全 文 ：　第 20卷第 10期
2008年 10月
化 学 研 究 与 应 用ChemicalResearchandApplication Vol.20, No.10Oct., 2008 　
收稿日期:2007-11-20;修回日期:2008-03-15
基金项目:广西自然科学资金资助项目(0640038);肇庆市科技计划资助项目(10560);肇庆学院自然科学基金资助项目(0664)
联系人简介:韦寿莲(1965-),女 ,教授 ,主要研究方向为药物分析。 Email:mary@zqu.edu.cn
文章编号:1004-1656(2008)10-1335-03
HPLC法测定叶下珠中豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇
严子军 1 ,钟智龙1 ,韦寿莲1＊ ,邓光辉 2
(1.肇庆学院化学化工学院 ,广东　肇庆　526061;
2.广西民族大学化学与生态工程学院 ,广西　南宁　530006)
关键词:叶下珠;HPLC;豆甾醇;β -谷甾醇;羽扇豆醇
中图分类号:0657.7　　文献标识码:A
　　叶下珠为大戟科叶下珠属植物(Phylanthus
urinariaL)又名珍珠草 ,为一年生矮小草本植物。
叶下珠具有清热利尿 、解毒 、止泻 、抑菌 、体内和体
外抗 HBV[ 1] 、防治肝细胞损伤 [ 2] 、预防肝癌 、抗艾
滋病病毒及治疗乙型肝炎等作用[ 3] 。叶下珠的药
用与醇类有关 ,目前国内报道测定 β -谷甾醇和
豆甾醇的方法有紫外光谱法 [ 4] 、红外光谱法 [ 5] 、毛
地黄皂苷法 、薄层色谱法 、气相色谱法[ 6] 、高效液
相色谱法和高效液相柱前衍生化法[ 7] 。本文采用
HPLC法同时分离豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇 ,
并应用于监测超临界 CO2萃取叶下珠中醇类物质
的效果 。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
叶下珠全草(采自肇庆市北岭山);豆甾醇对
照品(含量 >95%,上海友思生物技术有限公司);
β -谷甾醇对照品(含量≥98%,科翔生物技术科
技有限公司);羽扇豆醇对照品(含量≥90%,上海
友思生物技术有限公司)。高效液相色谱仪
Agilent1200;G1314BVWD紫外检测仪;色谱柱为
EclipseZorbaxXDB-C18(150 mm×4.6 mmi.d.,
5μm);1 L/45 MPa超临界二氧化碳萃取仪(美晨
高新分离技术有限公司)。
1.2　实验方法
1.2.1　色谱条件　检测波长 210 nm;流动相为水
和甲醇;流速 0.7 mL/min;试样进样量 20μL。
1.2.2　对照品溶液制备　分别准确称取干燥至
恒重的豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇对照品 4.4mg、5.0 mg和 5.0 mg,置 10mL量瓶中 ,加甲醇溶
解并稀释至刻度 ,摇匀 , 分别制成 0.44 mg/mL、
0.50 mg/mL、0.50 mg/mL的溶液 ,备用 。
1.2.3　供试品溶液制备　将采集的叶下珠全草
晒干 ,粉碎 ,过 20目筛(孔径 1.25 mm,粒径≤1.5
mm)。
超临界 CO2萃取工艺设计:选定四个因素三个
水平 ,根据正交设计方法按表 L9(34)安排实验 ,以三种醇类的含量为检测指标 ,因素水平安排见表 1。
表 1　水平因素表 L9(34)Table1　FactorsandlevelsoforthogonalL9(34)
水平 A B C D萃取压力 /Mpa 萃取温度 /℃ 解析温度 /℃ 夹带剂 /mL/100g原料
1 15 45 35 0.0
2 20 50 40 5.0
3 25 55 45 10.0
　　准确称取叶下珠粉末 100 g,按表 1中萃取条
件进行萃取 。萃取时间为 2.0h,分离压力为 5±1
MPa,系统稳定循环预设的时间后 ,从分离罐出口
处收集萃取物。萃取物挥干 ,用甲醇溶解 ,转移至
25 mL量瓶中 ,并稀释至刻度 ,摇匀 ,用 0.45μm滤
膜过滤 ,取滤液做供试样品 。夹带剂为 80%乙醇-水溶液 。引入方式是:把夹带剂加入到萃取原
料药粉中 ,摇匀 ,放置 24 h,使夹带剂渗入到颗粒(基体)内部 ,再进行超临界萃取。
化 学 研 究 与 应 用 第 20卷
2　结果与讨论
2.1　HPLC方法建立
2.1.1　流动相的选择 　以甲醇 -水 、乙腈 -水 、
乙腈为流动相 ,均不能使豆甾醇 、β -谷甾醇和羽
扇豆醇很好分离 。使用三元流动相系统甲醇 -乙
腈 -水(55∶36∶9),豆甾醇出峰快 ,受到溶剂甲醇干
扰。采用梯度洗脱 ,样品 1 h后才出峰 。采用纯甲
醇为流动相能很好分离三种醇类物质。当流动相
的流速为 0.7mL/min时 , t0为 2.07min,豆甾醇 、β -谷甾醇 、羽扇豆醇的出峰时间分别为 13.68,
14.97, 17.00 min, 对应的保留因子 k分别为
5.61, 6.23, 7.21(如图 1)。说明以纯甲醇为流动
相分离效果良好 ,适于复杂样品分析 ,分析时间
较快 。
图 1对照品(A)和提取物(B)HPLC色谱图
Fig.1HPLCchromatogramsofastandartsample
(A)andextractivefromphyllanthusurinariaL(B)
1.豆甾醇(stigmasterol);2.β -谷甾醇(β -sitosterol);
3.羽扇豆醇(lupeol)
2.1.2　线性范围　分别精密吸取上述对照品溶
液 1、2、5、10、15、20μL,注入液相色谱仪中 , 以浓
度 [ x=(进样体积 /20)×对照品溶液的浓度 , mg/mL]为横坐标 ,测定的峰面积(y)为纵坐标 ,建立
标准工作曲线。豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇分
别在 0.44mg/mL～ 8.80 mg/mL、 0.50mg/mL～
10.00 mg/mL、0.50mg/mL～ 10.00 mg/mL内呈良
好线性关系 ,线性方程分别为:y豆甾醇 =104.15x+
12.498(R2 =0.9975);yβ -谷甾醇 =116.34x+1.
9848(R2 = 0.9978);y羽扇豆醇 = 277.48x-19.76
(R2 =0.9981)。豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇的
检出限(S/N=3)分别为 0.03、0.02、 0.04mg/mL。
2.1.3　精密度　取对照品溶液 20μL,在上述色
谱条件下连续进样 6次 ,分别测定豆甾醇 、β -谷
甾醇 、羽扇豆醇的峰面积和保留时间。结果发现:
豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇的峰面积和保留时
间的 RSD≤2.00%和 RSD≤0.28%,说明峰面积
和保留时间的精密度和重现性良好 。
2.1.4　准确度　取相同量的供试液于 25 mL量
瓶中 ,加入不同量的豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆
醇对照品溶液 , 用甲醇定容 ,摇匀 ,用 0.45 μm滤
膜过滤 ,按前述 HPLC方法测豆甾醇 、β -谷甾醇
和羽扇豆醇的含量 ,数据见表 2。
表 2　豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇的准确度(n=6)
Table2　Theaccuracyofstigmasterol, β -sitosterolandlupeol(n=6)
样品 豆甾醇 β -谷甾醇 羽扇豆醇
1# 2# 3# 1# 2# 3# 1# 2# 3#
样品含量 (mg/g) 0.90 0.60 0.30 0.90 0.60 0.30 0.90 0.60 0.30
加标量 (mg/g) 0.89 0.61 0.29 0.88 0.60 0.29 0.91 0.59 0.31
回收率 (%) 98.9 102 96.7 97.8 100 96.7 101 98.3 103
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第 10期 严子军等:HPLC法测定叶下珠中豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇
2.1.5　稳定性　取同一份对照品溶液分别在配
制后 0、4、6、8、12 h进样测定 ,豆甾醇 、β -谷甾醇
和羽扇豆醇峰面积的 RSD≤2.92%。豆甾醇 、β -
谷甾醇和羽扇豆醇在 12 h内稳定性良好 。
2.2　应用
2.2.1　超临界 CO2萃取条件优化　按照上述萃
取工艺的设计进行条件优化 ,得到最佳萃取条件
为:萃取压力 20 MPa,萃取温度 50 ℃,解析温度
45℃,无夹带剂。
2.2.2　样品测定和萃取回收率
表 3　样品含量测定和萃取回收率(n=5)
Table3Thesamplecontentdetectionandextractionrecovery(n=5)
样品 样品含量(mg/g)
加标量
(mg/g)
样品加标后总含量
(mg/g) 平均回收率(%)
RSD
(%)
豆甾醇 0.56 0.08 0.63 87.5 1.05
β -谷甾醇 0.15 0.12 0.25 83.3 1.24
羽扇豆醇 0.06 0.11 0.16 90.9 0.98
　　精确称取干燥至恒重的样品 10份 ,每份 10g, 5
份不加对照品 ,另 5份精密加入一定量的豆甾醇 、β
-谷甾醇和羽扇豆醇对照品 ,按优化的超临界 CO2
萃取方法萃取 , HPLC方法测定 ,结果见表 3。 5次
测定豆甾醇 、β -谷甾醇和羽扇豆醇的平均值分别
为 0.559mg/g, 0.149mg/g, 0.061mg/g, 萃取回收
率均在 83.3%以上 , RSD均小于 1.24%。
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Determinationofstigmasterol, β-sitosterolandlupeolin
phylanthusurinariaLbyHPLC
YANZi-Jun1 , ZHONGZhi-Long1 , WEIShou-Lian1＊ , DengGuang-hui2
(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,
ZhaoQingUniversity, Zhaoqing526061, China;
2.DepartmentofChemistryandecologicalengineering,
GuangxiUniversityforNationalities, Nanning530006, China)
Abstract:ToestablishanHPLCmethodforseparationanddeterminationofstigmasterol, β -sitosterolandlupeolinphyllanthus
urinariaLbyHPLC.AEclipseZorbaxXDB-C18 column(4.6mm×150mmi.d., 5μm)wasusedforchromatographicseparationundertheconditionswithmethanolasthemobilephaseatflowrateof0.7 mL/min.Thedetectionwavelengthwas210 nm.The
resultsindicatedthatstigmasterol, β-sitosterolandlupeolcouldbebaselineseparated.Thelinearrangeofstigmasterol, β -sitosterol
andlupeolwere0.4mg/mL～ 8.8 mg/mL(R2 were0.9975), 0.5 ～ 10.0 mg/mL(R2 =0.9978)and0.5mg/mL～ 10.0 mg/mL
(R2 =0.9981), respectively.Themeanrecoveriesofstigmasterol, β-sitosterolandlupeolwere94.4% ～ 95.1%, 91.2% ～
97.9% and92.4% ～ 104.6 %, respectively.RSDwaslessthan5%.Themethodhasbeenappliedtomonitortheextractionof
stigmasterol, β -sitosterolandlupeolinphylanthusurinariaLbysuper-criticalfluidextractionwithsatisfactory.
Keywords:phylanthusurinariaL;HPLC;stigmasterol;β -sitosterol;lupeol
(责任编辑　李　方)
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