全 文 ：收稿日期:2014-10-21
基金项目:国家自然科学基金(31260353);广西自然科学基金(2012GXNSFDA053019)
作者简介:谭木秀(1985-)，女，硕士，研究实习员，研究方向:药用植物生物技术;Tel:15507807315，E-mail:tanmuxiu@ 163. com。
* 通讯作者:师凤华，Tel:18076333929，E-mail:fenghuas@ 163. com。
红腺忍冬种子沙培萌发条件和种子沙培苗
灭菌方法的初步研究
谭木秀1，曾雯雯2，韦鹏霄2，莫乔程1，3，蒲祖宁1，岑秀芬2，师凤华1*
(1. 广西药用植物园，广西 南宁 530023;2. 广西大学农学院，广西 南宁 530005;3. 广西壮族自治区轻工
产品质量监督检验站，广西 南宁 530031)
摘要 目的:探索红腺忍冬种子沙培萌发条件和沙培苗的灭菌方法。方法:采用 0. 1% HgCl2不同消毒时间、不
同光照时间和温度培养条件，对红腺忍冬种子进行沙培萌发试验;采用不同灭菌方法、不同炼苗天数对红腺忍冬种
子沙培苗进行灭菌效果试验。结果:75%酒精 30 s + 0. 1%HgCl2 5 min对红腺忍冬种子灭菌效果最佳，平均污染率
为 15. 56%，平均发芽率为 51. 11%;光照 12 h /d 的变温-室温培养处理的平均发芽率(75. 49%)及平均发芽势
(68. 36%)均最高;弃根的开放沙基培养苗下胚轴以上部分洗洁精水刷洗-自来水冲洗后的灭菌效果较好，平均污
染率为 0，平均成活率达 100. 00%;炼苗 30 d的沙培苗洗洁精水刷洗-自来水冲洗之后的灭菌效果最好，平均污染
率为 50. 00%，平均成活率为 100. 00%。结论:75%酒精 30 s + 0. 1%HgCl2 5 min为红腺忍冬种子最佳灭菌处理;光
照 12 h /d的变温-室温培养为最适培养条件;弃根的开放沙基培养苗下胚轴以上部分洗洁精水刷洗-自来水冲洗后
的灭菌效果较好;沙培苗转接继代入培养基之前须经过一定天数的炼苗及洗洁精水刷洗-自来水冲洗之后进行灭
菌处理。
关键词 红腺忍冬;种子萌发;沙培苗;灭菌效果
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)05-0899-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 05. 004
Preliminary Study of Lonicera hypoglauca on Germination Conditions of Sand
Culture Seeds and Sterilization Method of Sand Culture Seedling Sterilization
TAN Mu-xiu1，ZENG Wen-wen2，WEI Peng-xiao2，MO Qiao-cheng1，3，PU Zu-ning1，CEN Xiu-fen2，SHI Feng-hua1
(1. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Nanning 530023，China;2. College of Agriculture，Guangxi University，Nanning
530005，China; 3. Light Industry Products Quality Supervision and Inspection of Guangxi Zhuang Autonomous Ｒegion，Nanning
530031，China)
Abstract Objective:To explore the germination conditions of Lonicera hypoglauca sand culture seeds and the effects of sand cul-
ture seedlings sterilization. Methods:0. 1% HgCl2 with different sterilization time，different illumination time and temperature culture
condition were adopted to study the germination conditions of sand culture seeds. Different sterilization treatments and different harden-
ing-seedling days were used to test the sterilization effect of sand culture seedlings. Ｒesults:The sterilization effect of the combination of
75% ethanol 30 s + 0. 1%HgCl2 5 min on Lonicera hypoglauca seeds was the optimum，with the average pollution rate of 15. 56%，and
the average germination rate reached 51. 11%. The combination of varied temperature-room temperature under light for 12 h /d was the
best，with the average germination rate peaked at 75. 49%，and the average germination potential reached 68. 36%. The treatment of de-
tergent liquor scrub-tap water wash on the part above the hypocotyl，which was sand cultured under the opening condition and had no
root，showed the best sterilization effect，with the average pollution rate was zero，and the average survival rate peaked at 100. 00% . The
sterilization effect of sand culture seedlings，which was disinfected after cleaning by detergent liquor scrub-tap water wash after harden-
ing-seeding for 30 days，was the best，with the average pollution rate of 50. 00%，and the average survival rate of 100. 00% ． Conclusion:
The best sterilization effect is the combination of 75% ethanol 30 s + 0. 1%HgCl2 5 min;Lighting for 12 h /d of varied temperature-room
temperature is regarded as the optimum culture condition. The treatment of detergent liquor scrub-tap water wash treatment on the part
above the hypocotyl，which is sand cultured under the opening condition and had no root，shows the best sterilization effect. For the sand
culture seedlings，before inoculated in subculture medium，should be hardening-seedling for some days and sterilized after detergent liq-
uor scrub-tap water wash.
Key words Lonicera hypoglauca Miq.;Seed germination;Sand Culture Seedling;Sterilizing effect
·998·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 5 期 2015 年 5 月
红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq. 为忍冬科忍
冬属植物，为中药材山银花的来源植物之一〔1〕。由
于近年来野生资源遭到严重破坏，数量迅速减少，难
以满足需求，需加快发展人工种植。常规种子播种
萌发率低，枝条扦插繁殖成活率低，有必要对其进行
组织培养研究，加快繁殖速度，为生产提供优良种
苗〔2〕。
通过对带腋芽外植体诱导无菌苗是目前红腺忍
冬无菌组培苗的主要来源途径，但红腺忍冬属木质
藤本，生长缓慢，且红腺忍冬藤本身带有内生菌，不
易一次获得大量的无菌腋芽;同时，以腋芽为外植体
诱导出不定芽在继代培养时存在着叶片细小，节间
伸长不良等问题。以红腺忍冬的种子沙培苗为外植
体进行无菌苗诱导不失成为一种尝试。种子消毒、
萌发条件及种子苗的灭菌处理是种子无菌苗诱导研
究的必要步骤。本文报道有关试验和初步研究结
果，以期为红腺忍冬进一步保存与开发利用提供新
的组培快繁技术参考。
1 材料与方法
1. 1 材料 将新采收回来的红腺忍冬成熟浆果在
自来水中浸泡 2 h之后搓洗，取干净饱满的种子，用
1. 5 倍种子体积的 40 ℃的水浸泡 12 h，晾干备用;
将河沙过 40 目筛，装入培养瓶加水(以手握成团且
不渗出水，放手即可散开为准)，121 ～ 126 ℃灭菌 40
min，冷却待用。
1. 2 方法
1. 2. 1 红腺忍冬种子沙培萌发条件的研究:
1. 2. 1. 1 0. 1%HgCl2不同消毒时间对红腺忍冬种
子萌发的影响:先用 75%酒精对红腺忍冬种子浸泡
30 s，再于 0. 1%HgCl2中分别浸泡 0 min(A1 处理)、
2 min(A2 处理)、5 min(A3 处理)、8 min(A4 处
理)，后用无菌水冲洗 5 ～ 6 次。将灭好菌的种子播
种于上述河沙中，每一处理 5 瓶，每瓶播种 20 粒种
子(下同)，置于 25 ℃左右的通风室温条件下培养，
7 d后开始观察污染率，30 d后统计发芽情况。
1. 2. 1. 2 不同光照时间和温度条件对红腺忍冬种
子萌发的影响:75%酒精 30 s + 0. 1%HgCl2 5 min灭
菌处理后播种，分别置于不同的培养条件下培养，共
11 个处理:光照 0 h /d 室温培养(B1 处理)、光照 0
h /d变温 5 d-室温培养(B2 处理)、光照 0 h /d 室温
5 d-变温培养(B3 处理)、光照 0 h /d 变温 5 d-室温
5d-变温培养(B4 处理)、光照 0 h /d 4 ℃处理 5 d
(B5 处理)、光照 12 h /d 变温培养(B6 处理)、光照
12 h /d室温培养(B7 处理)、光照 12 h /d 变温 5 d-
室温培养(B8 处理)、光照 12 h /d 室温 5 d-变温培
养(B9 处理)、光照 12 h /d变温 5 d-室温 5 d-变温培
养(B10 处理)、光照 12 h /d 4 ℃处理 5 d(B11 处
理)，隔天观察并统计相关数据。
室温:未经任何处理的室温条件(南宁市 2013
年 11 月 5 日至 2014 年 2 月 28 日)，通风;变温:置
于光照培养箱中培养，培养温度条件:0∶ 00 ～ 6∶ 00，
15 ℃;6∶ 00 ～ 12∶ 00，21. 6 ℃;12∶ 00 ～ 18∶ 00，25 ℃;
18∶ 00 ～ 24∶ 00，18. 3 ℃;光照 12 h(8∶ 00 ～ 20∶ 00)。
1. 2. 2 种子沙培苗灭菌条件的研究:以长出 2 ～ 3
片真叶、生长健壮的种子沙培苗为转接材料;每一处
理 3 次重复，每一重复接 2 瓶，每瓶接 2 株;继代培
养基均为 MS +蔗糖 30 g /L +琼脂 6 g /L + 6-BA 2. 0
mg /L + NAA 0. 02 mg /L(pH 5. 8 ～ 6. 0);7 d 后统计
污染率和成活率等相关数据。
1. 2. 2. 1 不同灭菌处理对红腺忍冬种子沙培苗灭
菌效果的影响:方法见表 1。
表 1 红腺忍冬种子沙培苗不同灭菌方法
处理 清洗方式
灭菌剂种类及灭菌
时间［75%酒精(s)
+ 0. 1%HgCl2(min)］
培养条件 灭菌方式
C1 无菌水冲洗 0 + 0 密闭培养瓶中 连根整株取出，不灭菌，连根转接
C2 无菌水冲洗 30 + 5 密闭培养瓶中 连根整株取出，仅对下胚轴以下部分进行灭菌，连根转接
C3 无菌水冲洗 30 + 5 密闭培养瓶中 连根整株取出，整株全部灭菌，连根转接
C4 无菌水冲洗 30 + 5 密闭培养瓶中 弃根，整体灭菌，整体转接
C5 洗洁精水刷洗-自来水冲洗 30 + 5 密闭培养瓶中 弃根，整体灭菌，整体转接
C6 洗洁精水刷洗-自来水冲洗 30 + 5 开放花盆中 弃根，整体灭菌，整体转接
1. 2. 2. 2 不同炼苗天数对红腺忍冬种子沙培苗灭
菌效果的影响:将置于培养箱中的组培瓶里长出 2
～ 3 片真叶的沙培苗于室温环境下分别炼苗 0 d(D1
处理)、10 d(D2 处理)、20 d(D3 处理)、30 d(D4 处
理)。常规外植体清洗方法清洗，灭菌处理后转接
至继代培养基中。
1. 3 试验结果与数据处理
1. 3. 1 种子发芽能力指标及统计:萌发以胚轴突
破种皮为准，此时即为初次计数时间。自发芽开始
之日起，每 2 天记录萌发的正常幼苗数，挑出霉变种
·009· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 5 期 2015 年 5 月
子，至无新萌发种子的天数为末次计数时间。以萌
发启动时间、萌发结束时间、发芽持续时间、发芽率、
发芽势作为种子萌发试验评价指标，具体算法如
下〔3，4〕:
萌发启动时间:从接种之日起至开始萌发之日
所经历的天数。
萌发结束时间:从接种之日起，经过萌发期，至
无新萌发种子所经历的天数。
发芽持续时间:从种子开始萌发之日起，至萌发
结束之日，之间所经历的天数。
发芽率(GＲ)=(n /N)× 100%(n 为最终发芽
数，N为供试种子数)。
发芽势(GE)=(ni /N)× 100%(ni为第 i 天种
子发芽达到高峰时正常发芽的种子数，N 为供试种
子数)。
1. 3. 2 试验数据分析:试验数据均采用 DPS 6. 55
软件分析，按照单因子完全随机设计进行试验统计
方差分析，并用 Duncans新复极差法进行多重比较，
得出 5%和 1%水平差异。
2 结果与分析
2. 1 0. 1% HgCl2不同消毒时间对红腺忍冬种子萌
发的影响 从表 2 可知，0. 1% HgCl2不同消毒时间
对红腺忍冬种子的污染率和发芽率的影响均有明显
的差异。随着 0. 1%HgCl2消毒时间的增加，污染率
呈逐渐降低趋势，发芽率则呈低-高-低趋势。A4 处
理的污染率最低，为 7. 78%，此时种子发芽率最低，
仅为 31. 33%;A3 处理的污染率较低，为 15. 56%，
而此时种子发芽率最高，为 51. 11%。综合污染率
和发芽率的比较试验结果，以 A3 处理即:75%酒精
30 s + 0. 1%HgCl2 5 min 较适合用于红腺忍冬种子
的灭菌。
2. 2 不同光照时间和温度条件对红腺忍冬种子萌
表 2 0. 1%HgCl2不同消毒时间对红腺忍冬
种子发芽影响的试验结果
处理 接种量 /粒 平均污染率 /% 平均发芽率 /%
A1 100 22. 22aA 44. 45bB
A2 100 17. 78abB 40. 00cB
A3 100 15. 56bB 51. 11aA
A4 100 7. 78cC 31. 33dC
注:同列不同小写字母表示有显著性差异，P ＜ 0. 05;同列不同
大写字母表示有极显著性差异，P ＜ 0. 01
发的影响 从表 3 可以看出，不同光照时间和温度
条件对红腺忍冬种子的萌发启动时间、萌发结束时
间、发芽持续时间、发芽率及发芽势的影响程度均不
同。总体上，光照对种子萌发的影响要大于温度的
影响。相同温度处理条件下，光培养(B7 ～ B11 处
理)比暗培养(B1 ～ B5 处理)种子发芽持续时间短，
发芽率和发芽势高。相同的光照培养条件下，培养
箱条件下的变温(B6 处理)与室温条件下的变温
(B7 处理)相比较，种子萌发启动早，但出苗不齐
(发芽持续时间长)，发芽率和发芽势略低。说明两
种方式的变温处理效果不尽相同，室温处理要优于
培养箱的变温处理;室温和培养箱变温处理的组合
对种子萌发也有很大影响(B8、B9、B10 处理)，组合
次序不同，效果也不同:先经过培养箱变温处理，然
后再放到室温下(B8 处理)，种子的发芽率和发芽
势最高;而先是室温处理，再放到培养箱变温处理
(B9 处理)，发芽率及发芽势均低于 B8 处理;4 ℃冷
藏处理(B5、B11 处理)对红腺忍冬种子的萌发没有
促进作用，发芽率和发芽势在暗培养下均最低。综
合种子萌发启动时间、发芽持续时间及发芽率和发
芽势，B8 处理(光照 12 h /d 变温 5 d-室温培养)为
红腺忍冬种子发芽的最适条件，其发芽率最高，出芽
较快且齐。
表 3 不同光照时间和温度条件对红腺忍冬种子萌发的试验结果
处理 萌发启动时间 /d 萌发结束时间 /d 发芽持续时间 /d 平均发芽率 /% 平均发芽势 /%
B1 35. 33cCD 86. 33dC 51. 33bcB 38. 03bcBC 29. 00cdBC
B2 46. 00bBC 104. 67abcAB 54. 33bB 63. 39abAB 50. 20abAB
B3 63. 00aA 110. 67aA 49. 67bcB 20. 18cC 14. 29cdC
B4 64. 00aA 111. 33aA 47. 67bcB 25. 62cBC 16. 96cdC
B5 56. 00abAB 100. 00abcABC 43. 00bcB 20. 51cC 7. 69dC
B6 23. 67dD 107. 67abAB 84. 00aA 34. 76cBC 25. 81cdBC
B7 47. 33bBC 92. 33cdBC 45. 00bcB 43. 63bcABC 34. 28bcBC
B8 49. 33bABC 99. 33abcABC 46. 33bcB 75. 49aA 68. 36aA
B9 60. 33aAB 108. 33abAB 12. 67dC 35. 96bcBC 19. 69cdC
B10 63. 00aA 111. 67aA 48. 33bcB 26. 29cBC 21. 07cdBC
B11 56. 00abAB 96. 00bcdABC 39. 00cB 24. 62cBC 7. 69dC
注:同列不同小写字母表示有显著性差异，P ＜ 0. 05;同列不同大写字母表示有极显著性差异，P ＜ 0. 01
·109·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 5 期 2015 年 5 月
2. 3 不同灭菌方法对红腺忍冬种子沙培苗灭菌效
果的影响 由表 4 可知，6 个处理的种子苗成活率
均为 100%，但不同灭菌方式对红腺忍冬种子沙培
苗灭菌效果差异显著:就灭菌效果而言，洗洁精水刷
洗-自来水冲洗之后进行灭菌(C5、C6 处理)效果明
显优于用无菌水冲洗之后进行灭菌(C1 ～ C4 处
理);就灭菌方式和苗的生长状况而言，弃根转接
(C4 ～ C6 处理)的效果优于连根转接(C1 ～ C3 处
理)，而其中开放式的沙基培养(C6 处理)又优于封
闭式的沙基培养(C4、C5 处理)。由此可以看出，弃
根的开放沙基培养苗下胚轴以上部分用洗洁精水刷
洗-自来水冲洗之后进行灭菌(C6 处理)的效果最
好，能够得到较壮的苗。
表 4 不同灭菌方法对红腺忍冬种子沙培苗
灭菌效果的影响
处理 平均污染率 /% 平均成活率 /% 苗生长状况
C1 100. 00aA 100. 00aA －
C2 100. 00aA 100. 00aA －
C3 60. 00bB 100. 00aA +
C4 50. 00cC 100. 00aA ++
C5 14. 29dD 100. 00aA ++
C6 0. 00eE 100. 00aA +++
注:同列不同小写字母表示有显著性差异，P ＜ 0. 05;同列不同
大写字母表示有极显著性差异，P ＜ 0. 01。 －:差;+:好;++:较好;
+++:最好
2. 4 不同炼苗天数对红腺忍冬种子沙培苗灭菌效
果的影响 从表 5 中可以看出，随着炼苗天数的增
加，平均污染率逐渐降低;未经过炼苗直接进行灭菌
处理的组合，污染严重，平均污染率高达 100%;炼
苗 30 d 时，污染率最低，为 50. 00%，此时平均成活
率高达 100%，培养 2 w 后苗的生长状况最好。开
放培养的沙培苗作外植体的灭菌效果明显优于封闭
式培养的效果，由此可以推断，以经过炼苗的种子沙
培苗为外植体有利于污染率的降低。因此，有必要
对炼苗天数进行摸索，以期获得更好的灭菌效果。
表 5 不同炼苗天数对红腺忍冬种子沙培苗
灭菌效果的影响
处理
炼苗天数
/d
平均
污染率 /%
平均
成活率 /% 苗生长状况
D1 0 100. 00aA 100. 00aA －
D2 10 100. 00aA 100. 00aA +
D3 20 60. 00bB 100. 00aA ++
D4 30 50. 00cC 100. 00aA +++
注:同列不同小写字母表示有显著性差异，P ＜ 0. 05;同列不同
大写字母表示有极显著性差异，P ＜ 0. 01。 －:差;+好;++:较好;
+++:最好
3 讨论
3. 1 影响红腺忍冬种子萌发的相关因素 植物组
织培养过程中，外植体灭菌是影响污染和种子萌发
的关键因子〔5〕。本试验中，在相同种类的灭菌剂消
毒条件下，灭菌时间对红腺忍冬种子外植体的污染
和萌发有很大影响。不同植物种子对不同消毒剂的
耐受力不同，种子消毒时间过长，虽然灭菌效果好，
但种子发芽率会下降。本试验中，在 75%酒精 30 s
+ 0. 1% HgCl2 5 min 灭菌条件下污染率较低，为
15. 56%，种子发芽率为 51. 11%，略高于文献报道
的常规播种繁殖出苗率 49. 0%〔6〕。
光照和温度是影响种子萌发的重要条件。在本
试验中，红腺忍冬种子在光培养条件下的发芽率和
发芽势均高于暗培养，但在光、暗培养条件下均可以
萌发，说明红腺忍冬种子属于兼光型种子。与大多
数种子一样，红腺忍冬种子萌发对温度比对光反应
更为敏感:低温阻碍了红腺忍冬种子萌发，变温处理
有利于红腺种子萌发。本研究中，光照 12 h /d 的变
温-室温培养条件下的红腺忍冬种子发芽率最高且
出苗较为整齐。这可能是由于光照能够促进种子的
新陈代谢〔7〕，而前期的变温处理则有利于种皮的软
化及吸水，加快贮藏的养分变成胚能利用的可溶性
状态，从而促进种子萌发〔7，8〕。
3. 2 红腺忍冬种子沙培苗灭菌效果的影响因素
本试验表明，尽管播种前对河沙及种子进行消毒灭
菌处理，但萌发的沙培苗仍带菌，转接至培养基中时
必须对其进行洗洁精水刷洗-自来水冲洗之后进行
外植体灭菌处理。
不同取材部位、材料大小、年龄及不同取材时
期，其带菌量均不同〔9〕。本试验中的沙培苗根部与
河沙接触导致带菌量最多，因此弃根灭菌比整株灭
菌效果要好。而在弃根处理中，暴露于空气中(开
放花盆中)的沙培苗灭菌效果明显优于密闭培养瓶
中的灭菌效果，一方面是花盆中的沙培苗处于湿度
较小的环境，苗带菌量少;另一方面，暴露于空气中
的种苗处于炼苗状态，比处于封闭状态的培养瓶苗
健壮且有较强的抗逆性能，直接提高了外植体对灭
菌剂的耐受能力〔10，11〕。炼苗时间越长，红腺忍冬种
子沙培苗的灭菌效果越好，苗的生长状况越好。
4 结论
本研究结果表明，适宜红腺忍冬种子发芽的灭
菌处理组合为 75%酒精 30 s + 0. 1%HgCl2 5 min;光
照 12 h /d的变温-室温培养更利于促进红腺忍冬种
子萌发及整齐出苗;对红腺忍冬种子沙培苗要经过
常规的外植体灭菌处理;弃根的开放沙基培养苗下
胚轴以上部分，经常规外植体清洗后的灭菌效果较
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好;继代之前，需炼苗 30 d 之后再进行常规的外植
体灭菌。
参 考 文 献
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