全 文 ：山莓的多倍体诱导
汤访评1，宋春涛2，陈晓艳2 (1．绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴 312000;2．绍兴市林木种苗管理站，浙江绍兴 312000)
摘要 ［目的］研究用秋水仙素诱导山莓多倍体的方法。［方法］诱导出的以山莓组培苗腋芽为试验材料，研究在不同秋水仙素浓度下
山莓多倍体的诱导效果，并对诱导出的多倍体进行细胞学鉴定。［结果］秋水仙素对山莓有严重的毒害作用，且其随浓度的增加山莓死
亡率逐渐升高;多倍体诱导率随秋水仙素浓度的增加呈先升高后降低的趋势。［结论］秋水仙素浓度为 0． 40‰时，山莓诱导多倍体效果
最好。
关键词 山莓;组织培养;秋水仙素;多倍体
中图分类号 S663． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2012) 29 －14181 －02
Polyploidy Induction of Rubus corchorifolius
TANG Fang-ping et al ( College of Life Sciences，Shaoxing University，Shaoxing，Zhejiang 312000)
Abstract ［Objective］To study the polyploidy induction method of Rubus corchorifolius by colchicines． ［Method］With the raspberry seedlings
with axillary bud as the experimental material，the polyploidy was inducted with different colchicines concentrations and then cytologically identi-
fied． ［Result］Colchicine had serious adverse effects to Rubus corchorifolius，and the death rate of Rubus corchorifolius gradually improved with
increasing concentration of colchicines; polyploid induction rate increased at first and then decreased with the improving colchicine concentration．
［Conclusion］The highest induction frequently was achieved with colchicines at 0． 04‰．
Key words Rubus corchorifolius; Tissue culture; Colchicines; Polyploidy
作者简介 汤访评( 1972 － ) ，男，浙江诸暨人，副教授，博士，从事园林
植物遗传方面的研究，E-mail: 604686443@ qq． com。
收稿日期 2012-07-03
野生悬钩子属(Rubus corchorifolius)植物在我国分布广
泛，其果味酸甜适口，富含多种氨基酸和矿质元素，具有较高
的营养和药用价值［1 －2］。我国悬钩子属植物的利用仅限于
中药配方和民间闲食，未曾作为果树引种栽培。而欧美等国
引种栽培该属植物的历史较长，并已育成许多品种。其中黑
莓(blackberry)、树莓(raspberry)已成为第 3 代新兴果树的主
要种类［3］。随着人们生活水平的不断提高，如何丰富我国水
果市场的种类，发掘利用新的野生资源也是果品研究的主要
课题。山莓茎杆直立，果实具有颜色鲜艳、汁多味美、有特殊
香味等特点，被认为是悬钩子属植物中最有利用价值的野生
种类之一，值得深入研究利用［4］。
多倍体在植物的物种形成和进化上具有极其重要的作
用［5 －6］。相比于单倍体，多倍体植物往往具有生长旺盛、器
官变大、抗性强等一些特点。为使山莓成为一种大众水果，
故需在山莓的组织培养基础上，以山莓离体芽为外植体，用
人工诱变手段来获得具有抗病虫害能力强、耐旱、个大、利于
保存等优点的多倍体山莓，其前景非常可观。
利用秋水仙素进行化学诱变获得多倍体是园艺植物育
种中的重要方法之一，而将化学诱变技术与组织培养技术结
合进行诱变育种，具有其独特的优势［7 －8］。因此，将化学诱
变与组织培养技术相结合，研究山莓多倍体资源创建和育种
技术，对推动山莓育种和选育突破性的新品种具有十分重要
的意义，对其他悬钩子属多倍体的育种也有重要参考价值。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试材料为实验室保存的由侧芽诱导形成，经
多代扩繁获得的生长旺盛的山莓小植株。
1． 2 方法
1． 2． 1 秋水仙素处理液的配制。按处理所需体积配制 MS
+6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 1 mg /L +蔗糖 30 g /L 液体培养
基，经高压灭菌后，冷却至室温，加入适量的经过滤灭菌的秋
水仙素溶液，使秋水仙素处理液终浓度分别为 0． 01‰、
0． 02‰、0． 04‰、0． 08‰和 0． 10‰，充分摇匀后分装到经高压
灭菌的培养瓶内，每瓶 25 ml。
1． 2． 2 秋水仙素处理。将山莓组培苗切成0． 5 cm左右的茎
段分别插入不同浓度秋水仙素的固体培养基中，插入深度保
证培养基没过腋芽。每处理设 3个重复，每重复 10 瓶，每瓶
接入 5根左右小植株。所有处理均培养 2星期，以诱导腋芽
生长。培养条件为每天 16 h 光照、温度(26 ± 2)℃、光强 36
mmol /(m2·s)。
1． 2． 3 生根培养。将秋水仙素处理后诱导的小植株，接种
到 1 /2MS + NAA 0． 2 mg /L +蔗糖 20 g /L的固体培养基中进
行生根培养，培养条件同“1． 2． 2”。待植株长成 3 cm 左右
后，切取其茎尖对其进行染色体鉴定，确认其倍性。
1． 2． 4 细胞学观察。茎尖染色体的鉴定参考张志胜等［9］的
压片法，稍作改进。具体步骤为:待植株长至约 3 cm 后，切
取其茎尖，于冰水中预处理 20 ～24 h，在卡诺氏固定液(无水
乙醇∶冰醋酸 =3∶ 1)中 4 ℃下固定 24 h，之后移入 70%乙醇
中，4 ℃保存备用。染色体制备采用临时压片法，用 45%醋
酸压片(未染色) ，临时片在相差显微镜(BX41;Olympus Co．
Ltd．)下观察并拍照，可用于染色体计数。
1． 2． 5 统计分析。按公式统计死亡率、多倍体诱导率。死
亡率 =(每一处理死亡茎段数 /每一处理死亡茎段总数)×
100%，多倍体诱导率 =(每一处理多倍体茎尖数 /每一处理
茎尖总数)×100%。所得数据统一使用 SPSS13． 0 软件进行
单因素方差分析。
2 结果与分析
2． 1 秋水仙素处理对山莓茎段生长的影响 试验表明，处
理的茎段培养 2 d后部分茎段底部逐渐开始褐化。1星期后
处理的茎段在培养过程中出现持续褐化死亡现象。2 星期
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(29):14181 － 14182，14241 责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.29.290
后，秋水仙素浓度 0． 01‰处理的山莓茎段死亡率为 13． 33%，
且随秋水仙素浓度的增加死亡率也增加;当秋水仙素浓度为
0． 10‰时，山莓茎段死亡率上升至 84． 00%(表 1)。结果说
明，秋水仙素对山莓茎段的培养有严重毒害作用，并且随其
浓度的增加死亡率逐渐加重。
2． 2 山莓多倍体的鉴定 采用改良压片法对经秋水仙素处
理的山莓茎尖进行染色体计数，结果表明，大部分山莓茎尖
的染色体数均为 2n =2x =28，是二倍体(图 1A) ;而多倍体茎
尖染色体数为 2n =4x =80，是四倍体(图 1B)。
表 1 秋水仙素处理对山莓茎段生长的影响
处理浓度∥‰ 死亡率∥% 多倍体诱导率∥%
0． 01 13． 33 e 5． 33 e
0． 02 23． 33 d 16． 00 c
0． 04 36． 67 c 20． 00 a
0． 08 60． 00 b 17． 33 b
0． 10 84． 00 a 12． 00 d
注:同列肩标不同小写字母表示在 0． 05水平上差异显著。
注:A． 2n =28;B． 4n =56。
图 1 山莓茎尖染色体数
秋水仙素能诱导山莓茎段腋芽染色体加倍，但不同处理
浓度诱导多倍体的效果不同(表 1)。在处理 2 个星期后，秋
水仙素浓度为 0． 01‰的处理，多倍体诱导率为 5． 33%，并随
秋水仙素浓度的增加呈先升高后降低的趋势。秋水仙素浓
度为 0． 04‰的处理多倍体诱导率最高，为 20． 00%。
3 讨论
相比单倍体，多倍体作物器官变大、生长更旺盛、植株更
粗壮，且伴随多倍体的巨大性，其营养成分的含量也显著提
高。将多倍体用于浆果类，可延长其贮存期。山莓由于其个
小、不易保存等缺点而未成为一种经济作物。多倍体的这些
优势可有效解决这个难题。此外，多倍体还具有产量高、适
应性强、抗逆性如抗寒、抗旱、抗病能力强等优点。
该研究通过秋水仙素处理，首次获得了山莓的四倍体植
株，为进一步开展山莓的多倍体育种提供了材料。同时，试
验初步建立的山莓多倍体诱导和鉴定技术体系，为进一步开
展悬钩子属多倍体育种提供了参考。
秋水仙素和组织培养相结合是诱导多倍体的有效方
法［7 －8］。试验证明，利用秋水仙素进行染色体加倍，形成山
莓多倍体是可行的。对于山莓多倍体诱导的研究尚未见报
道，但与其同一科中的草莓多倍体诱导已成功多年。张计育
等［10］用 0． 3%的秋水仙素溶液处理 4 d或用 0． 5%的秋水仙
素溶液处理 2 d，草莓再生植株的多倍体诱导率均为 100%，
并诱导出 16x的植株;用 0． 1%的秋水仙素溶液处理草莓离
体叶片，多倍体诱导率为 77． 8% ～ 90． 0%，且未诱导出 16x
的植株，而以 12x植株的诱导率最高。
不同材料对秋水仙素的耐受性和多倍体的诱导率也不
同。前人研究表明，秋水仙素对植物体生长具毒害与抑制作
用，最终可能导致植物死亡［11］。因此，深入研究影响秋水仙
素处理后植物体存活的因素，对进一步提高多倍体诱导效率
有重要作用。该试验初步表明，茎段培养 2 d后，部分茎段底
部就开始褐化，1个星期后茎段在培养过程中出现持续的褐
化死亡现象。另外，寻找毒性低而能有效诱导染色体加倍的
秋水仙素替代品也是植物多倍体资源创建研究的重要内容。
近年来研究发现，胺磺灵(oryzalin)比秋水仙素毒性更低，且
具有更高的诱变效率［12］。但胺磺灵是否适于山莓茎段的染
色体加倍还有待进一步研究。
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28141 安徽农业科学 2012 年
取，得到灵香草萃取物;采用 GC-MS技术对 SFE-CO2 法得到
的灵香草萃取物化学组成进行了分析鉴定，共鉴定出 37 个
化学成分，总含量为 91． 91%。其中，主要成分为:苯乙酮、
(Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸甲酯、(Z，Z)-9，12-十八碳二
烯酸、9-十六碳烯酸、十七酸、十七酸乙酯和(Z，Z，Z)-9，12，
15-十八碳三烯酸乙酯等化合物［11］。李向日将零陵香用浓度
70%乙醇提取，并采用多种色谱方法进行分离纯化，得到了 1
个黄酮类成分，该化合物为新化合物［12］。此外，还用 1维、2
维核磁共振技术对灵香草进行了化学成分的分析，得到了 3
种新的齐墩果酸型三萜皂苷［13-14］。杨瑞云等对灵香草提取
物的抑菌活性进行了研究，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、
无水甲醇和水为溶剂，制取灵香草浸膏，得到灵香草中含有
萜类、黄酮类、醌类、内酯类、酚类和鞣质、氨基酸、多肽和蛋
白质成分［15］。
3 化学成分的提取方法研究
目前采用的提取灵香草化学成分的方法主要有色谱-质
谱联用方法、毛细管柱气相色谱及色谱-质谱联用技术、GC-
MS技术、超临界 CO2 萃取技术(SFE-CO2)和 1 维、2维核磁
共振技术。灵香草萃取物通常采用有机溶剂萃取，灵香草的
精油采用水蒸气蒸馏的方法，2种方法各有利弊［16］。采用水
蒸气蒸馏的方法提取的灵香草精油香气纯正、纯度高、色泽
浅，适于高档产品的加香，但由于产品收率太低，约 0． 24%，
致使成本过高;有机溶剂萃取物尽管收率较高，但由于产品
颜色深、杂质多、香气不够纯正，残留有机溶剂，所以限制了
其生产和使用。朱凯等用超临界 CO2 萃取技术(SFE-CO2) ，
对灵香草进行了萃取，得到灵香草萃取物。采用超临界 CO2
法得到的灵香草萃取物收率为 4． 5%，高于水蒸气法的收率，
且香气纯正，但比单独采用有机剂卒取或水蒸气蒸馏都好。
试验鉴定出 20个化学成分，经评定，超临界 CO2 萃取法得到
的提取物气味更接近灵香草天然香气［17］。所以该方法值得
推广和应用。
4 灵香草的应用
4． 1 观赏价值 驱蚊香草零陵香是非常走俏的盆栽驱蚊花
卉。其株型丰满美观，盆栽置放庭院、客厅、居室和阳台，不
仅绿意盎然，美化了居住环境，而且芳香飘溢，让人心旷神
怡。其不仅具有杀菌、醒目提神和杀菌防疫的功效，而且有
很强的驱蚊效果，天然绿色环保。被蚊子叮咬后，取叶片擦
几下既可止痛止痒，还留有余香。用其干枯的花叶或种壳填
充香囊、挂饰、睡枕和靠垫等用品，持续散发的香味可长达 1
年之久，深受人们喜爱。
4． 2 经济价值 灵香草是一种重要的工业原料，可用于纺
织、建材、皮革、烟卷行业及卫生制品。其精油为“液体黄
金”，在国际市场上价值极高，需求量很大。
而且，灵香草还具有杀虫作用。防治方法较多，特色各
异，获取的效果也不尽相同。安徽中医院图书馆古籍书库于
2005年开始使用中药灵香草避防古籍藏书的蠹虫，通过 3年
多的使用和观察，认为灵香草有着很好的防虫效果。袁萍采
用不同的有机溶剂对跳蚤进行味杀，获得了良好的效果［18］。
灵香草提取物具有抑菌活性，对 10 种植物病原菌具有抑制
作用［19］。
5 小结与展望
综上所述，灵香草具有很好的观赏价值和经济价值。由
于植株所含香味成分极性大且比较复杂，近年的研究不断得
到新的化合物，而且采用各种不同的方法进行提取成分也不
一样，所以应对灵香草的化学成分作进一步研究，为其的进
一步开发与利用提供依据。
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