全 文 ：阔叶风铃草多倍体诱导与鉴定
苏小玲 1, 2, 3 ,张双双 1, 2, 3 ,许雯婷 1, 2, 3 ,胡冬梅 1, 2, 3 ,张金凤 1, 2, 3＊　
(1.北京林业大学林木育种国家工程实验室 ,北京 100083;2.北京林业大学林木、花卉遗传育种教育部重点开放实验室, 北京 100083;3.国家林
业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室 ,北京 100083)
摘要　培养的倍体能显著提高园林植物的观赏和利用价值。在离体培养条件下 ,比较了不同浓度、不同处理时间的秋水仙素对阔叶风
铃草进行染色体加倍的诱导效果。结果表明 ,当秋水仙素浓度为 0.10%,处理 24h后变异率达到最高 ,为 30%,诱导效果最好。从形态
变异苗中鉴定出 1株四倍体 ,四倍体植株与原二倍体植株比较 ,在形态上表现为:生长缓慢 , 生长期延长 ,叶片气孔变大 ,叶绿体数目增
多 ,叶片变厚 ,叶色变深 ,茎变粗且节距长。
关键词　阔叶风铃草;秋水仙素;多倍体诱导;变异率
中图分类号　Q943　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)21-11627-03
PloyploidInductionandIdentificationofCampanulaatifolia
SUXiao-lingetal　 (NationalEngineeringLaboratoryforTreeBreeding, BeijingForestryUniversity, Beijing100083)
Abstract　Polyploidbreedingcansignificantlyimprovetheomamentalandutilityvalueoflandscapeplants, invitrocultureofCampanulaati-
foliawastreatedwithcolchicinesatdifferentconcentrationandtimeduration.Itshowedthattheinductionratecouldreach30%withcolchi-
cinesat0.10%for24h.Identifiedatetraploidfromthemorphologicalvariationseedlings, comparedwiththenormaldiploidplants, thetetra-
ploidhadslowgrowth, longergrowingphase, largerstomata, morechloroplasts, thickerleafanddarkerleafcolor, strongerstemswithlonger
lengthperstemstalk.
Keywords　 Campanulaatifolia;Colchicum;Polyploidinduction;Variationrate
基金项目　北京市园林绿化局计划项目(YLHH2010001011)。
作者简介　苏小玲(1983-),女 ,湖北荆州人 ,硕士研究生 , 研究方向:
林木遗传育种。 ＊通迅作者 ,博士 , 教授 , 博士生导师 , E-
mail:zjf@bjfu.edu.cn。
收稿日期　 2010-05-31
　　阔叶风铃草(Campanulaatifolia)为桔梗科风铃草属多年
生草本 ,常作 2年生栽培。原产欧亚两洲 ,现我国各地都有
栽培 ,其生命力强 ,花色明丽素雅 ,花形酷似风铃 ,是布置花
坛 、花境或点缀草坪 、道路的优良材料 ,亦可作盆花栽培 。但
在我国 ,阔叶风铃草却一直处于野生状态 ,沦为荒野路边的
杂草。目前 ,国内外对风铃草的研究包括多倍体诱导还很
少 ,缺乏有价值的相关资料。笔者选用野生的阔叶风铃草为
材料 ,利用秋水仙素对风铃草试管苗的茎尖进行多倍体诱
导 ,以期培育出花大 、色多 、抗性强的新类型阔叶风铃草。
1　材料与方法
1.1　试验材料　该验在北京林业大学生物学院林业楼组织
培养实验室中进行 ,以北京东升种业有限公司提供的野生阔
叶风铃种子播种到 MS培养基上所得的幼苗为试验材料。
1.2　试验方法
1.2.1　多倍体的诱导。选择在培养基上培养 20d左右的无
菌试管苗中生长健壮的株系上的 1个芽变 ,经灭菌消毒后 ,接
种于 MS+BA0.1 mg/L+KT0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L培养
基上培养 ,作为对照材料。20 d左右的时候将部分对照材料嫩
茎按每段 0.5 cm且带 1个节截取 ,并将每节叶子去半 ,减少水
分蒸发。然后用 0.02%、0.05%、0.10%秋水仙素处理 ,时间分
别为 12、24、36、48、68h,处理后用无菌水漂洗 3次 ,接种到 MS
+BA0.1mg/L+KT0.1mg/L+NAA0.1mg/L培养基上培养。
每日光照 16 h,光强 1 200lx,温度 25℃。
1.2.2　多倍体的鉴定。采用了形态学观察 、细胞学观察 、流
式细胞分析法 、染色体计数法 4种方法进行了鉴定。
经过秋水仙素处理的外植体在培养基上培养一段时间
后 ,待长出 2 ～3轮叶片后 ,选取生长健壮的叶片 ,撕取其叶
片下表皮制片 ,在显微镜下观察气孔大小及气孔保卫细胞叶
绿体数目 ,并与二倍体植株相应数据进行对比 。细胞学观察
参照张凌媛等 [ 1]的方法进行。
对采用形态学及细胞学观察初步断定为多倍体的植株
进行流式细胞计数和染色体计数。流式计数参考 deLaat
等 [ 2] 、Weber等 [ 3] 、周伟军等 [ 4]的方法 ,在北京市农林科学院
蔬菜研究中心的协助下完成 。染色体计数参照魏爱民等 [ 5]
的方法进行。在 10:00左右取其叶缘 ,用卡诺固定约 12 h,蒸
馏水清洗干净后转入 1 mol/L盐酸溶液中于 60 ℃恒温下处
理 12min,醋酸洋红染色 20 min,压片 ,镜检。观察并统计 30
个细胞的染色体数目 ,并与二倍体植株相应数据进行对比 。
1.2.3　多倍体的扩繁。对确认为纯多倍体的植株进行扩
繁 ,并重复试验。
2　结果与分析
2.1　秋水仙素对风铃草的诱导效果　表 1数据显示 ,秋水
仙素对风铃草多倍体诱导具有一定效果 ,当秋水仙素浓度为
0.10%,处理 24h时 ,变异率达到最高 ,为 30%。随着秋水仙
素浓度的增高 ,处理时间的延长 ,组培苗的死亡率过高导致
总诱导率下降。
2.2　变异植株形态特征的观察　与对照植株进行比较发现
(图 1、2),经诱变处理的植株生长缓慢 ,生长期延长 ,叶片变
厚 ,叶片颜色变深 ,地表茎比二倍体粗壮 ,节间变长。
2.3　变异植株细胞学观察　通过光学显微镜观察正常植
株(图 3)与变异植株(图 4)的叶下表皮细胞的气孔大小和密
度发现 ,变异植株气孔保卫细胞明显增大 ,单位叶面积气孔
数目减少 ,叶绿体数目增多。试验中也观察到 ,在同一植株
或同一表皮上的气孔大小差异明显 ,此植株多为嵌合体 [ 6] 。
2.4　流式细胞检测　以正常植株作对照 ,取同样大小的叶
片进行流式检测 ,将对照出现峰值的地方作为基准 ,检测变
异株 ,观察其出现峰值的地方偏移程度。由图 5、6可见 ,通
过诱导 ,获得了 1株四倍体 。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(21):11627-11629 责任编辑　李菲菲　责任校对　卢瑶
表 1　离体培养条件下秋水仙素对阔叶风铃草的诱导效果
Table1　TheinductionefectofcolchicinesonCampanulaatifoliainvitro
秋水仙素浓度∥%
Colchicinesconcentration
时间∥h
Time
处理株数
Numberoftreatedplants
死亡株数
Numberofdeadplants
死亡率∥%
Deathrate
变异株数
Numberofvariation
变异率∥%
Variationrate
0.02 12 30 0 0 0 0
24 30 0 0 4 13.3
36 30 0 0 5 16.7
48 30 5 16.7 3 10.0
68 30 10 33.3 1 3.3
0.05 12 30 0 0 0 0
24 30 0 0 6 20.0
36 30 3 10.0 3 10.0
48 30 8 26.7 2 6.7
68 30 19 63.3 1 3.3
0.10 12 30 5 16.7 4 13.3
24 30 11 36.7 9 30.0
36 30 15 50.0 8 26.7
48 30 25 83.3 1 3.3
68 30 30 98.0 0 0
图 1　正常风铃草组培苗
Fig.1　NormalC.atifoliatissueculture
图 2　变异后风铃草组培苗
Fig.2　VariantC.atifoliatissueculture
图 3　正常的风铃草组培苗气孔保卫细胞
Fig.3　NormalC.atifoliatissueculturestomatalguardcels
图 4　诱变后的风铃草组培苗气孔保卫细胞
Fig.4　Stomatalguardcelsaftermutagenesischaracterizedby
flowcytometer
图 5　正常风铃草植株叶片中DNA含量分布曲线
Fig.5　DNAcontentofnormalplantcharacterizedbyflowcy-
tometer
2.5　染色体计数　通过光学显微镜下正常风铃草植株(图
7)与变异风铃草植株(图 8)的叶缘染色体计数观察 ,发现变
异风铃草植株的细胞体积增大 ,染色体数目明显增多。
3　结论与讨论
(1)该研究中 ,用 0.10%秋水仙碱溶液处理阔叶风铃草
无菌苗 24h,得到较高的变异苗 ,并从中鉴定出 1株四倍体。
由此说明 ,用无菌苗诱导阔叶风铃草多倍体是可行的。
(2)试验证明 ,以组培苗为材料 ,在无菌条件下用秋水仙
素处理后 ,变异十分明显 ,处理浓度以 0.10%,处理 24h的诱
变效果最好 ,随着秋水仙素浓度的增高 ,处理时间的延长 ,组
培苗的死亡率过高导致总诱导率下降。参考秋水仙素诱导
11628 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
图 6　变异风铃草植株叶片中 DNA含量分布曲线
Fig.6　DNAcontentofmutationalC.atifolialeafcharacterized
byflowcytometer
图 7　正常风铃草植株二倍体细胞染色体
Fig.7　NormalC.atifoliadiploidcelchromosome
图 8　诱变后风铃草植株的细胞染色体
Fig.8　C.atifoliacelchromosomeaftermutagenesis
东方百合 、彩色马蹄莲等多倍体的适宜浓度与时间都是
0.05%、24h[ 7-8] ,结合该试验结果 ,发现尽管不同作物的最
佳处理浓度不同 ,但最佳处理时间均为 24 h,这可能是细胞
分裂周期及秋水仙素作用最佳时期所致。
(3)根据气孔观察初步鉴定 ,秋水仙素诱导后有部分植
株形成嵌合体。由于嵌合体产生的变异细胞生活力较弱 、分
裂速度慢 ,而正常二倍体细胞生活力强 、分裂快 ,导致变异细
胞竞争不过二倍体 ,从而产生回复突变 ,最后变成正常的二
倍体。该研究中选取了部分变异植株的茎段培养在 MS+BA
0.1 mg/L+KT0.1mg/L+NAA0.1mg/L培养基上再次诱导
产生不定芽 ,然后通过多次继代培养 ,从而达到稳定的目的 。
(4)气孔鉴定操作简单 ,可作为多倍体鉴定的间接方法。
试验表明 ,风铃草多倍体的气孔一致地明显大于二倍体气
孔 ,鉴定结果很有参考价值 ,经气孔鉴定有明显变异的植株
再进行流式细胞检测和染色体计数可大大节省时间 ,减少工
作量 ,提高工作效率。
(5)利用组织培养能提高变异植株的繁殖速率 ,不仅可
缩短多倍体育种年限 ,而且可使新品种在短时期内得以推广
应用。
(6)多倍体用于无性繁殖的花卉上 ,会表现出组织和器
官的巨大性 ,茎秆粗壮 、叶片宽厚 、叶面粗糙 、叶色加深 、花冠
大而厚实 、花瓣增多 、颜色浓艳 ,可大大提高观赏价值和经济
价值 ,现已在兰花 、百合 、金鱼草 、萱草 、矮牵牛 、中国桔梗等
花卉上取得了优良成果 [ 9-10] 。该试验中风铃草多倍体组培
苗叶片较二倍体叶片明显大且厚 ,叶色深 ,生长强壮 ,初步体
现了多倍体在形态上的优势。根据多倍体花卉的特点 ,笔者
预测四倍体风铃草的花应该会大于二倍体花 ,观赏价值也应
该优于二倍体 ,该研究诱导获得的风铃草多倍体植株尚未能
成花 ,这将在后续的研究中进一步开展。
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1162938卷 21期　　　　　　　　　　　　　　　　苏小玲等　阔叶风铃草多倍体诱导与鉴定