全 文 ：第3期
十字花科植物菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的根为
板蓝根,叶为大青叶,两者均有清热解毒、凉血消斑、
抗菌消炎等功效。临床上用途较广,广泛用于治疗多
种疾病如流感、腮腺炎、乙脑、肝炎等,化学成分研究
表明其含有靛蓝、靛玉红、有机酸、多糖等成分。文献
报道板蓝根中多糖组分具有免疫调节作用,对特异
性免疫、非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫均有一
定的促进作用[1,2],此外尚有降血脂作用[3],是公认具
有很好的抗病毒、抗炎疗效的中药之一。大青叶的有
效成分靛玉红还对治疗慢性粒细胞白血病有较好的
作用,是一种有重要开发前景的药用植物。
多倍体植株突出表现在根、茎、叶器官上具有巨
型性,以及能大幅度提高产量,抗逆性增强,药用活
性成分提高等特性,在中医药国际化、现代化的今
天,对中药的需求量越来越大,通过多倍体诱导的研
究可以解决目前药材资源匮乏的问题。目前,由第二
军医大学的乔传卓利用菘蓝的萌动种子已经成功的
诱导并纯化得到稳定的四倍体菘蓝,本实验虽然也
是利用萌动的菘蓝种子来诱导多倍体,但是在利用
秋水仙素对菘蓝处理方法及处理的影响方面做了更
详细的分析。
1 材料与方法
1.1试验材料
供试菘蓝种子由大庆市大同医药有限公司提
供。
菘 蓝 的 多 倍 体 诱 导 研 究
刘丽萍,王丽艳,殷奎德
(黑龙江八一农垦大学植物科学技术学院,大庆 163319)
摘 要:在温度为 25℃,处理时间为 6h、12h、24h、48h的条件下,用浓度为 0.05%、0.1%、0.2%、0.5%的秋水仙素对二倍体
的菘蓝萌发种子进行诱导,并对诱导后的植株幼苗在分蘖期进行细胞学和形态学的研究。结果表明:用 0.05%～0.5%浓度的秋
水仙素处理的萌发种子均可以获得四倍体植株,0.2%秋水仙素溶液处理6h的诱导加倍的成功率最高,加倍植株均为二倍体
和四倍体的混倍体;混倍体植株叶片气孔保卫细胞的长度和气孔的长度均高于未加倍的二倍体植株。
关键词:菘蓝;种子;秋水仙素;多倍体
中图分类号:S335.1
StudyonThePolyploidInductionofIsatisindigoticaFort.
LiuLiping,WangLiyan,YinKuide
(ColegeofPlantScienceandTechnology,HeilongjiangAugustFirstLandReclamationUniversity,Daqing163319)
Abstract:DoubledIsatisindigoticaFort.germinatingseedswereinducedbyColchicinewhichconcentrationwere0.05%、0.1%、0.2%
and0.5%under25℃,andthetreatmenttimewereat6hour、12hour、24hourand48hour,thecytologyandmorphologyofthein-
ducedseedlingattileringstagewerestudied.Theresultshowedthat:gemmiferousseedstreatedwith0.05%～0.5%aqueoussolutionof
colchicinescouldgetthepolyploidyplants,themostsuitableconcentrationandtreatmenttimewere0.2%and6hour,aldoubled
plantsweremixoploidsincludingdigploidsandtetraploids.Theleavesstomaofdefendingcelsandstomawerelongerthanthatof
diploids.
Keywords:IsatisindigoticaFort.;Seed;Colchicine;Polyploid
收稿日期:2008-3-31
作者简介:刘丽萍(1980-),女,黑龙江八一农垦大学2005级硕士研究生。
通讯作者:殷奎德,男,教授,硕士研究生导师,E-mail:yinkuide@163.com。
文献标识码:A
20(3):23~26
June2008
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报
JournalofHeilongjiangAugustFirstLandReclamationUniversity
第20卷 第3期
2008年 6月
文章编号:1002-2090(2008)03-0023-05
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第20卷
1.2试验方法
1.2.1萌动种子的处理
首先将种子用0.1%的升汞消毒10min,清水洗
净后放在铺有双层滤纸的培养皿中,置25℃黑暗的
培养箱内培养 3~4d,种子萌发,即胚根刚刚露出白
尖时取出,用浓度为0.05、0.1、0.2、0.5%的秋水仙素
溶液分别处理6~48h。清水浸渍种子为对照,每个处
理重复 3次,每次处理 40粒。本试验各个处理均在
黑暗条件下进行。
1.2.2幼苗的培育
将处理后的种子用清水冲洗数次,把药液完全
冲洗掉,种植在蛭石中定期浇水。观察记录出苗情
况,观察是否有变异株。当苗高 2cm左右时,放在培
养钵内进行沙基培养,适量浇水,以保证幼苗的生
长。
1.3多倍体鉴定
1.3.1形态学鉴定
先观察幼苗的形态,从形态上看处理组和对照
组植株有什么变化。
1.3.2幼苗气孔及保卫细胞长度鉴定
当土培幼苗进入分孽期后,将心叶下第二叶叶
片放在洁净的载玻片上,叶片的下表皮向上,用刀片
将叶片的下表皮和叶肉细胞轻轻刮去,仅留下一层
薄而透明的上表皮,用 I-KI溶液染色 3min,再盖上
盖玻片,用装有目镜测微尺的 Olympus显微镜观察、
测量,并计算气孔、保卫细胞长度。
1.3.3染色体鉴定
将形态上有明显变化的植株,进行染色体鉴定。
具体方法是:当土培幼苗开始分蘖时,取出整个植
株,将根系洗净,从根系中取出新鲜、光滑、白色透明
的长度约 1.5cm的根尖1~2根,放入8-羟基喹啉
溶液中处理3h,然后用卡诺固定液固定22～24h,在
处理温度为60℃时用1NHCl解离10min,然后用
卡宝品红溶液染色10min、压片,观察统计不同根尖
细胞的染色体数目,将分散相好的片子用 Olympus
显微镜照相[4-8]。
2 结果与分析
2.1秋水仙素在不同处理浓度和时间因素对诱导菘
蓝多倍体的影响
对秋水仙素在不同处理浓度和时间下诱导菘蓝
多倍体的结果进行观察统计,结果见表1。
表1 秋水仙素不同处理浓度和不同处理时间对菘蓝种子的诱导效果
Table1 EfectofdiferentconcentrationsandtimeofcolchicinesoninductionofIsatisindigoticaFort.seed
秋水仙素
浓度/%
处理
时间/h
6
12
24
48
6
12
24
48
6
12
24
48
6
12
24
48
处理种子
数/粒
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
25
24
13
8
21
20
8
6
19
17
5
3
17
14
1
0
62.5
60
32.5
20
52.5
50
20
15
47.5
42.5
12.5
7.5
42.5
35
2.5
0
形态变异
种子数/株
11
12
8
6
14
14
6
5
14
14
4
3
13
12
1
-
44
50
61.54
75
66.67
70
75
83.33
73.37
82.35
80
100
76.47
85.71
100
-
诱导多倍
体数/株
0
0
1
4
8
11
5
4
15
13
4
3
11
10
0
-
诱导多倍
体频率/%
0
0
2.5
10
20
27.5
12.5
10
37.5
32.5
10
7.5
27.5
25
0
-
注:平均变异率(%)=(该处理时间下的形态变异种子总和)/(该处理时间下的出苗种子总和)×100%
平均成苗率(%)=(该处理时间下的成苗株数总和)/(该处理时间下的种植种子总和)×100%
0.05
0.1
0.2
0.5
出苗数/株 出苗率/% 变异率/%
24
第3期
从表 2可以看出经秋水仙素溶液处理的菘蓝种子
萌发后所形成的植株具有明显的多倍体形态特征
(见图1、2)。
2.3气孔保卫细胞鉴定
分别撕取对照组与处理组的叶表皮细胞进行
临时装片的制作,每个叶片随机测 20个气孔大小,
取平均值进行比较。在 40倍的显微镜下观察(见图
3、图 4)可见诱导组的叶片表皮保卫细胞比对照组
的大,用显微测微尺测量保卫细胞的长度可知,处
理组比对照组大 1.4倍,并且处理组保卫细胞中叶
绿体的数量也明显多于对照组。诱变成功的多倍
体,气孔保卫细胞长度增大(见图 5、图 6)。我们的试
验结果表明:处理后得到的多倍体植株叶片气孔保
卫细胞长度和横径明显增大,对照组保卫细胞长度
为 15.75μm、横径为5.5μm,处理后得到的多倍体植
株叶片保卫细胞长度为22.25μm、横径为7.75μm;而
气孔也明显增大,对照组气孔长度为 7.25μm、宽度
为 4.28μm,处理后得到的多倍体植株叶片气孔长
度为11.5μm、宽度为7.8μm。
图2 右侧为秋水仙素浓度0.2%处理6h左侧为清水对照
Fig.2 Therightisdoubledusing0.2%Colchicinesand
6hourtreatment,theleftisdoubledinwater
从表1看出,秋水仙素处理后种子的出苗率明
显降低,秋水仙素浓度越高,处理时间越长,种子出
苗率越低,变异率越高。当秋水仙素浓度为 0.05%,
处理时间为6h,出苗率最高,达62.5%,但变异率较
低仅为 44%,秋水仙素浓度在 0.1%~0.2%范围内
时,出苗率虽然没有秋水仙素浓度为0.05%浸泡相
同时间的出苗率高,但变异率和四倍体诱导率的幅
度都大大提高,尤其是浓度为0.2%处理6h,多倍体
诱导率最高,达37.5%,而且处理12h的多倍体诱导
率也较高,达32.5%。这说明在6～12h的处理时间下
诱导的成功率较高,同时对幼苗的损伤率较小。当秋
水仙素处理24h时,出苗率急剧下降,秋水仙素的毒
害作用显著,多数植株表现出不同程度的变异,其中
浓度为0.2%浸泡48h、浓度为0.5%浸泡24h的变
异率最高,为100%,而秋水仙素浓度0.5%处理48h
时出苗率为0,说明这个浓度和处理时间对菘蓝种子
的毒害最大。
2.2秋水仙素处理后幼苗与未处理的二倍体植株相
比形态上的变化
对菘蓝幼苗的胚根、子叶、下胚轴和叶片营养器
官的形态特征和生长发育情况进行了观察比较,结
果见表2。
观察材料
对照组
处理组
胚根
形态正常,生长速
度较快,较细长。
明显膨大,生长速
度较慢,根部为圆
锥形。
子叶
生长正常,叶面平
整,颜色为绿色。
子叶肥大、增厚,
颜色为深绿色,叶
片稍向下卷曲。
下胚轴
生长正常,
细长。
粗壮,生长
缓慢,胚芽鞘
膨大,呈棒状。
气孔
保卫细胞较小,气
孔形状为长而窄。
保卫细胞大,气孔
大,气孔形状为近
圆形。
小苗发育
各器官均发育正常。
小苗粗壮、矮化,部
分子叶和子叶宽大、
肥厚,叶色深绿。
表2 用秋水仙素诱导种子后的生长情况
Table2 Growthconditionofseedinducedbycolchicines
图1 左侧为秋水仙素浓度0.1%处理6h,右侧为清水对照
Fig.1 Theleftisdoubledusing0.1%Colchicinesand
6hourtreatment,therightisdoubledinwater
图3 二倍体气孔(10×40)
Fig.3 StomaofDiploid(10×40)
刘丽萍等:菘蓝的多倍体诱导研究 25
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第20卷
2.4染色体的鉴定
为了更准确地鉴定多倍体植物,分别取处理组
与对照组的根尖进行染色体制片,观察显示,对照组
染色体数目 2n=14(图 7),处理组染色体数目 2n=28
(图8),从而进一步证明诱导后的植物为多倍体。通
过镜检发现处理后的植株在同一植株的根尖细胞中
有二倍体与四倍体共存的现象,均为混倍体植株。因
为由于处理浓度和时间的不同,二倍体和四倍体所
占的比例也不一样,所以对于能否成功诱导出纯的
四倍体菘蓝,浓度和时间的把握是非常重要的。
本试验通过利用秋水仙素处理萌动的菘蓝种
子,诱导出嵌合体的多倍体菘蓝,为下一步四倍体菘
蓝的纯化打下基础。
3 讨论
用秋水仙素处理种子诱导多倍体植株,方法简
单,容易成功,且用药量少。本试验通过利用秋水仙
素处理菘蓝种子发现处理后种子出苗率明显降低,
秋水仙素浓度越高,处理时间越长,种子出苗率越
低,变异率越高。处理后幼苗的变异表现为,胚芽鞘
膨大,呈棒状,幼根尖端肿大呈鼓锤状或圆球状,生
长势缓慢,子叶宽大、肥厚,叶色深绿、有的扭曲或皱
缩。最合适的秋水仙素浓度为0.2%处理6h,四倍体
的诱导率为37.5%,获得的加倍植株均为二倍体和
四倍体的混合体,在嵌合体植株生长过程中,一般二
倍体细胞具有竞争优势,使四倍体细胞被逐步淘汰,
在检测过程中,我们曾发现许多各占一定比例的四
倍体细胞和二倍体细胞的混倍体植株,经过一段时
间后再检测时,其中绝大多数变成了二倍体植株,这
可能是造成加倍不易成功的主要原因。
植物经秋水仙素处理后,多倍体需要进行鉴定。
常用的方法主要有直接法和间接法:直接法就是镜
检染色体的倍数法,该方法是鉴定诱变材料的最可
靠方法,但仍有一定的局限性,比如一些植株生长势
弱,再生能力差,细胞学鉴定取根尖时极易伤害植
株,导致其死亡,因此对处理群体进行形态变异分析
就显得尤为重要。间接法主要是通过形态特征(如叶
片变大变厚,叶色深绿,花器增大,结实率降低等)、
测验杂交(根据多倍体与普通二倍体互相授粉不结实
的特性进行鉴定)及叶片气孔长度或气孔保卫细胞长
度来鉴定加倍植株,该法直观简便,且不影响加倍植
株的成活率。试验结果表明:形态变异群体中大部分
植株的根尖中均发现有加倍细胞,(下转第 42页)
图4 四倍体气孔(10×40)
Fig.4 StomaofTetraploid(10×40)
图5 二倍体气孔(10×100)
Fig.5 StomaofDiploid(10×100)
图6 四倍体气孔(10×100)
Fig.6 StomaofTetraploid(10×100)
图7 二倍体染色体数目(2n=14)(10×100)
Fig.7 ChromosomenumberofDiploid(2n=14)(10×100)
图8 四倍体染色体数目(2n=28)(10×100)
Fig.8 ChromosomenumberofTetraploid(2n=28)(10×100)
26
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第20卷
(上接第26页)
说明形态学鉴定是对菘蓝多倍体进行初步筛选的较
好方法。我们的试验结果表明,秋水仙素加倍后的混
倍体植株叶片气孔保卫细胞的长度明显大于未加倍
的二倍体植株。由此认为,利用菘蓝叶片气孔保卫细
胞的长度可以鉴别染色体加倍植株。
参考文献:
[1]陆平成,许益民,王永珍,等.板蓝根多糖对小鼠的免疫调
节作用[J].中药药理与临床,1991,7(2):22.
[2]许益民,陆平成,王永珍,等.板蓝根多糖促进免疫功能的
试验研究[J].中西医结合杂志,1991,11(6):357.
[3]冯群先,毕一俐,仇建明,等.板蓝根多糖降脂作用的初步
观察[J].中国医药学报,1993,8(增刊):75.
[4]浙江农业大学.遗传学[M].北京:农业出版社,1986.
[5]李懋学,张赞平.作物染色体及研究技术[M].北京:中国农
业出版社,1964.
[6]李国珍.染色体及研究方法[M].北京:科学出版社,1985.
[7]朱徵.植物染色体及染色体技术[M].北京:科学出版社,
1982.
[8]DM穆尔.普通细胞学[M].刘祖洞译.北京:科学出版社,
1964.
喂入量/kg·s-1
0.5
1.5
2.5
密度曲线回归方程
ρ=14.7403/(1+0.012309e4.9223z-1.3370z+0.071645z)
ρ=47.6327/(1+0.000109e14.3549z-7.8609z+1.5176z)
ρ=80.3234/(1+0.035663e3.0155z-0.306709z-0.113599z)
模型
Peal-Reed
Peal-Reed
Peal-Reed
相关系数
r=0.9922
r=0.9916
r=0.9930
显著水平
P=0.0001
P=0.0001
P=0.0001
3
经过对6组试验数据进行拟合,发现密度沿轴
向分布曲线均与Peal-Reed模型拟合程度最高,模型
形式为:ρ=a/(1+becz+dz+ez)。
不同喂入量下,脱分空间内谷物密度曲线用
DPS数据处理系统拟合后,回归方程属于 Peal-Reed
模型时,相关系数很高,r均在0.99以上,如表2所
示。2 3
表2 密度曲线回归方程
Tab.2 Regressionequationofdensity
2
32
32
3 结论
对螺旋叶片、板齿组合式轴流脱粒分离装置脱
分空间内谷物流密度沿轴向分布规律进行了试验研
究,得出脱分空间谷物密度的轴向分布规律符合为
Peal-Reed模型,ρ=α/(1+becz+dz+ez),各试验喂入量下
回归关系均达0.001以上显著水平。
参考文献:
[1]衣淑娟,李敏,孟臣.谷物脱粒与分离装置试验数据采集系
统[J].农业机械学报,2005,36(1):100-104.
[2]衣淑娟.钉齿式轴流脱粒与分离装置脱出物沿轴向分布规
律的试验研究[J].机械设计与制造,2002,(6):100.
[3]李渤海,衣淑娟,姜楠.轴流式脱粒分离装置脱出物沿滚筒
切向分布规律[J].现代化农业,2005,(10):31-32.
32
42