全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2016)02 － 0316 － 05 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2016． 02． 020
收稿日期:2015 － 11 － 21
基金项目:广西农业科学院科技发展基金项目(桂农科
2014YX03，桂农科 2014JQ03，桂农科 2014YQ03，桂 农 科
2015YT90)
作者简介:王晓国(1986 －)，男，陕西宝鸡人，硕士，助理研究
员，研究方向为兰科植物菌根生物学，* 为通讯作者，E-mail:
zhouzhugui@ 126． com。
带叶兜兰菌根真菌分离和初步鉴定
王晓国1，卢家仕1，周主贵1 * ，李秀玲1，陈廷速2，卜朝阳1
(1．广西农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007;2．广西农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007)
摘 要:了解带叶兜兰菌根真菌的群落组成，为优良菌株的筛选奠定基础，对采自广西乐业县的野生带叶兜兰进行了菌根真菌分
离，通过根段直接培养法分离菌根真菌，以确定 75 %乙醇和 10 % NaClO的最适表面消毒时间，并应用形态学方法对分离的菌株
进行了属的鉴定。研究结果显示，带叶兜兰菌根真菌最适表面消毒时间是 75 %乙醇 8 min，10 % NaClO 8 min。从带叶兜兰菌根
中分离到的 63 株真菌，除 8 株菌株分类地位不能确定外，其余菌株归属于镰刀菌属(Fusarium)、轮层菌属(Daldinia，)、碳团菌属
(Hypoxylon)、毛壳菌属(Chaetomiaceae)、胶膜菌属(Tulasnella)5 属，其中镰刀菌属和轮层菌属为优势菌属。
关键词:带叶兜兰;菌根真菌;分离鉴定
中图分类号:Q939． 96 文献标识码:A
Isolation and Preliminary Identification of Mycorrhizal Fungi
from Paphiopedilum hirsutissimun(Orchidaceae)
WANG Xiao-guo1，LU Jia-shi1，ZHOU Zhu-gui1 * ，LI Xiu-ling1，CHEN Ting-su2，BU Chao-yang1
(1． Flowers Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China;2． Microbiology Research In-
stitute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China)
Abstract:In order to understand the community composition of mycorrhizal fungi in Paphiopedilum hirsutissimun(Orchidaceae)and establish
foundation for screening excellent strains，the optimal method for sterilization of plant materials surface with 75 % ethanol and 10 % NaClO
was determined by the tissue isolation method and fungus was identified preliminarily based on morphological characteristics in this paper．
The results showed that 75 % ethanol for 8 min，10 % NaClO for 8 min were more suitable for roots sterilization． 63 strains fungi were isola-
ted except that 8 strsains remained undetermined，other 55 strains were classified and belonged to 5 genera． The dominant groups of those
mycorrhizal fungi were Fusarium and Daldinia，and Hypoxylon were firstly reported on Paphiopedilum hirsutissimun． Specifically，Tulasnel-
la，a species of typical orchid mycorrhizal fungi，has been found．
Key words:Paphiopedilum hirsutissimun;Mycorrhizal fungi;Isolation and identify
兰科植物在植物界的系统演化上属于最进化、
最高级的类群，具有很高的药用、观赏和科研价值，
其广泛分布于热带、亚热带、温带等各种陆地生态系
统中［1］，具有较强的生态适应性，约 75 %的种类属
于附生类型，25 %为地生类型，5 %为石生类型和
腐生植物［2］。广西是我国兜兰属植物分布的第二
大区域，分布有 18 种兜兰，有地生类型、附生类型和
石生类型。由于兜兰极高的观赏价值，随着国际花
卉市场对兜兰大量需求，以及持续的采集压力致使
我国野生兜兰种群数目锐减，部分兜兰在野外已极
难发现［3］。目前所有兜兰属植物均被列入《濒危野
生动植物种国际贸易公约》，受到严格的保护。自
然条件下，受到种子萌发率和营养生长期较长的限
制，兜兰的种群恢复受到极大的制约。近年来，菌根
生物学的研究已成为一个新的趋势。几乎所有的兰
科植物都与真菌共生，菌根共生关系几乎伴随着兰
科植物从种子萌发到开花结果的整个生活史。形成
兰科植物菌根的真菌大多属于“丝核菌类”的蜡壳
耳目(Sebacinales)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)和
胶膜菌科(Tullasnellaceae)［4］。也有报道认为除了
613
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2016 年 29 卷 2 期
Vol. 29 No. 2
“丝核菌类”以外的其他担子菌，如伞菌纲(Agarico-
mycetes)、锈病菌亚门甚至子囊菌的真菌也与兰科
植物形成菌根［5］。因而研究兜兰菌根真菌并将菌
根真菌应用到种群恢复上具有重要意义。
带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimun)为兰科
兜兰属地生或半附生植物，多生于海拔 700 ～ 1500
m的常绿阔叶林下、林缘石缝中或多湿润土壤中。
近年来发现广西的野生带叶兜兰分布破碎化现象加
剧，种群恢复的工作刻不容缓。利用组织培养技术
已经实现了带叶兜兰的快速化育苗，但是兰科植物
的快速生长技术仍未得到有效解决，菌根化育苗技
术成为解决这一问题的有效途径［6］。为此，本研究
以带叶兜兰菌根为材料，分离纯化其菌根真菌，研究
其类群特征并进行初步鉴定，为带叶兜兰菌根真菌
应用提供理论基础和实践经验。
1 材料与方法
1． 1 供试植株
野生带叶兜兰成年植株 2012 年采集于广西乐
业县，保存于广西农业科学院兰科植物资源圃，选择
长势良好的植株营养根。
1． 2 菌根真菌的分离和培养
1． 2． 1 分离及纯化培养基 分离菌根真菌培养基
为马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯 200 g，琼脂
6 g，葡萄糖 15 g，补水至 1000 mL，pH自然。依照常
规生物学试验方法，配置分离培养基，121 ℃高压湿
热灭菌 20 min，待培养基冷却至 45 ℃左右，加入链
霉素(100 μg /mL)和青霉素(100 μg /mL)，摇匀后
制备平板。
1． 2． 2 菌根真菌分离及纯化方法 菌根真菌分离
按照常规组织分离法［7］:取带叶兜兰新鲜营养根，
选取在莱卡显微镜下观察具有菌丝团的根段，在流
水下冲洗干净，用 75 %乙醇漂洗分别处理 4、8 min，
无菌水冲洗 1 ～ 2 次，再用 10 % NaClO消毒 2、4、6、
8 min，无菌水冲洗 7 ～ 8 次。将预处理过的根切成 1
～ 2 mm的小段，然后将处理好的材料置于 PDA 平
板上，24 ℃恒温培养 3 ～ 5 d，可见从皮层细胞内长
出的菌丝长入培养基内。利用菌丝尖端挑取法对菌
株进行分离和纯化，再接到试管中保存。取表面消
毒最后一次冲洗的无菌水涂布于相同处理的 PDA
平板上作为对照检验消毒效果，结果对照实验并无
任何菌丝长出，多次重复均如此，证明表面消毒彻
底，从而保证了分离得到的真菌是菌根真菌而不是
表面附生真菌或杂菌。
1． 3 菌根真菌的形态学鉴定
将分离获得的菌株分别接到 PDA 培养基平板
上，24 ℃恒温培养，每天观察记录各菌株的菌落特
征，包括菌落形状、大小、色泽、生长速度及是否产生
色素和香味等情况。采取直接挑取法制片观察菌
丝、孢子梗及孢子形态等。菌种鉴定依据菌株菌落
的培养特征及菌株显微形态观察的结果，结合大量
可靠的文献资料，综合分析对比相关特征的异同，最
后确定鉴定菌株的分类地位。
2 结果与分析
2． 1 表面消毒时间对菌株分离的影响
如表 1 所示，通过 75 %乙醇和 10 % NaClO 设
定不同消毒时间对带叶兜兰菌根进行表面消毒，分
离到菌根真菌的数量有一定的差异，分离到菌株数
目变化为:a ＞ c ＞ b ＞ g ＞ h ＞ e，f ＞ d。其中处理 a 分
离到的菌株数目最多为 16 株，分离率为 66． 60 %，
处理 d 分离到的菌株最少为 4 株，分离率为 16． 70
%。随着 75 %乙醇灭菌时间的增加，分离到真菌的
数量有减少的趋势，75 %乙醇灭菌 4 min处理的平
表 1 不同表面处理带叶兜兰菌根真菌分离结果
Table 1 Result of isolation on P． hirsutissimun roots in different surface treatments
处理
75 %乙醇(min)
75 % ethanol
10 %次氯酸钠(min)
10 % NaClO
分离率(%)
Rate of isolation
获得的菌株(株)
Obtained quantity
of fungi
种属(属)
Fungi species
a 4 2 66． 60 16 1
b 4 4 41． 66 10 3
c 4 6 50． 00 12 2
d 4 8 16． 70 4 2
e 8 2 20． 80 5 1
f 8 4 20． 80 5 2
g 8 6 25． 00 7 3
h 8 8 25． 00 6 3
注:其中处理 d有 4 株分离到的真菌伴生有细菌，故未进行统计。
Note:Treatment d has 4 fungus with bacteria，so no statistics．
7132 期 王晓国等:带叶兜兰菌根真菌分离和初步鉴定
均分离率为 43． 74 %，平均分离到的菌株为 10． 5
株，而 75 %乙醇灭菌 8 min 的处理平均分离率为
22． 90 %，平均分离到的菌株为 5． 75 株。经过对分
离的菌株进行属的鉴定后，处理 a、e 各分离到为 1
个属，处理 c，d，f各分离到 2 个属，处理 b，g，h 各分
离到 3 个属。考虑到随着表面消毒时间越长，根部
表面和细胞间隙的附生菌或者杂菌杀死的几率更
高，分离到非菌根真菌的可能性更少。通过对菌根
真菌的分离率和菌株种数、种类比较，用 75 %酒精
漂洗根段 8 min，无菌水冲洗 2 次，再用 10 %NaCLO
消毒 8 min ，无菌水冲洗 7 ～ 8 次，比较适合带叶兜
兰菌根真菌的分离。
2． 2 带叶兜兰内生真菌初步鉴定结果
本次试验通过 8 种菌根表面消毒处理从带叶兜
兰根中分离到 52 个菌落，这些菌落有的单独着生在
培养基上，有的混杂在一起，经分离、纯化后，共获得
63 株真菌菌株。通过形态学和显微结构初步鉴定
除 8 株疑难种类较难鉴定外，其余 55 株真菌分别属
于 5 个不同的属，包括轮层菌属(Daldinia．)、镰刀
菌属(Fusarium)、碳团菌属(Hypoxylon)、毛壳菌属
(Chaetomiaceae)、胶膜菌属(Tulasnella)，部分内生
真菌在 PDA培养基上的菌落形态和显微结构描述
见表 2。鉴定的真菌大多数属于子囊菌门真菌共计
有 4 个属，其中镰刀菌属 17 株占总数 26． 98 %;轮
层菌属 15 株，占 23． 81 %;碳团菌属 4 株，占 36． 35
%;毛壳菌属 7 株，占 11． 11 %;担子菌门 1 个属，胶
膜菌属 12 株，占 19． 05 %(表 3)。
在这些菌属中，轮层菌属真菌主要由处理 a、b
分离得到，共分离到 12 株;镰刀菌属真菌主要由处
理 a、c分离得到，共分离到 13 株;碳团菌属真菌占
分离到菌株比例较小，处理 a 分离得到 2 株，处理 c
和处理 h各分离到 1 株;毛壳菌属真菌主要由处理 f
分离得到，分离到 5 株;胶膜菌属真菌主要由处理
g、h分离得到，共分离到 8 株。由此可见不同灭菌
处理对菌根真菌的分离有一定的影响。
表 2 带叶兜兰部分菌根真菌的初步形态鉴定结果
Table 2 Identified result of initial shap in P． hirsutissimun roots
菌株
Strain fungi
菌落形态
Colonial morphology
显微结构
Microstructure
分类推断
Classification and judgment
a-1-1 菌落为黑褐色，菌丝发达，气生菌丝较多，呈白色，束状
直立，生长速度 0． 31 ～ 0． 38 mm /h
子座球形或半球形，黑褐色;子囊孢子近椭
圆形，暗褐色
碳团菌属
Hypoxylon
a-6-2 菌落呈黑灰色，有同心轮纹，贴基生长，少气生菌丝，菌
丝生长速度 0． 33 ～ 0． 4 1mm /h
子座球形或近球形，表面着生;子囊孢子单
细胞、暗色
轮层碳菌属
Daldinia
c-5-1 菌落无色或浅淡黄色，似雪花状，气生菌丝极多，成细绒
毛状，菌丝生长速度 0． 24 ～ 0． 27 mm /h
分生孢子呈长椭圆状或镰刀状，两端尖，多
为 2 ～ 3 隔
镰刀菌属
Fusarium
f-2
菌落淡黄至深黄色，气生菌丝极少;孢囊呈球状，淡黄
色，孢子成球形，多呈小圆帽性突起;菌丝生长速度 0． 11
～ 0． 16 mm /h
菌丝多无隔，子囊着生有许多毛状附属丝，
子囊孢子单细胞，淡黄色，呈圆球形或椭圆
形
毛壳菌属
Chaetomiaceae
g-1 菌落乳白色，毯状，贴基生长，气生菌丝较多，呈长绒状，
菌丝生长速度 0． 127 ～ 0． 133 mm /h
菌丝直角或近直角分支，有横隔念珠状细胞
呈椭圆形或短圆柱状
胶膜菌属
Tulasnella
b-2-2 菌落淡黄色，菌丝初始为无色，气生菌丝较多，成丝状，
菌丝生长速度 0． 23 ～ 0． 28 mm /h; 菌丝多无隔，未见孢子着生
未定
Unidentified strains
c-6-2 菌落淡黄色，贴基生长，有绒毛状气生菌丝，菌丝生长速
度 0． 24 ～ 0． 27 mm /h 菌丝多无隔，未见孢子着生
未定种
Unidentified strains
表 3 不同处理菌根真菌数量
Table 3 Quantity of fungi on P． hirsutissimun in different treatments
处理
Treatment
总分离株
Total quantity of
isolated fungi
菌株所占的(%)
Rate of strain fungi
轮层菌(株)Daldinia 15 23． 81
镰刀菌(株)Fusarium 17 26． 98
碳团菌(株)Hypoxylon 4 6． 35
毛壳菌(株)Chaetomiaceae 7 11． 11
胶膜菌(株)Tulasnella 12 19． 05
未定种(株)Unidentified strains 8 12． 70
813 西 南 农 业 学 报 29 卷
3 结论与讨论
3． 1 表面消毒时间对菌株分离的影响
由于兜兰菌根真菌在根组织上的分布具有一定
的空间差异，有的分布于毛被，有的分布于外皮层和
内皮层甚至在木质部也有分布，而且菌根真菌的分
布不是均匀的，毛被和内皮层分布的相对较多一些，
而且在根基和根尖中存在的内生菌较少。因此，消
毒液的选择和处理时间及菌根真菌对分离培养基的
偏好及生长速度的影响，造成了不同处理对分离到
的菌根真菌种类和数量出现了一定的差异。本研究
采用 75 %乙醇与 10 % NaClO为消毒剂，通过比较
不同消毒时间下所得内生真菌的分离率和菌株种
数、种类来确定最适消毒时间。随着 75 %乙醇灭菌
时间的增加，分离到真菌的数量有减少的趋势;结合
分离的菌株数量和种类，75 %乙醇灭菌 8 min 再用
10 % NaClO 灭菌 8 min 处理方法比较适合带叶兜
兰菌根真菌的分离。
3． 2 带叶兜兰内生真菌形态初步鉴定
通过分离鉴定，本试验得到的菌根真菌中优势
菌群为镰刀菌属和轮层菌属。镰刀菌是一种世界性
分布的真菌，属于兼寄生或腐生真菌，大多数镰刀菌
为植物病原菌，导致植物产生花腐、茎腐、茎基腐、根
腐等多种病害［8］。然而从杏黄兜兰和硬叶兜兰菌
根中分离到的真菌类群中镰刀菌为优势菌群［9 － 10］，
有研究表明从兰科植物中分离到的镰刀菌，可以促
进铁皮石斛种子的萌发和生长［11］，说明了分离到的
镰刀菌并不是兜兰的致病菌。Hanne 也将镰刀菌属
归为兰科菌根真菌［12］，这也表明了此次分离到的镰
刀菌属真菌为带叶兜兰的菌根真菌。轮层菌属大部
分种类能够引起寄主植物的白腐病，但其具有媲美
担子菌类的降解能力，可降解纤维素和木质素［13］，
此次分离到的轮层菌为首次报道。带叶兜兰为半附
生种类，多生长在腐殖质基质上，这表明轮层菌可能
与带叶兜兰的生境有较大的关系，也有可能为潜伏
的致病菌。Kazuhiko Narisawa对深色有隔内生真菌
(Dark septate endophyte，DSE)类真菌进行了系统研
究，将毛壳菌属和碳团菌属部分种类划分为 DSE 类
真菌［14］。DSE真菌广泛存在于植物的表皮、皮层甚
至维管束细胞内，能够在细胞内或者细胞间隙形成
“微菌核”，菌丝具有明显的横隔。在对兜兰属植物
菌根染色观察时也发现了“微菌核”和明显的菌丝
横隔结构，表明这两类真菌为从带叶兜兰菌根中分
离出的 DSE 真菌。DSE 不具有宿主特异性在大多
数植物根系中均能够发现此类真菌，对 DSE 与铁皮
石斛组培苗和盆栽苗共生培养研究发现其能够明显
地促进铁皮石斛的生长，表现出较好的促生作
用［15］。胶膜菌属真菌为典型的兰科植物真菌(Or-
chid Mycorrhizal，OM)［16］，广泛存在于大多数兰科植
物中［17 － 18］，兰科植物种子必需与其共生后才能够萌
发［19］。本研究分离到 12 株胶膜菌属真菌，这些菌
株是否能够促进带叶兜兰种子的萌发还需进一步的
共生萌发实验。
由于植株来源、菌根分离方法、菌根真菌对分离
培养基的偏好等因素的影响，不同研究者分离到的
菌根真菌种类和数量有一定的差异［20］。兰科植物
不同的生长时期可能需要的菌根真菌种类不同，真
菌随着植物生长季节和营养需求规律呈现出相应的
多样性变化:萌发期和生长期的多样性较高，而到果
期则是大幅下降［3］。这些因素造成了并不能够较
为全面的分离到所有的带叶兜兰菌根真菌，需对不
同季节，不同生长期的带叶兜兰进行菌根分离。一
些子囊菌门真菌和大多数担子菌门菌株在培养状态
下较难形成产孢结构，筛选适当的诱导孢子形态的
培养基是制约菌种鉴定的一个难点。因此，尚有 8
株真菌因其未有孢子形态而无法进行准确的鉴定。
此次对所分离的真菌初步鉴定到属，真菌种的精确
定位需在传统形态学鉴定的基础上结合分子生物学
方法进一步鉴定。兰科植物与共生真菌的关系以及
利用共生真菌来促进种子萌发和幼苗生长已成为兰
科植物研究的热点。本研究只是对带叶兜兰菌根真
菌进行了分离、鉴定，初步探讨了其共生关系，这些
真菌是否与带叶兜兰存在共生关系，还需将分离到
的真菌回接到寄主植物上进行下一步研究。
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( 责任编辑 温国泉)
023 西 南 农 业 学 报 29 卷