全 文 ：其绝对含量与上述质控样品中药物含量相等 , 各浓度 5份样品 ,
测定 , 质控样品峰面积平均值与对应浓度样品比较 , 得本法的提
取回收率 (见表 4)。 各脏器中龙胆苦苷提取回收率均大于
78%, 内标提取回收率大于 88%。
表 4　各组织龙胆苦苷提取回收率( x±s)
浓度 回收率(%)肝脏 心脏 脾脏 肺脏 肾脏
10ng· ml-1 97.5±7.3 99.4±5.9 96.2±3.0 114.3±6.5 113.1±5.2
1 500ng·ml-1 89.8±3.1 85.3±7.5 85.1±8.9 96.4±2.8 109.6±4.7
2500 ng· ml-1 81.9±5.6 85.7±2.3 78.2±6.4 88.0±4.2 105.3±8.0
内标 1μg· ml-1 92.8±7.2 102.6±9.7 92.2±5.9 92.2±5.1 88.9±7.6
3.5　稳定性 本实验条件下 , 各组织低 、中 、高浓度质控样品经 3
次冷冻 -融解循环和 -80℃保存 3个月 , 处理后进样 ,其测定值
与真实值比较 , 相对偏差均 <15%,表明样品均可保持稳定;处理
后的待测液在 4℃冰箱放置 16 h及在自动进样器中放置 8 h,经
测定均稳定。
3.6　龙胆苦苷灌胃给药后各组织浓度 小鼠按 50 mg· kg-1剂量
灌胃给予龙胆苦苷后 15, 30, 240 min组织中药物浓度结果见表
5。
表 5　各时间点龙胆苦苷在各脏器中的浓度( x±s)
时间
t/min
浓度 C/mg· ml-1
肝脏 心脏 脾脏 肺脏 肾脏
15 699.3±33.2 293.8±31.7 107.8±26.5 465.3±35.7 561.6±23.3
30 772.8±26.9 397.6±32.2 193.6±28.9 574.6±23.2 776.5±38.3
240 6.62±1.8 50.7±11.6 31.7±13.1 30.5±7.0 64.2±18.9
　　表中数据为 6只动物同一时间点的平均值
4　讨论
样品处理是影响测定结果的重要因素 ,文献报道的方法有甲
醇沉淀蛋白法 、液液萃取及固相萃取法等。本实验曾比较了甲醇
沉淀法 、液液萃取法及固相萃取法对龙胆苦苷提取回收率的影
响 , 结果发现虽然 3种处理方法均可达到 70% ～ 80%的萃取回
收率 , 但甲醇沉淀蛋白后 , LC/MS/MS检测 , 生物基质效应明显 ,
所含杂质较多 , 严重影响其检测灵敏度;醋酸乙酯 1∶10液液萃
取需提取两次 , 操作复杂 , 不适用大批量的生物样品测定;相比之
下固相萃取法 ,回收率高 、操作简便 ,生物基质干扰少 , 灵敏度高 ,
可实现批量处理 ,提高样品处理效率。因此 , 我们选择了固相萃
取法作为样品处理方法。
良好的精密度、准确度、重复性是保证实验结果的关键 , 本实
验所建立的 LC-MS/MS方法, 定量范围为 3 ～ 3 000 ng· ml-1 , 检
测下限为 3ng· ml-1 , 可满足组织样品对于准确度、灵敏度 , 重复
性等的要求;分析速度是影响实验成本及工作效率的重要因素 , 与
以往的龙胆苦苷组织测定方法 [ 2]相比 , 本方法分析时间缩短 , 仅为
3.5min,溶剂用量大幅度减少 ,在提高效率的同时还节约了大量
分析样品的成本 , 适宜于大量样品的组织分布实验的研究。
参考文献:
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收稿日期:2009-10-15;　修订日期:2010-01-06
基金项目:国家自然科学基金(No.30671541)
作者简介:华永丽(1979-),女(汉族),甘肃敦煌人 ,现任甘肃农业大学动物医学院助教 ,硕士学位 ,主要从事中药学研究工作.
＊通讯作者简介:魏彦明(1963-),男(汉族),甘肃渭源人 ,现任甘肃农业大学动物医学院教授 ,博士研究生导师 ,博士学位 ,主要从事临床兽医学 、中药
药理 、中药免疫研究和中兽药研发工作.
当归不同药用部位水提液体外清除自由基作用研究
华永丽 ,郭延生 ,邓红娟 ,程越山 ,曲亚玲 ,魏彦明＊
(甘肃农业大学动物医学院 ,甘肃 兰州　730070)
摘要:目的 研究生当归 、当归头 、当归身 、当归尾的水提取液体外对羟自由基(· OH)和氧自由基(O2 -· )的清除作用。
方法 应用分光光度法测定不同当归水提液对 Fenton反应产生的羟自由基(· OH)和邻苯三酚自氧化产生的氧自由基
(O2 -· )的清除能力。结果 当归不同部位水提液在受试浓度范围内对羟自由基和氧自由基有明显的抑制作用 , 随当归
及其不同部位水提液浓度的增加 ,抑制率明显升高 , 呈明显的量效关系 ,对羟自由基的清除能力依次为生当归 >当归身
≈当归头 >当归尾 , 对氧自由基的清除能力依次为当归身≈生当归 >当归头 >当归尾。 结论 当归不同部位水提液体外
均具有较好的清除自由基的作用 ,不同药用部位在清除氧自由基和羟自由基能力上表现不同。
关键词:当归;　不同部位;　水提液;　羟自由基;　氧自由基
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.07.003
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)07-1582-04
EffectofExtractsfromDifferentPartsofRadixAngelicaeSinensisonAntioxidativeActiv-
ity
HUAYong-li, GUOYan-sheng, DENGHong-juan, CHENYue-shan, QUYa-ling, WEIYan-ming＊
(GansuAgriculturalUniversity, ColegeofVeterinaryMedicine, Lanzhou730070, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheefectofwaterextractsofdifferentpartsofRadixAngelicaeSinensisonhydroxylradicalsand
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oxygenfreeradicals.MethodsTheinhibitionrateofwaterextractsofdifferentprocessedproductsofRadixAngelicaeSinensison
freeradicalinvitroweredetectedbyspectrophotometry.ResultsTheresultsshowedthatwaterextractsfromdiferentpartsofRa-
dixAngelicaeSinensisinvitrohadsignificantscavengingefectsonhydroxylradical.Furthermore, theextractsexhibitedasignifi-
cantconcentration-dependentelimination.ConclusionThewaterextractsfromdifferentpartsofRadixAngelicaeSinensishave
significantantioxidativeactionsinvitro.ThereexistsignificantdifferencesamongthesediferentpartsofRadixAngelicaeSinensis
onscavenginghydroxylradicalandoxygenfreeradical.
Keywords:RadixAngelicaeSinensis;　Diferentparts;　Waterextracts;　Hydroxylradicals;　Oxygenfreeradical
　　当归为伞形科当归属植物当归 Angelicasinesis(Oliv.)Diels.
的干燥根 , 主产于甘肃岷县等地 , 属甘肃道地药材 , 是中(兽)医
临床常用药 , 性温 ,味甘 、辛 , 具有补血活血 、调经止痛 、润燥滑肠
等功效 [ 1] 。中医药传统理论和临床经验认为 , 当归不同药用部
位具有不同的药效。现代药理研究表明 , 当归在心血管系统 、血
液系统 、免疫系统 、抗损伤及保护方面均显示良好的药理作用 ,且
具有一定的抗氧化和清除自由基的作用 , 对脑缺氧 、缺血后再灌
注脑组织脂质过氧化增高具有明显的抑制作用 [ 2] , 而中药抗氧
化的作用机制是清除机体在正常细胞代谢中产生的超氧阴离子
自由基 、羟自由基 、过氧化氢 、单线态氧等自由基 [ 3] 。为此 , 本实
验分别以超氧阴离子和羟自由基为检测指标 ,研究当归不同药用
部位抗氧化作用的异同 ,以期从生物学角度探讨当归不同药用部
位入药的依据。
1　材料与仪器
1.1　药物和试剂 生当归采于甘肃岷县(经甘肃中医学院中药
学系龙全江副教授和甘肃农业大学动物医学院中兽医教研组鉴
定为伞形科当归属植物当归), 取原药材 , 除去杂质 , 洗净 , 润透 ,
分头 、身 、尾切成薄片 , 晒干或低温干燥。 无水乙醇 、 FeSO4
· 7H2O、水杨酸 、H2O2 、邻苯三酚 、盐酸 、L-抗坏血酸等均为分析
纯;三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)为进口上海中秦化学试剂有限公
司分装。
1.2　仪器 RE-6000旋转蒸发仪(上海亚荣), TBZ5-WS多管
架自动平衡离心机(湘仪), HH-501超级恒温水浴箱 , OPPON-
3000型紫外 /可见光分光光度计(韩国), CW-2000型超声 -微
波协同萃取仪 , AL104电子分析天平 , SHB-III循环水式多用真
空泵 , C型玻璃仪器气流烘干器 , XW-80型旋涡混合器等。
2　方法
2.1　当归水提液制备 分别取生当归 、当归头 、当归尾 、当归身各
100g, 加蒸馏水 300ml, 85 ℃超声 -微波协同提取 2次 , 每次 30
min。合并两次提取液 , 减压浓缩至质量浓度 1 g/ml。 4 ℃保存
备用。
2.2　羟自由基体系 参照 Fenton反应的方法建立反应体系模
型 [ 4, 5] , 采用固定反应时间法 [ 6, 7] , 在相同体积的反应体系(6
mmol/L的 H
2
O
2
1ml, 6 mmol/L的 Fe2+ 1 ml, 6mmol/L的水杨酸
-乙醇溶液 1 ml)分别加入不同浓度的生当归 、当归头 、当归尾
和当归身水提液 1 ml, 设置 5个浓度组(质量浓度分别为 5, 10,
20, 40, 80mg/ml), 每个浓度设 10个平行管。以蒸馏水为参比 ,
在 510 nm处测量各浓度下的吸光度 , 通过公式计算其清除率。
以 L-抗坏血酸为阳性药物对照 , 质量浓度分别为 0.15, 0.20,
0.25, 0.30, 0.35 mg/ml共 5个浓度组 ,每个浓度设 10个平行管。
公式:清除率(%)=[ Ai-(Aj-Ad)] /Ai×100%
Ai为空白对照液的吸光度;Aj为加入药物溶液后的吸光度;
Ad为不加显色剂 H2O2药物溶液本底的吸光度。
2.3　氧自由基体系 [ 8 , 9] 采用邻苯三酚自氧化法 [ 10～ 12]:邻苯三
酚在弱碱性介质中自氧化分解产生 O2 -· ,利用 O2 -· 清除剂能
使邻苯三酚自氧化产物在 325 nm处的吸收峰受到抑制这一特点
设计实验 , 实验分为对照管和加药管 ,对照组管设 5个平行管 ,分
别加入 50mmol/L的 Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2, 含 1 mmol/L
二乙基三氨基五乙酸)4.5 ml, 加入 4.2 ml双蒸水 ,混匀后 25 ℃
水浴保温 20min,取出后立即加入 25 ℃水浴中预热的 6 mmol/L
的邻苯三酚 0.3 ml(以 10 mmol/LHCl代替邻苯三酚作为空
白),混匀后立即倒入比色杯 , 于 325 nm处每隔 30 s测 A值 1
次 , 共测 5 min,计算对照管溶液吸光度随时间的变化率。加药组
设 5个平行管 , 在加入邻苯三酚前先加入 1.0 ml当归提取液(设
质量浓度分别为 25, 50, 100, 200 mg/ml共 4个浓度梯度), 再加
入 3.2 ml双蒸水 , 混匀后 25 ℃水浴保温 20 min, 取出后立即加
入在 25℃水浴中预热的 6 mmol/L邻苯三酚 0.3ml, 混匀后立即
倒入比色杯 ,于 325 nm处每隔 30s测 A值 1次 ,共测 5min, 计算
当归及其炮制品水提取液吸光度随时间的变化率。以空白管标
零。以 L-抗坏血酸为阳性药物对照 , 设质量浓度分别为 0.02,
0.04, 0.08, 0.16 mg/ml共 4个浓度组 ,每个浓度设 5个平行管。
公式:清除率(%)=(⊿ A-⊿ A0)/⊿ A×100%
⊿ A:表示对照管邻苯三酚自氧化变化速率;⊿ A
0
:表示加药
管邻苯三酚自氧化变化速率)便能测定被测物对 O2 -· 的清除
作用。
2.4　数据统计处理 用 SPSS13.0统计软件进行方差分析 、回归
分析和线性相关 ,测定结果以 x±s表示 , 以(P<0.05)为检验水
准。
3　结果
3.1　当归不同药用部位水提液对羟自由基的清除作用 由表 1
可以看出当归不同部位水提液在不同实验浓度范围内都表现出
不同的对羟自由基清除能力(P< 0.05), 随着不同当归水提液
浓度的增加 ,抑制率明显增加 , 表明均呈明显的量效关系(r值分
别为生当归 0.971、当归头 0.960、当归身 0.946、当归尾 0.961, P
<0.05)。由表 3可以看出不同药用部位 IC50从小到大依次为
生当归 、当归身 、当归头 、当归尾 , 即生当归水提物对羟自由基的
清除能力依次为生当归 >当归身≈当归头 >当归尾。
表 1　当归不同部位水提液对羟自由基的清除作用( x±s)
浓度
C/mg· ml-1
清除率(%)
生当归 当归头 当归身 当归尾
5 16.12 1.36a 12.79 2.22a 13.78 1.39a 8.69 0.88a
10 34.69 1.17b 37.37 2.80b 32.65 1.36b 37.37 2.52b
20 66.73 2.32c 64.27 2.34c 69.50 2.31c 50.46 1.46c
40 88.26 0.56d 90.96 0.91d 91.29 1.06d 86.33 0.92d
80 97.72 0.38e 95.13 0.06e 95.71 0.20e 91.90 0.30e
　　a, b……表示同一样品不同浓度之间比较 ,不同字母表示差异显著(P<0.05),
相同字母 ,表示差异不显著(P>0.05)
3.2　当归不同药用部位水提液对氧自由基的清除作用 由表 2
可以看出当归不同部位水提液在不同实验浓度范围内都表现出
不同的对氧自由基清除能力(P< 0.05), 随着不同当归水提液
浓度的增加 ,抑制率明显增加 , 表明均呈明显的量效关系(r值分
别为生当归 0.983、当归头 0.946、当归身 0.915、当归尾 0.926、,
P< 0.05)。由表 3可以看出不同药用部位 IC
50
从小到大依次为
当归身 、生当归 、当归头和当归尾 ,即生当归及其炮制品水提物对
氧自由基的清除能力依次为当归身≈生当归 >当归头 >当归尾。
4　讨论
体外实验结果表明 ,生当归 、当归头 、当归尾 、当归身水提取
物能清除反应体系产生的 O2-·和 Fenton系统产生的· OH, 均
具有良好的量效关系 ,其均具有一定的抗氧化作用。当归不同药
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.7 时珍国医国药 2010年第 21卷第 7期
用部位抗氧化作用存在一定差异性 ,清除羟自由基能力为生当归
>当归身≈当归头 >当归尾。清除氧自由基的能力为当归身≈
生当归 >当归头 >当归尾。不同药用部位在清除氧自由基和羟
自由基能力上表现不同。
表 2　当归不同部位水提液对氧自由基清除作用( x±s)
浓度
C/mg· ml-1
清除率(%)
生当归 当归头 当归身 当归尾
25 26.94 1.29a 21.56 0.53a 26.18 0.74a 19.14 0.58a
50 38.83 0.52b 35.02 0.79b 36.48 0.26b 34.45 0.24b
100 52.44 0.85c 47.00 0.99c 53.02 1.14c 42.26 0.52c
200 87.58 0.13d 77.24 0.53d 91.32 0.20d 73.43 1.00d
　　a, b……表示同一炮制品不同浓度之间比较 ,不同字母表示差异显著(P<
0.05),相同字母,表示差异不显著(P>0.05)。
表 3　当归不同药用部位水提液对氧自由基 、
羟自由基半数抑制率( x±s)
自由基
种类
半数抑制率(%)
生当归 当归头 当归身 当归尾
阳性对照
L-抗坏血酸
氧自由基 12.99 13.71 13.43 17.00 0.18
羟自由基 63.32 84.16 61.4 96.23 0.104
　　
据文献报道 , 当归中的化学成分为苯酞类 、香豆素类 、黄酮
类 、挥发油类 、有机酸类 、多糖类化合物及其他成分。在当归的这
些化学成分中 , 除香柑内酯等呋喃香豆素外 , 其他类化学成分几
乎都与抗氧化有关 [ 13] ,其中阿魏酸 [ 14] 、挥发油 [ 13]和多糖 [ 15]都被
认为是抗氧化的主要成分作用 ,而这 3类成分现在被普遍认为是
当归的主要成分。 当归不同药用部位中 , 挥发油 、阿魏酸含量以
归尾最高 , 归头最低 [ 16] , 这个结果与实验所得当归头的清除氧自
由基和羟自由基能力强于当归尾不一致 ,说明当归不同药用部位
清除自由基的能力是多种化学成分协同作用的结果 ,也正是中药
多成分 、多靶点作用的结果。当归不同药用部位提取物中含量及
相互间的比例有所变化 ,这些成分之间协同作用 , 共同表现为清
除氧自由基和羟自由基的不同能力 , 而究竟是如何协同作用 ,还
有待进一步分析不同药用部位的化学成分变化。
中医药传统理论和临床经验认为 , 止血用当归头 ,补血用当
归身 , 破血用当归尾 ,和血(即补血活血)用全当归。本实验所得
结果也表明当归不同药用部位清除氧自由基和羟自由基的能力
不同 , 因此提示当归的分部位用药和炮制入药有一定的意义 ,为
中医药传统理论的验证提供了佐证。
综上所述 , 不同药用部位之间在清除氧自由基和羟自由基能
力上表现不同 , 这一实验结果与当归不同药用部位的化学成分变
化进行分析 ,发现其抗氧化能力可能不是单一成分作用的结果 ,
而是多个成分协同作用 , 提示中药的研究不能以单一成分为指
标;而中药不同部位入药的每个细节都与临床息息相关 , 在评价
当归不同药用部位作用时需要考虑的这一问题 ,需选择多种具有
代表性的指标进行研究 ,以期获得较为科学地阐明其分部位用药
原理及功效。
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