全 文 ：当归注射液对全脑缺血后神经
再塑影响的实验研究
邹　凡1　杨万同1　田　峻1　邓子牛2　廖维靖1
武汉大学中南医院 1康复医学科 , 2中心实验室　武汉　430071
摘要　目的:研究全脑缺血后海马区的神经再塑及当归注射液的影响。方法:60 只健康沙土鼠 , 双侧颈总动脉
夹闭 10 min 制作全脑缺血再灌注模型 ,分为治疗组和对照组 ,前者经腹腔给予当归注射液 , 后者给予生理盐水 , 另
选6 只沙土鼠作为正常组。于术后 16 h , 1 , 2 , 3 , 6 d 采用免疫组织化学方法检测海马区生长相关蛋白(growth-associ-
ated protein , GAP-43)、微管相关蛋白(microtubule-associated protein ,MAP-2)和突触素(synaptophysin , SYN)表达的变化。
结果:全脑缺血 10 min 再灌注 16 h 至 6 d , 动物脑组织各区尚未见明显形态学变化 , 而MAP-2 已随再灌注时间的延
长表达水平逐渐降低 ,至再灌注 3 d 达到最低 ,再灌注6 d 又轻度上升;GAP-43 和 SYN的表达水平则随再灌注延长
而不断上升 ,至再灌注 6 d 达到最高;在各时间点 ,治疗组 MAP-2、GAP-43 和 SYN的表达水平均高于对照组(P <0.
05)。结论:全脑缺血后海马区有明显的神经再塑和结构重建 , 活血化瘀药当归可加速这一过程。
关键词　全脑缺血;可塑性;生长相关蛋白;微管相关蛋白;突触素;当归
中图分类号　R 743.31　文献标识码　A　文章编号　1671-8852(2004)01-0038-04
The Effect of Angelica Injection on Neuronal Plasticity
after Global Cerebral Ischemia
Zou Fan , Yang Wantong , Tian Jun , et al
Department of Rehabilitation , Zhongnan Hospital ,Wuhan University ,Wuhan 430071 , China
Abstract
Objective:To study the effect of angelica injection on neuronal plasticity in hippocampus after global
cerebral ischemia.Methods:60 gerbils were used to develope global cerebral ischemia model by ligating bi-
lateral common artery for 10 minutes and then divided into treatment group , which were administrated with an-
gelica injection intraperitonealy , and control group that accepted normal saline.And another 6 gerbils were put
into normal group without operation and treatment.At 16 h ,1 ,2 ,3 ,6 d after operation , immunohistochemistry
was used to evaluate the expression of GAP-43 ,MAP-2 and SYN proteins in hippocampus of animals.Results:
No evident morphologic changes were detected after operation.MAP-2 expression gradually decreased , reaching
its lowerest level at 3 d , and sligthly increased at 6 d.While expressions of GAP-43 and SYN kept increasing.
On each stage , levels of all the three proteins expression in treatment group were higher than those in control
group.Conclusion:There is apparent neuronal plasticity and reconstruction in hippocampus after global cere-
bal ischemia.And this process can be accelerated by angelica injection.
Key Words　global cerebral ischemia;plasticity;growth-associated protein ,GAP-43;microtubule-asso-
ciated protein ,MAP-2;synaptophysin ,SYN;angelica
第 25卷　第1 期 武汉大学学报(医学版) Vol.25 , No.1
　 2004年 1 月 Medical Journal of Wuhan University Jan , 2004
课题来源:湖北省自然科学基金(98J099)　作者简介:邹凡 ,男 ,1975～ ,医学硕士生 ,主要从事神经康复方面的研究　通讯作者:杨万同 ,男 , 1944～ ,教授 ,主要从事神经 、脑缺血 、脊柱康复研究
DOI :10.14188/j.1671-8852.2004.01.012
　　当归作为传统的活血化瘀类中药 ,应用于临床
治疗缺血性脑血管疾病多年 ,对于改善神经功能缺
损症状有显著疗效。当归对急性缺血再灌注性损伤
有一定的保护作用。而对于当归的作用机理至今未
见分子水平的深入研究和系统报道 。本实验采用蒙
古沙土鼠制作全脑缺血模型 ,研究缺血后海马区的
神经再塑及当归注射液对脑的可塑性的影响。研究
表明 ,缺血后 ,受损脑组织会发生一系列病理生理变
化 ,导致结构破坏和功能障碍 ,而成熟脑组织仍保留
针对损伤进行结构再塑和功能重建的能力 ,称为脑
的可塑性 ,其解剖学基础是神经元突起(树突和轴
突)的发芽 、再生和重建突触联系[ 1] 。
1　材料与方法
1.1　动物的分组　66只清洁级沙土鼠 ,60 ～ 80 g ,购
于卫生部上海生物制品研究所动物中心 ,雌雄不限 ,
随机分为 3组:①正常组(6只);②治疗组(30只);
③对照组(30只)。后 2组各分为 5个时间点 ,即:缺
血再灌注 16 h ;缺血再灌注 1 d ;缺血再灌注 2 d;缺
血再灌注3 d;缺血再灌注 6 d。每个时间点均为 6
只。
1.2　施加处理因素　治疗组动物在手术后 6 h经腹
腔给予 25%当归注射液(由武汉大学中南医院生产)
2.5 mg·kg-1 ,对照组动物在手术后 6 h 经腹腔给予
相应剂量的生理盐水 。正常组不予治疗 。
1.3　动物模型的制备　用 0.4%戊巴比妥钠 40 mg·
kg-1体重经腹腔注射麻醉动物 ,行颈部正中切口 ,约
2 cm 长 ,分离双侧颈总动脉并用微动脉夹夹闭以阻
断颈部血供 ,造成全脑缺血[ 2] 。10 min 后松开动脉
夹恢复再灌注 ,并缝合切口 ,保持动物肛温 35 ～ 37
℃。正常组不予手术 。
1.4　取材与切片　在固定时间点麻醉动物 ,经心脏
灌流固定后断头取脑 ,脑组织于 4%多聚甲醛-磷酸
缓冲液固定 24 h ,随后浸入 30%蔗糖 4 ℃放置沉
底。从大脑前端至小脑和脑干分为 4等份 ,石蜡包
埋 ,取第 2段脑组织连续冠切制作石蜡切片 ,片厚 4
μm 。每只动物切9片 ,取 1片做HE染色 。
1.5　HE染色　切片脱蜡入水 ,苏木素室温下染色1
min ,1 %盐酸酒精分色 3 s ,1%氨水返蓝 5 min ,伊红
室温下复染 5 min ,脱水 、透明 ,中性树胶封片。镜下
观察组织形态学变化 。
1.6　免疫组化检测(SP法)　GAP-43 、MAP-2和 SYN
一抗为 Sigma公司生产 ,SP 试剂盒和 DAB试剂盒购
于北京中山试剂公司 。按照产品说明书操作。切片
脱蜡入水 ,3%H2O2 室温下孵育 15 ～ 18 min ,PBS 充
分漂洗 ,枸椽酸缓冲液微波修复(95 ～ 98 ℃),保持
15 min ,自然冷却至室温后加入正常封闭血清 ,室内
温孵育 15 ～ 18 min ,甩干后加入 MAP-2 一抗(1∶150)
或GAP-43一抗(1∶100)或 SYN 一抗(1∶150), 37 ℃
孵育 2 h ,PBS充分漂洗后加入生物素标记的二抗工
作液 37 ℃孵育 18 ～ 20 min , PBS充分漂洗后加入辣
根过氧化物酶标记的链酶亲和素工作液 ,37 ℃孵育
18 ～ 20 min ,充分漂洗后DAB室温下显色 ,镜控反应
时间(GAP-43反应时间约5min ,MAP-2反应时间约 3
min ,SYN 反应时间约 8 min),自来水充分冲洗中止
反应 。苏木素复染 ,脱水 、透明 ,封片。
1.7　图像分析　免疫组化阳性反应物标记强度用
平均光密度(OD)表示 ,应用 Scion image 图像分析软
件测定海马区的OD值 ,并测同一切片胼胝体OD值
作为背景 ,两者相减得到校正 OD值(OD′)。每只动
物标本作 4张切片 ,每张切片取双侧海马区显微镜
下 6个高倍镜视野进行OD′检测 ,取平均值 。
1.8 　统计学处理 　各组结果用 x ±s 表示 , 用
SPSS11.0软件进行单因素方差分析 ,取α=0.05水
准。
2　结果
2.1　HE染色　所有动物大脑各区未见明显的缺血
性损伤 ,细胞境界清楚 ,排列整齐 ,组织结构规则完
整。
2.2　GAP-43免疫组化染色结果　正常组 ,动物脑
组织大部分区域呈阴性染色 ,顶叶皮质 、海马 、嗅球
和听觉脑干等区呈弱阳性染色。海马区 GAP-43集
中表达于分子层和放线层。对照组 ,海马区再灌注
16 h 后GAP-43表达强度轻度上升 ,并随再灌注时间
的延长呈逐渐递增的趋势 ,再灌注 6 d达到最高 。治
疗组 GAP-43表达水平在各时间点均高于对照组 ,两
者之间差异有显著性(P <0.05)(见表 1)。
2.3　MAP-2免疫组化染色结果　正常组 ,MAP-2表
达于神经元的树突和核周胞浆 ,形态规则 ,以海马分
子层和放线层染色最强 。对照组 ,缺血 10 min 再灌
注 16 h 海马区染色减弱 ,以 CA1区最明显 ,并随再
灌注时间延长染色更加降低 ,至再灌注 3 d 达到最
低 ,再灌注6 d时染色程度有轻度上升 。治疗组在各
时间点均高于对照组(P <0.01)(见表 2)。
2.4　突触素 SYN免疫组化染色结果　突触素 SYN
均匀表达于海马区的分子层和放线层 ,并衬托出树
突分支的轮廓。对照组 ,海马齿状回区再灌注 16 h
39第 1期 邹　凡 ,等.当归注射液对全脑缺血后神经再塑影响的实验研究
后突触素 SYN表达强度上升 ,并随再灌注时间的延
长呈递增的趋势 ,再灌注6 d达到最高。治疗组突触
素 SYN表达水平在各时间点均高于对照组 ,两者之
间差异有显著性(P <0.01)(见表 3)。
表 1　各组 GAP-43表达情况
分组 平均光密度(OD′值)未灌注 再灌注 16 h 再灌注 1 d 再灌注 2 d 再灌注 3 d 再灌注 6 d
正常组 16.44±1.14＊ 　　- - - - -
治疗组 - 22.35±1.13■ 24.16±1.27■ 26.77±1.32■ 29.07±1.25■ 　33.58±1.42■■
对照组 - 19.11±1.0 19.28±1.29 24.50±1.22 26.04±1.28 32.20±1.39
　　　　＊正常组与其它组时间点相比 , P<0.01;■与对照组相应时间点相比 , P<0.01;■■与对照组相应时间点相比 , P<0.05
表 2　各组 MAP-2 表达情况
分组 平均光密度(OD′值)未灌注 再灌注 16 h 再灌注 1 d 再灌注 2 d 再灌注 3 d 再灌注 6 d
正常组 50.02±0.60＊ 　　- - - - -
治疗组 - 46.18±1.14■ 45.43±0.85■ 39.29±0.99■ 33.17±1.01■ 38.88±0.94■
对照组 - 43.82±0.98 42.38±1.10 33.44±0.66 30.39±0.86 32.94±1.00
　　　　＊正常组与其它组时间点相比 , P<0.01;■与对照组相应时间点相比 , P<0.01
表 3　突触素 SYN 表达情况
分组 平均光密度(OD′值)未灌注 再灌注 16 h 再灌注 1 d 再灌注 2 d 再灌注 3 d 再灌注 6 d
正常组 12.57±0.99＊ 　　- - - - -
治疗组 - 19.17±1.14■ 23.07±1.14■ 28.74±1.15■ 32.35±1.13■ 34.25±1.27■
对照组 - 16.06±1.13 17.66±1.12 22.07±1.27 25.47±1.28 27.08±1.28
　　　　＊正常组与其它组时间点相比 , P<0.01;■与对照组相应时间点相比 , P<0.01
3　讨论
近年来研究表明 ,当归对急性缺血再灌注性损
伤有一定的保护作用 。其机理多认为当归有抗自由
基作用 ,利于减轻对细胞的损害 ,抑制 TXA2产生和
血小板集聚作用 ,改善微循环等[ 3] 。本实验采用全
脑缺血模型 ,研究当归对脑缺血性损伤的保护作用
和对脑可塑性的影响 。
MAP-2是神经元特异性结构蛋白 ,表达于成熟
神经元的核周胞浆和树突 ,具有组装微管 、构成并稳
定细胞骨架结构的作用 。MAP-2对缺血性脑损伤非
常敏感 ,单侧颈总动脉阻断 3 min 就可观测到海马
CA1区锥体细胞树突 MAP-2 免疫组化染色降低 ,而
形态学检测难以发现明显的变化。在MAP-2丢失的
区域树突出现萎缩而 MAP-2免疫反应增加的区域与
树突发芽有关[ 4 ,5] 。本实验显示 , 缺血后海马区
MAP-2表达水平下降 ,神经元部分树突出现萎缩 ,随
着再灌注时间的延长 ,MAP-2免疫染色降低更明显 ,
再灌注 6 d又逐渐升高 ,树突数量和长度均增加 ,意
味着缺血性损伤后树突的重建 。而 HE染色始终未
见明显异常 ,这与其它作者的观点相吻合[ 3] 。当归
治疗显然可以减轻树突的破坏 ,促进树突的再生。
GAP-43是一种钙离子依赖性钙调素结合蛋白 ,
在神经系统发育期高表达于神经元的核周胞体和轴
突 ,在成熟神经组织低水平或不表达 ,在受到损伤时
GAP-43一过性高表达 ,介导轴突出芽生长和突触形
成。GAP-43 被视为神经可塑性的分子标志物[ 6] 。
在本实验中 ,GAP-43在缺血再灌注 16 h 表达开始增
强 ,再灌注 6 d 内表达持续上升。
SYN是一种位于突触囊泡膜上相对分子质量为
38 kU的钙结合蛋白 ,又称 P38 ,在钙依赖性神经递
质释放过程中起重要作用。胚胎发育过程中 ,SYN
的表达与突触的形成是一致的 ,因而是突触发生的
标志物[ 7] 。有研究显示 ,对大鼠进行学习记忆训练
可使 CA3区突触素表达增加[ 8] 。
本实验中 ,SYN在缺血 10 min 后表达持续增强 ,
在再灌注 6 d 达到最高 ,其表达增强的时空模式与
GAP-43的表达相一致 ,提示在缺血损伤后 ,伴随着
轴突的出芽和伸长 ,有新的突触形成 。这一发现解
释了在脑缺血经过一定阶段后缺损的功能可有所恢
复这一临床现象。治疗组GAP-43和 SYN表达强度
增高的程度较对照组更加明显 ,表明活血化瘀药当
归注射液可促进缺血损伤后脑组织的结构再塑 。
另外 ,本实验似乎无法解释为何缺血后突触素
SYN表达逐渐上升 ,而微管相关蛋白 MAP-2表达却
40 武汉大学学报(医学版) 第 24卷
持续下降 ,直到再灌注 6 d 表达才上升。事实上 ,由
于神经元胞体的接触面是很小的 ,树突和轴突是扩
大神经元接触面的主要贡献者 ,若树突被严重水解
破坏 ,是无法新建大量突触联系的 ,因而突触素 SYN
的表达也不会持续上升。之所以出现这种情况 ,可
能是缺血后 ,对缺血敏感的CA1区树突持续破坏 ,超
过了其他区域MAP-2表达增强的程度。直到再灌注
6 d , CA1 区树突破坏减轻或已开始重建 , 海马区
MAP-2 表达的总体水平才开始上升 , 此时突触素
SYN表达水平也持续上升。
综上所述 ,在缺血性脑损伤后 ,减轻脑组织的结
构破坏 ,促进树突的重建 ,促进轴突的出芽伸长和新
的触突的建立可能是当归对脑缺血治疗作用的基
础 ,但其具体机制尚不清楚 ,可能与当归抗自由基损
伤 、抑制钙超载 、改善微循环等作用有关 。由于神经
组织的再生需要神经营养因子的存在 ,当归是否可
促进营养因子的生成 ,尚有待于进一步的研究证实 。
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(2003-07-06 收稿)
编辑　张　峻
(上接第 31页)
　　本研究结果显示 ,枸杞多糖对受损伤的大鼠生
殖系统具有良好的保护作用 ,能降低高温引起的生
精细胞损伤 、改善生精功能障碍 、促进睾丸生殖细胞
正常发育 ,其机制可能是通过对抗过氧化自由基对
DNA大分子的损伤 ,以及调节下丘脑-垂体-性腺轴
提高性激素水平实现的。枸杞多糖对大鼠生殖系统
的保护作用在一定阈值范围内显示出极强的生物效
应 ,以 10 mg·kg-1·d-1剂量最佳 ,其效果不随剂量的
增加而加强。
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编辑　孙孝云
41第 1期 邹　凡 ,等.当归注射液对全脑缺血后神经再塑影响的实验研究