斑长度视裂片长度而定 , 通常可达十
至数十匣米。 几个细长条斑 一可密集成排 。 病斑后期深褐色 , 稍凹陷 , 黄晕明显 ( 图 1 . 1 ) 。 在
长时间潮湿的情况下 , 病斑背面出现浅黄色菌旅 。 发病严重时病部撕裂 , 以至裂片变褐枯死
( 图 1 . 2 ) 。 本病在叶鞘上的定状通常是暗绿色近圆形 的 水 债 状斑 , 病斑可深达叶 鞘 内层 。
切取上述各部位的病组织 左显微镜 ’ 一卜观察 , 均可见 叨 口处有大量细菌溢流从薄壁组织涌出 。
接种观察 : 喷雾接种的氏卜片和针刺接种的叶片分别经 4 ~ 5 天和 3 ~ 4天出现细小的水
债状近圆形或矮柱形病斑 , 以后病斑沿叶脉间扩展成暗绿色至浅褐色的水债状条斑 , 条斑后
期深揭色 , 周围有明显的黄晕 , 表明人工接种所产生的症状与田间观察到的症状相同。 用上
1 期 文衍堂等 , 海甫岛槟榔细菌性条斑病病原菌鉴定
. . . . . . . . . . . , . . . . . . . . , . 曰 . 闷 , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一一一一 . . . 州述 6 个菌株接种均能致叶片发病 , 又能从发病的组织中再次分离到相同的病原菌 , 此过程符
合柯赫氏准则 , 证明上述 6 个菌株均为致病菌。
病原菌的细菌学性伏 : 菌体短杆状 ,两端饨圆 ,大小 。 . 8~ 1 。 2 x 0 . : ~ 0 . 8微米 ; 排列 方 式
多数为单个 , 少数呈双链排列 ; 有芙膜 , 但不产生芽抱 ; 革兰氏染色阴性反应 ; 鞭毛单根极
生 ( 图 1 , 3 ) 。菌体在 Y D C培养基上平板培养 4 天 ( 28 ℃ ) , 菌落圆形 , 表面光滑 , 隆起 , 有光泽 , 淡黄
色 , 边缘完整 , 粘稠 , 菌落直径 2 . 。~ 2 。 5毫米 (图 1 , 4) 。在马铃薯块斜面 培 养 10 天 , 菌 苔 丝
状 , 生长中等 , 边缘光滑 , 黄白色 , 有光泽 , 薯块稍变色 。 在 Y D C培养基斜面培养 10 夭 , 菌
苔丝状 , 边缘光滑 , 黄白色 , 有光泽 , 稍粘稠 , 培养基不变色 。 在金氏 B培养基斜面 培 养 ,
菌体不产生荧光色素 。
圈 1 校钾细霭性条斑病症状及病原菌
病害症状 3 。 病原菌 形态 4 . 菌落形态
在糖 、 醇发酵测定中 , 采用博德和霍尔丁二氏的配 l方作为基础培养基 , 按测定项目 , 加入
各种搪 、 醇 , 以测定病原菌对各种糖 、 醇的利用情况 。 测定结果表明 , 各菌株均能利用葡萄
擞 奄 作 物 学 报 :嚼
.一一 .一~ ~ 四 . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . 曰口. . 侧 . .格、 阿拉伯糖 、 一甘露褚 、 果搪 、 蔗塘 、 木塘 、 乳糖 、 半乳糖 、 甘油 、 甘露醇 、 山梨醇 、 肌醉和糊精 , 产酸 , 但不产气 , 不能利用棉子搪 、 鼠李搪 、 菊塘 、 山梨搪 、 麦芽塘 、 赤鲜醇、 甜醇和水扬昔 。 各菌株能水解淀粉 、 脂肪和七叶昔 , 不液化明胶 , 不产生叫噪 , 产硫化氢 , 产氨、 甲基红和乙酞甲基 甲醇 , 反应阴性 , 硝酸盐还原阴性 , 过氧化氢酶阳性 , 氧化酶阴性 , 脉酶阳性 , 石蕊牛奶碱性 , 陈化 、 石蕊还原 , 在 N A 培养液中 , 氯化钠含量达 6 %时 , 菌 体 生长仍不受抑制 , 菌体生长最高温度为 3 ~ 3 4℃ 。 在测定病原菌能否利用有机酸盐作为唯一碳
源的试验中 , 以硫酸按组合培养基为基础培养基 , 按测定项 目加入各种有机酸盐 , 测定结果表
明 , 各菌株能利用醋酸钠 、 柠檬酸钠 、 乳酸钠 、 琉琅酸钠作为唯一碳源 。 不能利用丙酸钠 、
苯甲酸钠作为唯一碳源 。 各菌株也不能利用 L一酪氨酸作为唯一碳源和氮源 。
寄主范围测定结果表明 , 采用针刺法接种 , 本病原菌还能侵染椰子 、 红椰子 、 拾椰子 、
矮椰子和三药槟榔 , 不能侵染油棕 、 王徐 、 蒲葵和金山葵 。
琼脂免疫双扩散测定结果表明 , A Z和人 8两菌株的抗血清只能与从槟榔叶片上分离到的
致病菌株 ( 抗原 ) 产生血清学反应 , 即A Z或 A S抗血清能与 抗原 A S或 A Z , 抗原 A 了、 A 10 、
A n 和 A 13 在琼脂平板上出现明显的 、 单条乳白色沉淀线 , 沉淀线互相干扰而融合 。 其它 菌
株 ( 抗原 ) 不与 A Z或A S抗血清产生沉淀线 ( 图 2 、 田 3 ) 。
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图 2 中心孔含 A S杭血清
外围孔 : 1 , 4 , s 含抗原 A s , 2 , 3 , 5 , 。
10分别含抗原 A Z , A 7 , A i o , A i i , A 1 3 , 6 ,
7 , 分别含生理盐水和 野油汕菜黄单胞菌 、
图 3 中心孔含 A Z抗血清
外围孔 : 1含杭原 A Z , 6 含生理盐水 , 2 , 8 , 4 ,
5 , 7
,
8 , 9
,
10 分别含抗原甘兰黑腐病菌 , 水稻
条斑病 , 木薯叶疫病菌 , 青枯病菌 , 丁香痊病菌 , 白
莱软腐病菌 , 胡椒叶 斑病菌 , 水稻 白叶枯病菌
结 论 和 讨 论
根据观察 田间发病和人工接种发病的症状以及病组织的显微镜观察 , 认为本病是一种俊
染寄主薄壁组织的细菌性病害。 又根据致病性 、 细菌学性状和血清学反应的鉴定结果 , 表明
所分离到的各个致病菌株属同一个种 , 这个种与其它参试种或致病变种无共同的抗原结构 ,
可以通过凉脂免疫双扩散法把本病原菌与其它不同的种或不同的致 病变种 区 分开来 。
本病原菌属的性状与《植物病原细菌鉴定的实验指导 , 〔的 所列出的黄单胞菌属的性 抉
相符 , 认为本病原菌属于黄单胞菌属 ( x a nt ho 。 。 an s )。黄单胞菌属被划分为 5个种 〔 “ 〕 , 区
分这 5 个种的性状有 9 项 。 本病原菌有 7项重要鉴定性状与野油菜黄单胞菌 ( X 。毗 h。 。 。 。 。 s
ca m eP st ir
s
) 相符 , 与其它 4 个种只有少数性状相符 。 可以确认本病原菌属于野油菜黄单胞 ,
菌 。野油菜黄单胞菌内按其不同的寄主和致病性的差异 ,划分为许多不同的致病变种 ( p at h交-
1 期 文衍堂等 :海南岛槟榔细菌性条斑病病原菌鉴定
a T
r
) 〔 :〕 。 本病原菌所测定的性状与 Ra o (19 7 6) 等测定槟榔细菌性条斑病菌的性状相 比
较 , 除少数生化性状有差异以及个别性状因缺乏条件而无法测定比较外 , 所有性状均相符 ,
因此 , 确认为害海南岛槟榔叶片的细菌性条斑病病原菌仍属于 X . c a m p e s tr is p v . ar e ca “
( R
a o & M o h a n ) D y e ( 可称野油菜黄单胞菌槟榔致病变种 ) 。
某个生化性状差异的原因是否由于不同地区的菌系差异所致 , 或采用不同构型的生化试
剂或培养基的配制方法的差异所致 , 有待进一步研究 。 R ao ( 1 9 7 6 ) 等认为本病菌通过人工接
种不但能侵染椰子等棕搁科植物 , 而且能侵染甘蔗 , 在甘蔗叶片上接种点出现细小水溃状条
纹 〔 1 〕 。我们在屯昌县海南药材场调查时特别查看紧靠重病槟榔园的果蔗地 , 细致观察甘蔗叶
片是否出现相似于槟榔条班病的症状 , 调查结果未发现细菌性病害 , 而人工接种甘蔗叶片也
出现与前述相似的症状 , 但我们认为甘蔗作为本病原菌的天然寄主的可能性很小 。
. 考 文 峨
《 1 〕 Y · p · R乓0 a n d s · K · M o五a n . B a e t e r ia l l e a f , tr 祖e o f a , e c a n u , e a u , e d 二b , 资x a ” t h o ` o n a s a r e c a e , p ·
N
o 丫 . I n d i a n P h了t o p a t h o l o g了. 10 7已 2 0 . 2 5 2司 6 6〔 , 〕 D” , D . w . , e t a z二 I n t e r n a t i o n a 一 s t a n d a r d: 肠 r n a nZ i n ` 知a t如 , a r s 置o f p h ; to p a th o : e n ie l b a e t e r ia l
a n d a l i s t o f p a t五。 甲 a r n a m e s a n d p a t h o t r p e s t r a i n s , R e v i。下 o f p !。 n t aP t h o l o g y , 1 0 8 0 , ` 9 , `
〔 8 〕 方中达 : 《 植病研究方法 》 , 农业出版社 , 10 7 7
〔 4 〕 中国科学院傲生物研究所细菌 分类 组 . 《 一般细菌常用鉴 定方法 》 , 科学 出版 社 , 10 7 8
〔 5 〕 N . W . S e h a a d . L a b o r a t o r了 G u i d e F o r I d e n t i f ic a t io n o f P la n t P a t h o g e n ie B a e ter ia . B a e t e r io lo g y
c o m m it t e e o f A过 e r i e a n p hyt o p
a th o l o : ic a l s o e i e t了 s t . p a u l · M i n o e s o t a .翻19 8 0
82 热 带 作 物 学 报 1 0卷
. O EN T IF !C A T !ON OF PA T州OG 〔 N OF
B AC T E R IA L LE AF S TR扭尸E O厂 AR E C AN U T
ON H A !N AN IS L AN公
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( P l a n t P r o t e e t i o n D e P a r t nr e n t
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A b a e t e r i a l l e a f s t r i P e o n a r e e a n u t , a s o b s e r甲 e d o n s o m e a r e e a n 妞 t p l a n t a t i o n s o n
H a i n a n l s l a n d i n i , a s a n d 10 56
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A e e o r d i n g t o i t s m o r p五o l o g y , s t a i n i n g r e a e t王o n , e u l -
t u ar l e h a r a e t e t i s t i e s
,
p h y s i o l o g i e一 b i o e h e m i e a l P r o P e r t i e s , h o s t r a n g e a n d s e r o l o g -
e a l r e a e t i o n
,
t h e p a t五o g e n i e s b a e t e r i让 m a p p e a r s s i m i l a r t o t h e e a 往 s a e a l b a e t e v i u m
i d o n * i f i e d b了 Y . P . R a o e t a l ( i , 76 ) i n I n d i a . T五似 5 t h e p a t h o g e o id e o t i f i e d b y
u s e a n b e r e g a r d e d a s X a n t b o m
o n a s e a m p e s t r i s P v
. a r e e a e ( R a o & M o h a n ) D y e
。
K e y w o r d s
: A r e c a n u t , b a c t e r i a l s t r i p e 一 p a t五o g e n i o i d e n t i f i e a t i o n , s e r o l o g i e a l
r e a c t i o n
.
. .