全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (9): 1443–1448　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0249 1443
收稿 2016-06-20　　修定 2016-08-05
资助 国家重点研发计划项目(2016YFC0503104) 、 广西自然科
学基金(2012GXNSFBA053079)和南宁市青秀区科学研究
与技术开发计划课题(2013S13)。
* 通讯作者(E-mail: huangyunfeng2000@126.com)。
海伦兜兰的无菌播种与快速繁殖
胡琦敏1,2, 李勇毅3, 黄云峰1,2,*, 胡仁传1, 吴坤林4
1广西壮族自治区中医药研究院, 南宁530022; 2广西中药质量标准研究重点实验室, 南宁530022; 3自然科学博物馆, 台湾台
中404; 4中国科学院华南植物园华南农业植物分子分析与遗传改良重点实验室, 广州510650
摘要: 本文研究了海伦兜兰(Paphiopedilum helenae)的无菌播种与快速繁殖, 结果表明: 提高海伦兜兰种子萌发率较好的预
处理方法是用0.1 mol·L-1 KOH处理10min; 最适合海伦兜兰种子萌发的培养基为1/4MS+0.1% (m/V)活性炭+60 g·L-1香蕉
(Musa nana), 种子萌发率达69.4%; 最适合丛生芽诱导的培养基为1/2MS+0.5 mg·L-1 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+2.0 mg·L-1萘乙酸
(NAA)+0.1%活性炭+60 g·L-1香蕉; 最适合生根壮苗的培养基为MS+60 g·L-1马铃薯(Solanum tuberosum)或MS+30 g·L-1香蕉。
关键词: 海伦兜 兰; 种子; 无菌播种
海伦兜兰(Pap hiopedilum helenae)为兰科(Or-
chidaceae)兜兰属植物, 株型矮小, 花金黄色, 极具
观赏价值, 是杂交的好亲本, 也是园艺栽培中不可
多得的种质资源。海伦兜兰分布于越南北部高平
省及中国的中越边境一带, 最先由Averyanov (1996)
发表, 发表当年即遭大规模商业采集, Averyanov等
(1996)估计在该新种发表后的几星期内就有15 000~
20 000苗野生植株被采集并通过非法渠道输送到
国际市场出售, 野生种群遭受破坏非常严重(黄云
峰和薛跃规2007)。海伦兜兰结实率极低, 其种子
在自然环境下极难萌发, 主要通过分蘖繁殖, 因此,
其种质资源较少。利用无菌播种可以快速繁殖出
大量兜兰种苗, 以满足市场需求, 从而缓解野生资
源面临的压力。有关兜兰的无菌播种已有一些报
道(Zeng等2016), 周艳等(2013)和丁长春等(2011)
利用硬叶兜兰(P. micranthum)种子进行无菌播种获
得大量试管苗。王莲辉等(2008)和刘其府等(2012)
对同色兜兰(P. concolor)种子进行了非共生萌发实
验。田凡等(2014)以白花兜兰(P. emersonii)种子为
外植体, 研究了种子胚萌发、继代增殖和生根技
术, 组培苗移栽成活率可达96%。曾宋君等(2006)
对带叶兜兰(P. hirsutissimum)进行了无菌播种并获
得大量组培苗, 移栽后的组培苗成活率达75%以
上。Zeng等(2012)对彩云兜兰(P. wardii)的无菌播
种、组织培养和自然回归进行了系统的研究。我
国目前对海伦兜兰的无菌播种和组织培养快速繁
殖的研究较少 , 仅有一例无菌播种的报道(Lee
2007)。本研究以海伦兜兰种子为外植体进行无菌
播种, 进而对丛生芽的诱导和生根进行研究, 为其
应用繁殖和保护提供技术支持。
材料与方法
1 实验材料
所用实验材料海伦兜兰(Paphiopedilum hele-
nae Aver.)蒴果采自广西那坡县。
2 实验方法
2.1 外植体消毒
将成熟未开裂的海伦兜兰蒴果采回后, 用自
来水冲洗表面尘土20 min, 再用洗洁精清洗蒴果表
面后, 置于超净工作台上, 用75% (V/V)酒精浸泡30
s, 0.1%的升汞(HgCl2)加两滴吐温20浸泡20 min, 无
菌水冲洗4~5次, 备用。
2.2 培养基制备
根据实验目的不同使用不同的培养基: 添加
不同浓度的6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine,
6-BA)和萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid, NAA), 附
加不同浓度的香蕉(Musa nana)、马铃薯(Solanum
tuberosum)、30 g·L-1食用蔗糖和7 g·L-1琼脂, 灭菌
前调pH至6.5, 配制分装后, 于121°C灭菌20 min。
2.3 种子预处理
在超净工作台上, 将消毒过的蒴果置于培养
皿中, 切开果荚取出种子。将种子分成两组, 一组
用0.1 mol·L-1 NaOH浸泡, 另一组用0.1 mol·L-1
KOH浸泡, 每组再分为8小组, 分别浸泡5、10、
15、20、25、30、45和60 min, 无菌水清洗3次, 接
种于1/2MS培养基中[添加0.1% (m/V)活性炭和60
植物生理学报1444
g·L-1香蕉], 每个处理小组接种5瓶。观察种子的萌
发情况, 萌发以胚突破种皮形成白色原球茎为准,
萌发率的统计方法为: 在显微镜下取不同视野统
计100粒种子中的萌发粒。
2.4 种子萌发
将用0.1 mol·L-1 KOH浸泡10 min的处理组接
种于MS、1/2MS和1/4MS培养基中(添加0.1%活性
炭和60 g·L-1香蕉), 每个处理小组接种5瓶, 统计萌
发率。
2.5 丛生芽的诱导
将萌发的原球茎转接到丛生芽的诱导培养基
中, 以1/2MS为基本培养基, 添加60 g·L-1的香蕉和
0.1%活性炭, 比较不同浓度的6-BA (0.5、1.0和2.0
mg·L-1)和NAA(0.2、0.5、1.0和2.0 mg·L-1)对海伦
兜兰原球茎诱导丛生芽的影响, 每个处理组接种
30个原球茎, 重复2次, 在超净工作台中统计诱导
的芽苗数。
2.6 生根壮苗
当小苗长出2~3片叶子、叶长1~1.5cm时便可
转接到生根壮苗培养基中, 以MS为基本培养基, 比
较不添加添加物(空白组)和添加不同浓度的马铃
薯(30和60 g·L-1)和香蕉(30和60 g·L-1)对海伦兜兰
生根壮苗的影响, 每个处理组接种10株小苗, 统计
生根壮苗后小苗的叶片数量、叶片长度、根数及
根长。
2.7 培养条件
MS培养基添加3% (m/V)蔗糖和7 g·L-1琼脂;
1/2MS培养基添加2%蔗糖和7 g·L-1琼脂, 培养室温
度(25±2)°C, 光照强度25 μmol·m-2·s-1, 无菌播种后
先暗培养7 d, 然后转到光照培养, 种子萌发和芽分
化培养每天光照12 h, 生根壮苗培养每天光照14 h。
2.8 数据处理分析
实验数据采用SPSS 13.0和Excel 2007软件进
行统计分析。
实验结果
1 不同预处理对海伦兜兰种子萌发的影响
将种子撒播在培养基表面, 隔5 d观察一次, 播
种后60 d统计萌发率。从表1可以看出, NaOH处理
组中, 海伦兜兰种子萌发率随着处理时间的增加
先增 高再降低, 当种子处理45 min时, 种子萌发率
与其他处理组的萌发率差异显著, 最高达37%; 在
KOH处理组中, 海伦兜兰种子萌发率也是随着处
理时间的增加先增高再降低, 当处理10 min时种子
萌发率与其他处理组的萌发率差异显著, 达44.0%,
KOH处理25 min以上时, 种子萌发率为0。由此可
见, 海伦兜兰种子较好的预处理方法是用0.1 mol·L-1
KOH处理10 min。
2 不同培养基对海伦兜兰种子萌发的影响
将经过预处理的种子散播在添加0.1%活性炭
和60 g·L-1香蕉的MS、1/2MS和1/4MS培养基中,
40 d后种子萌发成原球茎(图1-A), 60 d后统计种子
萌发率及原球茎生长情况。由表2可见, 各培养基
中的种子萌发率差异显著, 其中1/4MS培养基中的
种子萌发率最高、原球茎较大且原球茎颜色由白
色转为绿色, 因此, 最适合海伦兜兰种子萌发的培
养基为1/4MS+0.1%活性炭+60 g·L-1香蕉。
3 不同植物生长调节剂水平对海伦兜兰丛生芽诱
导的影响
将原球茎接种于丛生芽诱导培养基中, 原球
茎分化成丛生芽(图1-B), 60 d后统计诱导的芽数。
由表3可知, 在不同植物生长调节剂水平配比的情
况下, 海伦兜兰诱导的丛生芽数量差异显著。当
NAA浓度相同时, 低浓度的6-BA有利于芽的诱导;
NAA浓度越大, 诱导的丛生芽数越多, 说明较高浓
度的NAA有利于丛生芽的诱导。10和11号培养基
诱导的芽数差异不显著, 但考虑到成本问题, 我们
选择10号培养基作为丛生芽诱导的最适合培养
基。因此, 海伦兜兰丛生芽诱导的最适合培养基
表1 不同预处理条件对海伦兜兰种子萌发率的影响
Table 1 Effect of various pretreatment conditions on the
germination percentage of P. helenae mature seeds
处理时间/min
用不同材料处理的种子萌发率/%
0.1 mol·L-1 NaOH 0.1 mol·L-1 KOH
5 0.8f 4.2c
10 2.6f 44.0a
15 6.2e 24.2b
20 11.8d 2.4c
25 21.2c 0d
30 25.4b 0d
45 37.0a 0d
60 25.6b 0d
　　同列数据后不同小写字母标识表示差异显著(P<0.05), 下同。
胡琦敏等: 海伦兜兰的无菌播种与快速繁殖 1445
图1 海伦兜兰的无菌播种与快速繁殖
Fig.1 Aseptic seeding and rapid propagation of P. helenae
A: 无菌播种2个月后种子萌发成原球茎; B: 原球茎诱导丛生芽; C: 叶片的生长及根的分化; D: 生根壮苗培养后可以出瓶的小苗。
表2 不同培养基对海伦兜兰种子萌发的影响
Table 2 Effects of basal media on seed germination and
protocorm formation of P. helenae
培养基 种子萌发率/% 原球茎生长情况
MS 22.8c 大、白色
1/2MS 46.8b 大、绿色
1/4MS 69.4a 大、绿色
为1/2MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 NAA+0.1%
活性炭+60 g·L-1香蕉。
4 不同添加物对海伦兜兰生根壮苗的影响
将芽接种于生根壮苗培养基上, 小苗分化出
根(图1-C), 接种50 d后统计叶片数量、叶片长度、
生根数量及根长(图1-D)。从表4可以看到, 海伦兜
兰在添加马铃薯和香蕉的培养基中在叶片数量和
生根条数上没有显著性差异, 而在叶片长度和根
长上有显著性差异。在添加60 g·L-1马铃薯和30
g·L-1香蕉的培养基中, 海伦兜兰生长较好, 叶片长
度和根长较长且差异不显著, 但与其他组差异显
著, 我们在海伦兜兰的生根壮苗阶段中可根据实
际情况添加马铃薯或者香蕉。因此, 海伦兜兰生
根壮苗的最适合培养基为MS+60 g·L-1马铃薯或
MS+30 g·L-1香蕉。
讨　　论
兰科种子非常细小, 无胚乳, 自身所含的营养
物质极少, 在自然环境中需要与真菌共生才能萌
发。兜兰在进行无菌播种时, 由于兰科成熟的种
子形成了一层不可渗透种皮, 阻碍了水分和营养
物质的吸收, 同时, 在种子中可能存在抑制种子萌
发的物质, 或缺少促进种子萌发的激素。因此, 在
进行无菌播种前, 对兜兰种子进行预处理有利于
种子的萌发。一般对种子进行预处理的溶液有
NaClO、NaOH、KOH等, 这些溶液能破环种皮,
增加种皮的通透性或者减少种皮中抑制物质的含
量(Lee 2007)。刘其府等(2012)利用含0.5%有效氯
的NaClO溶液处理同色兜兰成熟种子50 min, 萌发
率可达69%。丁长春等(2011)用10%的84消毒液处
理硬叶兜兰的种子11 min, 种子萌发率高达40%。
Lee (2007)采用1%次氯酸钠溶液处理巨瓣兜兰(P.
植物生理学报1446
表4 不同添加物对海伦兜兰生根壮苗的影响
Table 4 Effect of organic supplements on seedling growth in vitro of P. helenae
添加物 叶片数量/片 叶片长度/cm 根数量/条 根长/cm
空白对照 3.6a 2.7c 3.1a 3.2c
30 g·L-1马铃薯 4.2a 3.6b 3.3a 4.1b
60 g·L-1马铃薯 4.5a 4.2a 3.8a 5.2a
30 g·L-1香蕉 4.4a 4.6a 4.2a 5.5a
60 g·L-1香蕉 4.1a 4.4a 3.8a 4.7ab
bellatulum)、P. godefroyae、P. niveum、海伦兜
兰、亨利兜兰(P. henryanum)和P. spicerianum种子
60~75 min, 种子萌发率均得到提高。本实验利用
NaOH和KOH溶液对海伦兜兰种子进行预处理, 其
中KOH溶液对海伦兜兰种子处理的时间相对较短,
处理10 min后种子萌发率可达44%, 因此, 我们选
用KOH溶液处理10 min作为海伦兜兰种子预处理
的最佳方法; 但由于KOH腐蚀性较强, 处理25 min
种子萌发率为0, 因此, 我们在用KOH处理种子时
必须严格控制好时间。
在兜兰的组织培养中, 培养基的盐分组成和
盐浓度是影响种子发育及原球茎生长的重要因
素。本研究发现较低盐浓度的培养基(1/4MS)较适
合海伦兜兰种子的萌发, 种子萌发率可达69.4%,
原球茎大且易转绿。丁长春等(2004)研究发现, 杏
黄兜兰(P. armeniacum)的种子适宜在较低盐浓度
下萌发, 在MS、RE、1/5MS和改良花宝1号培养基
的对比实验中, 以1/5MS中的种子萌发率最高, 可
表3 不同植物生长调节剂水平对海伦兜兰丛生芽诱导的影响
Table 3 Effect of different hormone combinations on induction of multiple shoots of P. helenae
培养基编号
不同植物生长调节剂浓度/mg·L-1 接种原球茎数量/个 分化的芽数量/个
6-BA NAA
1 0.5 0.2 30 31.0def
2 1.0 0.2 30 30.5def
3 2.0 0.2 30 27.0f
4 0.5 0.5 30 32.5de
5 1.0 0.5 30 29.0ef
6 2.0 0.5 30 30.5def
7 0.5 1.0 30 37.5bc
8 1.0 1.0 30 32.5de
9 2.0 1.0 30 32.5de
10 0.5 2.0 30 44.5a
11 1.0 2.0 30 41.5ab
12 2.0 2.0 30 34.5cd
达到42.5%。陈之林等(2004)也发现低盐浓度的培
养基较适宜杏黄兜兰和硬叶兜兰的种子萌发。刘
其府等(2012)将同色兜兰种子播种于MS、1/2MS、
1/4MS、1/8MS、KC、VW、RE、GD、H26和
H16培养基中, 结果发现其在1/4MS培养基上的萌
发率最高, 而在之后的原球茎培养中发现, VW和
1/8MS上的原球茎生长状况较差。由此可见, 虽然
低盐浓度的培养基较适合兜兰种子萌发, 但过低
的盐浓度会造成营养成分不够全面而影响原球茎
的生长。
在海伦兜兰原球茎诱导丛生芽培养阶段, 本
实验进行了不同浓度的6-BA和NAA配比实验, 结
果发现较低浓度的6-BA和较高浓度的NAA配合使
用有利于丛生芽的诱导, 这与杨燕萍等(2011)对亨
利兜兰的培养相似, 即在培养基中添加0.2 mg·L-1
6-BA和2.0 mg·L-1 NAA时丛生芽增殖倍数最高。
但周艳等(2013)对硬叶兜兰的培养发现, 在培养基
中添加1.0 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA, 原球茎
胡琦敏等: 海伦兜兰的无菌播种与快速繁殖 1447
分化增殖倍数最高, 芽生长健壮。曾宋君等(2006)
在带叶兜兰的原球茎增殖分化成苗阶段的培养基
中添加较高浓度的6-BA和较低浓度的NAA, 分化
生长的苗较粗壮。同是兜兰属的植物, 但对植物
植物生长调节剂的需求不同, 可能是由于不同植
物之间所含的内源激素不同所致。
椰乳、香蕉、马铃薯等添加物在兰科组织培
养中运用的比较常见, 根据不同的植物添加不同
浓度的添加物, 均对培养结果有较大的影响。在
本实验的生根壮苗阶段, 海伦兜兰小苗在添加香
蕉和马铃薯的培养基中比不添加香蕉和马铃薯的
培养基中生长更为健壮。
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Aseptic seeding and rapid propagation of Paphiopedilum helenae
HU Qi-Min1,2, LI Yong-Yi3, HUANG Yun-Feng1,2,*, HU Ren-Chuan1, WU Kun-Lin4
1Guangxi Institute of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science, Nanning 530022, China; 2Guangxi Key Laboratory of Tradi-
tional Chinese Medicine Quality Standards, Nanning 530022, China; 3Museum of Natural Science, Taizhong, Taiwan 404, China;
4Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden,
Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China
Abstract: In this study, we investigated aseptic seeding and rapid propagation of Paphiopedilum helenae. The
results show that the best method for pretreatment of P. helenae seeds was to soak them into 0.1 mol·L-1 KOH
for 10 min; the best medium for seeds germination was 1/4MS+0.1% (m/V) activated carbon (AC)+ 60 g·L-1
banana (Musa nana), and the germinating rate was up to 69.4%; the best medium for multiple shoots induction
was 1/2MS+0.5 mg·L-1 6-benzylaminopurine (6-BA)+2.0 mg·L-1 1-naphthaleneacetic acid (NAA)+0.1%
AC+60 g·L-1 banana; the best medium for rooting and growth of plantlet was MS+60g·L-1 potato (Solanum tu-
berosum) or MS+30 g·L-1 banana.
Key words: Paphiopedilum helenae; seed; aseptic seeding
Received 2016-06-20 Accepted 2016-08-05
This work was supported by the National Key Research Project of China (Grant No. 2016YFC0503104), the Natural Science Fund Project of
Guangxi (Grant No. 2012GXNSFBA053079), and Nanning Scientific Research and Technology Development Project (Grant No. 2013S13).
*Corresponding author (E-mail: huangyunfeng2000@126.com).