全 文 ：中国农学通报 2011,27(16):79-83
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
三翅槭（Acer trialum L．）为槭属（Acer）植物一新
种[1]，其主要特征是翅果常具三翅。迄今为止，仅在云
南省昆明市西南林业大学内发现了唯一的1株。前人
就三翅槭在槭属的分类地位进行过研究，主要基于形
态学方面。三翅槭与槭属其他 17个种的木材解剖学
研究结果表明，三翅槭木射线含有槭属中少见的丰富
菱形或方晶体特征，其区别于槭属其他种的最明显特
征是木射线含有大型异细胞[2]。花形态研究也表明，
三翅槭的花形态结构与槭属三角枫的花形态结构存在
明显不同，三翅槭雌蕊柱头多为3裂，子房多为3室；三
角枫的雌蕊柱头为2裂，子房为2室[3-4]。以上研究结果
表明，从形态学上三翅槭与槭属其他种存在显著差异，
从而为其成为槭属的一个新种奠定了基础。
基金项目：云南省“省部级重点学科、省高校重点实验室及校实验室共享平台”；西南林业大学校级重点项目“茶树EST-SSR在云南山茶花中的通用
性及群体遗传学研究”（110909）；云南省应用基础面上项目“滇西北不同海拔丽江云杉遗传变异及其适应性研究”（2010ZC267）。
第一作者简介：程小毛，女，1979年出生，讲师，博士，研究方向为林木遗传育种。通信地址：650224云南省昆明市白龙寺300号西南林业大学园林学
院，Tel：0871-3863023，E-mail：xmcheng0103@gmail.com。
通讯作者：黄晓霞，女，1980年出生，四川成都人，讲师，博士，研究方向为植物生理生态。通信地址：650224云南省昆明市白龙寺300号西南林业大
学园林学院，Tel：0871-3863023，E-mail：huangxx@swfu.edu.cn。
收稿日期：2011-04-06，修回日期：2011-05-22。
基于AFLP标记技术的三翅槭与三角枫亲缘关系分析
程小毛，岳 琳，黄晓霞
（西南林业大学园林学院，昆明 650224）
摘 要：为了从分子水平上揭示三翅槭与三角枫的亲缘关系，明确三翅槭在槭属中的分类地位，利用
AFLP分子标记技术对三翅槭1份材料和三角枫4份材料进行亲缘关系检测，并采用UPGMA法进行聚
类分析。结果表明：8对引物组合共获得202条谱带，其中99条带具有多态性，多态性比率为49.01%，说
明AFLP标记技术适用于三翅槭和三角枫亲缘关系研究。聚类分析表明，在遗传相似系数为0.71时，可
将三翅槭和三角枫划分成2个相互独立的类群，说明三翅槭与三角枫在分子水平上的分类与形态学上
的分类一致，此外三翅槭与三角枫之间的遗传相似系数为0.71也表明它们之间的亲缘关系较近。通过
AFLP分子标记，成功分析了三翅槭与三角枫亲缘关系，为证明三翅槭是槭属新种提供了分子证据。
关键词：三翅槭；三角枫；AFLP；亲缘关系
中图分类号：Q75 文献标志码：A 论文编号：2011-0964
Analysis on the Genetic Relationship of Acer trialum L. and Acer buergerianum Miq. by AFLP
Cheng Xiaomao, Yue Lin, Huang Xiaoxia
(College of Landscape and Architecture, Southwest Forestry University, Kunming 650224)
Abstract: In order to make clear the taxonomic status of Acer trialum L. in Acer genus, the genetic
relationship between Acer trialum L. and Acer buergerianum Miq. was studied based on AFLP (amplified
fragment length polymorphism) technique. A tree diagram was constructed using UPGMA method. The results
showed that 202 bands were amplified with 8 primer pairs. Among them, 99 bands were polymorphic (49.01%).
The result showed that AFLP could be used to analyze genetic relationship between Acer trialum L. and Acer
buergerianum Miq.. Cluster analysis showed that Acer trialum L. and Acer buergerianum Miq. were divided
into 2 different groups, respectively. According to the results, Acer trialum L. was a new specie of the genus of
Acer by AFLP molecular evidence.
Key words: Acer trialum L.; Acer buergerianum Miq.; AFLP; genetic relationship
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AFLP标记具有不需要预先知道基因组背景、多
态位点丰富、灵敏度高和重复性好等优点[5]。AFLP问
世后便在植物基因定位、遗传连锁图谱构建、群体遗传
结构及多样性研究、演化和亲缘关系研究等方面得到
了广泛的应用[6-10]。而对于三翅槭而言，目前尚无从分
子水平上明确三翅槭在槭属中的分类地位的相关研究
报道。因此，笔者首次采用AFLP分子标记技术对三
翅槭与三角枫亲缘关系进行研究，以期从分子水平上
揭示三翅槭与三角枫的亲缘关系，为槭属植物分类提
供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
试验于2010年7月—9月在西南林业大学园林学
院园林植物遗传育种实验室内进行。
1.2 试验材料
供试材料为三翅槭和三角枫，三翅槭采自云南省
西南林业大学校园，三角枫采自昆明翠湖公园（2份）
和昆明世博园（2份）。引物由上海生工合成，Taq酶、
10×PCR Buffer（Mg2+）、dNTP、T4 DNA ligase、EcoRⅠ
和MseⅠ等均购自天根生化科技（北京）有限公司，其
他生化试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 试验方法
1.3.1 基因组DNA的抽提 采用改良CTAB法 [11]从幼
嫩叶片中抽提基因组DNA，采用 1%的琼脂糖凝胶电
泳检测DNA质量。
1.3.2 酶切连接体系 用限制性内切酶EcoRⅠ和Mse
Ⅰ双酶切基因组DNA，参考金钱槭基因组双酶切体
系，略作修改[12]。酶切体系为：37℃ 5 h，65℃1 h（酶切
反应总体积为 12.5 μL，包括 10×R+buffer 1.25 μL，总
DNA 150 ng，EcoRⅠ2.5 U，MseⅠ1.5 U，加超纯水至
12.5 μL）。酶切完成后，加 12.5 μL连接混合液，包括
T4 DNA ligase 0.75 U，T4 Buffer 2.50 μL，5 μmol/L
Ead 0.5 μL，5 μmol/L Mad 0.5 μL，ddH2O 8.35 μL。
22℃ 2 h后置于 4℃冰箱中过夜（8~10 h），70℃灭活
10 min后，将产物稀释5倍，置于-20℃冰箱备用。
接 头 序 列 如 下 ： EcoR Ⅰ adapter 5’
CTCGTAGACTGCGTACC 3’；5’AATTGGTACGCA
GTC 3’；MseⅠadapter 5’GACGATGAGTCCTGAG 3’；
5’TACTCAGGACTCAT 3’。
1.3.3 PCR反应体系 预扩增反应体系为 25 μL体系，
包括 10×PCR Buffer（Mg2 +）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP
2 μL，10 μmol/L primer 1 μL，5×连接产物 5 μL，5 U/μL
Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 13.3 μL。
预扩增程序如下：94℃预变性 3 min；94℃变性
30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 l min，30个循环；72℃后
延伸 5 min，4℃保温。取 5.0 μL预扩增产物与 3 μL上
样缓冲液混合后，在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测预扩
增效果。将预扩产物稀释 20~30倍，作为选择性扩增
模板。
预扩引物：EA：5’GACTGCGTACCAATTCA 3’；
MC：5’GATGAGTCCTGAGTAAC 3’。
选择性扩增反应体系为10 μL体系，包括10×PCR
Buffer（Mg2 + ）1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，
10 μmmol/L primer 0.8 μL，预扩产物 2 μL，5 U/μL Taq
DNA聚合酶0.15 μL，ddH2O 5.65 μL。
选择性扩增程序如下：94℃预变性 3 min；94℃变
性 30 s，65℃退火 30 s，72℃延伸 l min，每个循环降
0.7℃，13个循环；94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延
伸 l min，30个循环；72℃后延伸 5 min，4℃保温。选择
性扩增引物序列和编号，见表1。
1.3.4 PAGE凝胶电泳检测 在选扩产物中加入等体积
的上样缓冲液充分混匀，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上
电泳，电泳仪型号为北京六一DYCZ-20C，电压2500 V，
电流 50 mA，功率 80 W，预电泳 1 h后上样 4 μL，再电
泳1 h。电泳后采用银染方法进行显影[13]。
1.3.5 带型记录与数据分析 扩增产物在相同迁移位置
上的有带记为 1，无带记为 0。在NTSYS-pc统计分析
软件[14]中，计算材料间的Dice遗传相似系数（GS），按
表1 研究利用的AFLP选择性扩增引物
EcoRI
引物序列
EA02
EA03
EA06
编号
EA+AT
EA+AC
EA+TT
MseI
引物序列
MC01
MC02
MC03
MC04
MC05
MC06
MC07
MC08
MC09
MC10
MC11
MC12
MC13
MC14
MC15
MC16
编号
MC+AA
MC+AT
MC+AC
MC+AG
MC+TA
MC+TT
MC+TC
MC+TG
MC+CA
MC+CT
MC+CC
MC+CG
MC+GA
MC+GT
MC+GC
MC+GG
·· 80
程小毛等：基于AFLP标记技术的三翅槭与三角枫亲缘关系分析
EA6MC131 2 3 4 5 1 2 3 4 51 2 3 4 5 1 2 3 4 5 MEA6MC14 EA6MC15 EA6MC16
200 bp
300 bp
400 bp500 bp
600 bp700 bp
800 bp900 bp
1000 bp
不加权成对算术平均法（UPGMA）构建系统聚类分枝
树状图。
2 结果与分析
2.1 DNA抽提质量检测
用紫外分光光度计对所抽提的DNA进行质量检
测。结果表明，OD260/OD280值约 1.8，说明DNA质量较
好。1%琼脂糖凝胶检测发现DNA条带清晰完整，无
弥散状，说明RNA去除干净，点样孔清晰、无发亮现
象，说明杂质去除干净，DNA纯度较高（见图1）。
2.2 AFLP多态性分析
利用 EA02MC01-EA02MC05、EA03MC01-EA03
MC06和EA06MC01-EA06MC16引物组合方式对三角
枫和三翅槭进行扩增，从27对引物组合中筛选出8对扩
增条带清晰的引物组合。这8对引物对5个材料进行扩
增，共扩增出202条带，其中多态性带99条，多态性带数
占总扩增带数的49.01%，各组合扩增的带数在11~42之
间，平均每个组合扩增出25.3条带和12.4条多态性带，
其中扩增带数最多的引物组合为EA06MC07，最少的
为 EA06MC15，多态性最高的组合为 EA06MC06（见
表 2）。图 2为 4对AFLP引物组合对 5份供试材料的
扩增图谱。从图2可以看出，4对引物扩增的条带主要
集中在 200~900 bp之间，主要有 4种特异性条带：（1）
翠湖三角枫和世博三角枫共同的特异性带；（2）翠湖三
角枫特有的特异性条带；（3）世博三角枫特有的特异性
条带；（4）三翅槭特有的特异性条带。
2.3 聚类结果
采用UPGMA法对三翅槭和三角枫进行聚类分
析。结果表明，在相似系数为0.71时，处可明显分为2
大类群：编号1、2、3、4均为三角枫；编号5为三翅槭；在
相似系数为 0.78时，可以分为 3大类群：编号 1和 2来
源于翠湖公园的三角枫聚在一起，而编号为3和4的来
源于世博园的三角枫聚在一起，三翅槭单独聚为一
类。由此可见，本研究聚类结果与根据生物学性状传
统分类结果基本一致，不同种间存在遗传差异，并且同
一种不同材料间存在一定的分化现象。在聚类图中，
三翅槭与三角枫间的遗传距离为 0.71，表明三翅槭与
M 1 2 3 4 5 6
2000 bp
1500 bp750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2000 b
1500 b
50 bp
00 bp
50 bp
00 bp
M 1 2 3 4 5 6
EA6 13 EA6 C15EA6 14 EA6MC16
3 3 34 5 1 2 3 41 2 34 5
0 0bp
900bp
800bp
700bp
600bp
500bp
400bp
300bp
200bp
M：DL2000 DNA Marker；1：λDNA；2：三翅槭（Acer trialum L.）；3~4：翠
湖三角枫（Acer buergerianum Miq.）；5~6：世博三角枫（Acer
buergerianum Miq.）
图1 改良CTAB法抽提的DNA琼脂糖凝胶检测电泳图
M：DNA Marker；1~2：翠湖三角枫；3~4：世博三角枫；5：三翅槭
图2 4对AFLP引物对5个材料的扩增图谱
引物组合
EA06MC06
EA06MC07
EA06MC10
EA06MC11
EA06MC13
EA06MC14
EA06MC15
EA06MC16
总数
扩增带数
22
42
15
11
21
40
20
31
202
多态性带数
14
21
8
2
13
19
3
19
99
多态性带数比率/%
63.65
50.00
53.33
18.18
61.90
47.50
15.00
61.29
49.01
表2 8对引物对5个供试材料的扩增结果
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0.71 0.75 0.79
Coefficient
0.83 0.87
5
4
3
1
2
1~2：翠湖三角枫；3~4：世博三角枫；5：三翅槭
图3 基于UPGMA法三翅槭与三角枫聚类系统树
三角枫间有较强的亲缘关系（见图3）。
3 结论
AFLP分子标记扩增条带的多态性反映了不同类
群的起源演化，认识分子标记在不同类群植物扩增条
带的多样性与起源演化的联系，可为系统分类提供有
效的证据。笔者通过UPGMA法进行聚类分析，发现
AFLP分子标记技术能够克服仅依靠形态特征判断系
统分类所产生的经验性偏差，而快速客观地鉴定三翅
槭与三角枫亲缘关系，并且聚类结果与传统的基于形
态学分类的结果一致，说明AFLP分子标记为三翅槭
与三角枫亲缘关系提供了明晰、可信的分类证据。笔
者结合前人形态学分析结果[1,2,4]认为，三翅槭与三角枫
虽然是槭属的 2个不同种，但是它们存在非常近的亲
缘关系。
4 讨论
AFLP标记技术是 1995年 Vos等 [5]发明的一项
DNA指纹技术，通过对基因组 DNA酶切片段进行
PCR选择性扩增，以检测DNA酶切片段长度多态性的
分子标记技术。近年来，由于其信息量大及快速高效
等特点，在生物系统演化方面得到广泛应用[8-11]。笔者
选用 8对引物组合，对 5个供试材料进行AFLP扩增，
共扩增出202条带，其中多态性带99条，占总扩增带的
49.01%，说明利用AFLP分子标记技术能够较为清晰
地把三翅槭与三角枫区分开，并表明它们之间的亲缘
关系。
在槭属植物起源演化及分类方面，前人已做了多
方面的研究，主要是根据形态、分类系统、地理分布、化
石材料和系统发育进行分类[15-17]。前人对槭属的分类
主要依据为形态学性状上的差异，而槭属植物在分子
标记上的亲缘关系分类研究较少。三翅槭是近年来云
南西南林业大学邓莉兰等[1]发现的槭属的新种，对于
三翅槭与槭属其他种基于分子标记的亲缘关系研究尚
未有报道。笔者首次通过AFLP分子标记技术研究三
翅槭与三角枫之间的亲缘关系，通过聚类分析发现三
翅槭与三角枫聚为不同的类群，它们之间的相似系数
为0.71，说明三翅槭和三角枫之间的亲缘关系较近，而
三翅槭木材解剖学研究也表明三翅槭与槭属其他种在
木材解剖学特征上有许多相似之处[2]。此外，黄晓霞[4]
也研究表明三翅槭的营养器官如树形、叶片、芽鳞等与
三角枫的营养器官非常相似，但它们在花及花粉形态
上存在一定差异。三翅槭形态学研究表明，三翅槭与
三角枫在形态学上是不同的类群，这与本研究三翅槭
和三角枫在分子水平上聚类分析结果吻合。
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