全 文 ：基于 POD同工酶对石蒜属种间和石蒜居群间
进化关系的研究
夏齐平1 , 　余本祺2 , 　周守标1
(1.安徽师范大学生命科学学院 ,安徽 芜湖　241000;2.安徽工程大学外国语学院 ,安徽 芜湖　241000)
摘　要:对石蒜属(Lycoris)9个种和石蒜(L .radiata)16个居群的 POD同工酶酶谱进行了分析
和比较.结果表明:(1)石蒜属植物共显示出 24条酶带(种间和居群间各 12条),其中五条是特征酶
带(种间和居群分别为 3条和 2条).(2)石蒜属 9个种可分为两类:一类由具有两型核型结构(V型
和 I型)的 7个种所组成:即中国石蒜 L .chinensis 、忽地笑 L .aurea 、长筒石蒜 L .longituba 、鹿葱
L .squamigera 、安徽石蒜 L .anhuiensis 、香石蒜 L .incarnata 、乳白石蒜 L .albi f lora ;另一类由
具单型核型结构(I型)的2个种所组成:即石蒜 L .radiata 、换锦花 L .sprengeri .其中 ,中国石蒜
和忽地笑亲缘关系最近 ,与形态学和细胞学研究结果相近.(3)石蒜 POD同工酶变异比较丰富 ,与
石蒜染色体核型和数量多样性相符.POD同工酶研究显示石蒜居群间遗传距离与地理距离不存在
相关性.研究结果表明同工酶变异分析可以作为探讨石蒜属种间亲缘关系和石蒜遗传多样性的有
效手段.
关键词:石蒜属;石蒜;居群;过氧化物酶同工酶;种间关系;遗传多样性
中图分类号:Q319　　文献标识码:A　　文章编号:1001-2443(2011)02-0154-06
　　石蒜属(Lycoris)植物为石蒜科具鳞茎的多年生草本植物.据不完全统计 ,石蒜属植物全世界约 20余
种 ,主产我国和日本 ,少数产于缅甸和朝鲜 ,为典型东亚属;我国约有 15种 ,主要分布于长江以南地区 ,尤以
温暖地区种类较多[ 1] .该属植物花期无叶 ,叶期无花 ,叶期在春季或秋季 ,是很好的园林绿化植物.而且 ,该
属植物花朵色彩鲜艳 ,形态别致 ,花色变异丰富 ,是非常好的园艺观赏花卉 ,也是很好的切花材料.石蒜是石
蒜属中分布范围最广的一个种 ,其花色鲜红 ,主要包括二倍体 、三倍体和四倍体石蒜原变种(L .radiata
var.radiata)[ 2] ,以及短小石蒜变种(L .radiata var.pum ila)[ 3-4] .
　　对石蒜属植物的研究 ,国内外已有很多报道 ,例如细胞学[ 5-8] 、孢粉学[ 8-9] 、分子系统学[ 11-12]等方面 ,
但有关同工酶的研究 ,国内外尚未见比较系统的报道 ,仅有少数学者用同工酶方法分析了部分石蒜属植物的
过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、乙醇脱氢酶(ADH)和苹果酸脱氢酶(MDH)等酶[ 13-15] .本文对石蒜属 9种
植物和石蒜 16个居群植物的 POD同工酶酶带进行了比较与分析 ,为石蒜属植物的分类 、系统进化以及石蒜
种内遗传多样性的研究提供分子水平的依据 ,同时为该属植物的遗传改良及新品种的选育提供一些基础的
资料.
1　材料与方法
1.1　材料来源
　　所有供试材料采回后统一种植于塑料花盆中(口径 20cm),具体产地见表 1和 2.
1.2　样品处理
　　每个种和每个石蒜居群各取 10个植株 ,剪取每个植株盛叶期叶片中部的叶 0.1g ,达到每个试样 1g .蒸
馏水洗净 ,冰箱预冷 1小时后 ,置于冰浴研钵中 ,加入 5mL 复杂提取液[ 16]和适量的石英砂 ,研磨成匀浆 ,研
收稿日期:2010-12-03
基金项目:安徽省自然科学基金(11040606M77);安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室资金 , 生物环境与生态安全重点实验室资金
(2004sys003);安徽师范大学大分子进化重点实验室资金.
作者简介:夏齐平(1963-),男 ,安徽当涂人 ,讲师.
第 34卷 2期
2011年 3月 　　 安徽 师范 大学 学 报(自然科学版)Journal of Anhui Normal University (Natural Science) Vol.34 No.2M ar .2 0 1 1
DOI :10.14182/j.cnki.1001-2443.2011.02.006
磨液于高速冷冻离心机中离心(15000rpm ×15min ,4℃),取上清液于冰箱中备用(4℃).
表 1　石蒜属 9种植物材料来源
Table 1　Origins of materials of nine Lycoris species
种名 Species 采集地 Localit y 采集人 Collector 编号Code
香石蒜 L.incarnata 江苏南京 Nanjiang , Jiangsu 秦卫华 W.H.Qin S1
乳白石蒜 L.albif lora 浙江杭州 Hangzhou , Zhengjiang 秦卫华 W.H.Qin S2
鹿葱 L.squamigera 浙江杭州 Hangzhou , Zhengjiang 秦卫华 W.H.Qin S3
长筒石蒜 L.long ituba 安徽滁州 Chuzhou , Anhui 秦卫华 W.H.Qin S4
忽地笑 L .aurea 安徽滁州 Chuzhou , Anhui 周守标 S.B.Zhou S5
中国石蒜 L.chinensis 安徽滁州 Chuzhou , Anhui 周守标 S.B.Zhou S6
安徽石蒜 L .anhuiensis 安徽滁州 Chuzhou , Anhui 周守标 S.B.Zhou S7
换锦花 L .sprengeri 安徽马鞍山 Maanshan , Anhui 余本祺 B.Q.Yu S8
石蒜 L .radiata 安徽宣城 Xuancheng , Anhui 秦卫华 W.H.Qin S9
表 2　石蒜 16 个居群的材料来源
Table 2　Origins of materials of sixteen populations of Lycoris radiata
居群 Populations 采集地 Locality 采集人 Collector 编号Code
神山居群 Shenshan Population 安徽芜湖 Wuhu , Anhui 余本祺 B.Q.Yu P1
南京居群 Nanjing Population 江苏南京 Nanjing , Jiangsu 余本祺 B.Q.Yu P2
琅琊山居群 Langyashan Population 安徽滁州 Chuzhou , Anhui 周守标 S.B.Zhou P3
天堂寨居群 Tiantangzhai Populat ion 安徽金寨 Jinzhai , Anhui 余本祺 B.Q.Yu P4
龙金村居群 Longjincun Population 安徽霍山 Huoshan , Anhui 秦卫华 W.H.Qin P5
清凉峰居群 Qingliangfeng Populat ion 安徽绩溪 Jixi , Anhui 王春景 C.J.Wang P6
采石矶居群 Caishiji Population 安徽马鞍山 Maanshan , Anhui 余本祺 B.Q.Yu P7
牯牛降居群 Guniujiang Populat ion 安徽石台 Shitai , Anhui 王影 Y.Wang P8
桃花镇居群 T aohuazhen Population 安徽肥西 Feixi , Anhui 柳后起H.Q.Liu P9
大城乡居群 Dachengxiang Populat ion 安徽铜陵 Tongling , Anhui 余本祺 B.Q.Yu P10
萍乡居群 Pingxiang Population 江西萍乡 Pingxiang , Jiangxi 何锋 F.He P11
九华山居群 Jiuhuashan Populat ion 安徽青阳 Qingyang , Anhui 王影 Y.Wang P12
富阳居群 Fuyang Population 浙江杭州 Hangzhou , Zhengjiang 秦卫华 W.H.Qin P13
敬亭山居群 Jingt ingshan Population 安徽宣城 Xuancheng , Anhui 秦卫华 W.H.Qin P14
宫崎居群 Miyazaki Populat ion 日本宫崎 Miyazaki , Japan 周守标 S.B.Zhou P15
天柱山居群 Tianzhushan Population 安徽潜山 Qianshan , Anhui 秦卫华 W.H.Qin P16
1.3　电泳与染色
　　参照袁晓华等[ 17] 的方法 ,采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 ,其分离胶浓度为 75%,浓缩胶为
3%,pH8.9 ,电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH8.3);用循环冷却装置保证电泳在 0-4℃进行.每槽加样 25μl ,
并加入几滴 2.00g/L 的溴酚蓝以示前沿 ,稳流电泳 ,浓缩胶电流 15mA/板 ,分离胶电流 30mA/板 ,待指示剂
移至距离顶端约有 1cm 时停止电泳.采用醋酸联苯胺染色方法(0.2%的醋酸联苯胺液 5ml , 3%的过氧化氢
2ml ,加蒸馏水至 100ml),将凝胶放入瓷盘中配好的染色液内 ,待酶带显色后 ,用自来水冲洗 ,再以 7%乙酸溶
液固定 、记录 、照相.
1.4　资料整理与分析
　　分析并画出酶带模式图 ,计算各酶谱间的相似系数(S):S=2W/(a+b),式中 a为 A种植物酶谱的酶带
数 ,b为 B种植物酶谱的酶带数 ,W是 A和 B两个种相同的酶带数.以 DPS 数据处理系统进行模糊聚类 ,绘
出模糊树系图.
2　实验结果
2.1　石蒜属 9种植物的 POD同工酶酶谱特征
　　从 POD同工酶的电泳图谱(图 1 、图 2)可以看出供试材料的 POD同工酶共显示 12条 Rf 值不同的酶
带 ,从负极到正极分布于慢(Rf≤0.256)、中(0.449≤Rf≤0.526)和快(0.641≤Rf≤0.821)三个区.在快速带
区有密集排列的五条带 ,种间差异不大 ,其中 Rf=0.679 、0.769 、0.821的三条酶带出现的频率高达 0.889 、
0.889 、1.000 ,是本属植物 POD的特征酶带;在中速带区也有密集排列的三条带 ,其中 Rf=0.526的强带只
15534卷第 2期　　　夏齐平 ,余本祺 , 周守标:　基于 POD同工酶对石蒜属种间和石蒜居群间进化关系的研究
在S9中出现;POD的酶活性主要集中在快区和中区的酶带.慢速带区有四条带 ,种间差异比较大 ,因而种间
的酶谱差异主要表现在慢速区.在所试植物中 ,S1的酶带数量最少 ,仅有两条弱带一条中带 ,酶活性弱 ,与属
内其他种差异较明显.S5 、S6的酶谱相似.
图 1　石蒜属 9个种 POD同工酶酶谱
图中的字母代表不同的种 ,与表 1所介绍的一致.下同
Fig.1　POD isozyme zym ogram of 9 Lycori s species
The let ters in f igure stand for dif ferent species as int roduced in tabel-1.The same below.
图 2　石蒜属 9个种 POD同工酶酶谱的模式示意图
Fig.2　The pat tern sketch map of POD isozyme zymogram of 9 Lycoris species
2.2　石蒜 16个居群植物的 POD同工酶酶谱特征
　　石蒜 16个居群植物的 POD同工酶酶谱也一共显示 12条 Rf值不同的酶带(图 3 、图 4),从负极到正极
同样分布于慢(Rf≤0.256)、中(0.449≤Rf≤0.526)和快(0.628≤Rf≤0.821)三个区.在快速带区有密集排
列的五条带 ,居群间差异比较大 ,因而居群间的酶谱差异主要表现在快速区;在中速带区也有密集排列的三
条带 ,其中 Rf=0.628的弱带只在 P15 中出现;而 P7 、P8 、P12和 P16在快区和中区均没有酶谱显示.慢速
带区有四条带 ,其中 Rf=0.179和0.205的两条酶带出现的频率高达 0.813和1.000 ,是本种植物POD的特
征酶带.P6 、P7 、P12与 P13的酶带数量最少 ,仅有两三条酶带 ,酶活性弱 ,与种内其他居群差异较明显;而
P14的酶带数量最多 ,有 9条 ,酶活性较强.
3　分析与讨论
3.1　石蒜属 9种植物 POD同工酶酶谱分析和种间进化关系的探讨
　　对石蒜属 9个种 POD同工酶酶谱资料进行聚类分析(图 5),结果表明石蒜属植物可以分为两大类:S1
-S7聚成一类;S8和 S9 聚成另一类 ,与核型研究[ 4-6]和张露等[ 11]采用 RAPD 标记的分类结果基本上一
致.各个类群都是以染色体数目相似聚在一起的 ,第一类由具单型核型结构(I 型)的种所组成 ,染色体基数
为 x=11;第二类由具有两型核型结构(V 型和 I型)的种所组成 ,染色体基数不等.说明同工酶变异分析可
156 安 徽 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2011 年
图 3　石蒜 16个居群 POD同工酶酶谱
图中的字母代表不同的种 ,与表 2所介绍的一致.下同
Fig.3　Peroxidase isozyme zymogram of 16 populat ions of Lycoris radiata
The letters in figure stand for diff erent populat ions as introduced in table-2.The same below
图 4　石蒜 16个居群 POD同工酶酶谱的模式示意图
Fig.4　T he pattern sketch map of POD isozyme zymogram of 16 populat ions of Lycoris radiata
以作为探讨植物种间关系的一个有效手段.
图 5　石蒜属 9种植物的模糊聚类图
Fig.5　The Fuzzy cluster dend rogram of 9 Lycoris species
　　Garua 和 Tsunewaki认为同工酶越多的品系越进化 ,也
就是说同工酶酶谱条带少的种较原始 ,同工酶酶谱条带多的
种分化程度较高 ,是较进化的种[ 18] .同工酶产生是植物进化
的表现 ,属内同工酶较多的种应是较进化的种[ 19] .据他们的
理论 ,石蒜属种间进化顺序应为:S1(香石蒜)、S2(乳白石
蒜)、S7(安徽石蒜)、S3(鹿葱)、S4(长筒石蒜)、S5(忽地笑)、
S6(中国石蒜)、S8(换锦花)、S9(石蒜).
　　但是 ,前人结合形态和核型分析认为香石蒜 、乳白石蒜
和鹿葱均是杂交起源[ 3-5] .史树德等[ 12] 根据 I TS 核酸序列
加合性分析认为乳白石蒜可能起源于中国石蒜和换锦花的杂交 ,香石蒜和鹿葱可能起源于长筒石蒜和换锦
花的杂交.这样 ,上面石蒜属种间进化顺序便存在很大的争论 ,因为杂交种不可能排在亲本前面.香石蒜 、乳
白石蒜和鹿葱均是高度不育的杂交种[ 3] ,出现杂交退化 ,造成同工酶种类减少可能是最好的解释.因而仅仅
从同工酶种类多少的角度来推断物种的进化顺序并不十分科学 ,应该综合细胞学 、分子生物学等各方面的信
息来推断物种的进化关系.石蒜属种间进化关系有待于进一步的研究.
3.2　石蒜 16个居群植物 POD同工酶酶谱分析和种内遗传多样性的探讨
　　对石蒜 16个居群植物 POD同工酶酶谱资料进行分析 ,表明石蒜不同居群的 POD同工酶存在着广泛的
变异 ,共有的特征性酶带可认为是居群相互之间具有共同起源的基因表现 ,能反映系统发育或地理分布上的
同源 ,而不同的酶带显示了各自在特定的生长环境或不同进化历程中已发生了趋异分化 ,这就说明石蒜的遗
传变异程度是较大的 ,石蒜种内存在很高的遗传多样性.石蒜部分居群可以通过种子进行有性繁殖 ,但所有
15734卷第 2期　　　夏齐平 ,余本祺 , 周守标:　基于 POD同工酶对石蒜属种间和石蒜居群间进化关系的研究
居群都可以通过分蘖进行克隆繁殖.由于独立的分蘖的存在能够减少整个基株死亡的可能性 ,因而克隆繁
殖能够阻止居群内遗传多样性的减小;由于基因重组的存在 ,因而有性生殖能够使居群内遗传多样性增
加[ 20] .石蒜通过有性生殖形成的新的基因型可以通过克隆繁殖保存下来 ,从而保证了石蒜种内很高的遗传
多样性.
　　从模糊聚类图(图 6)可以看出石蒜各个居群并没有十分明显的聚为几大类.研究发现石蒜居群间遗传
距离与地理距离不存在相关性.P15(宫崎居群)与 P3(琅琊山居群)聚在一起 ,两者亲缘关系较近 ,遗传距离
小 ,但两居群间地理距离较远 ,说明日本的石蒜居群有可能来自中国安徽.P10(大城乡居群)和 P11(萍乡居
群)、P1(神山居群)和 P4(天堂寨居群)之间也存在相似的情况.说明人为因素比环境因素对石蒜分布的影响
更大.P4(天堂寨居群)、P9(桃花镇居群)、P10(大城乡居群)、P11(萍乡居群)、P14(敬亭山居群)等 5 个居群
具有的酶谱类型相对较多 ,且均没有一种特定的类型占优势.因此 ,我们推测这些地方可能是石蒜过氧化物
酶同工酶变异最丰富的地方.
图 6　石蒜 16个居群模糊聚类图
Fig.6　The Fuzzy cluster dendrogram of 16 populations of Lycoris radiata
　　本次实验每个居群仅取了 10个植株 ,并没有对每个居群内的多个个体进行研究 ,因此无法知道石蒜居
群内遗传多样性水平和遗传结构.居群是生物进化的基本单位 ,对居群内和居群间变异式样 、变异规律的研
究对于揭示物种形成与进化的机制将有很大帮助[ 21] .通过对实验材料进行核型研究 ,发现许多石蒜居群内
存在三倍体植株 ,也首次在几个居群内发现了四倍体植株[ 2] ,这就迫切需要对石蒜居群内遗传多样性进行
更深入研究 ,从而为揭示多倍体石蒜及短小石蒜形成与进化的机制提供分子水平的资料.
参考文献:
[ 1] 　中国科学院植物研究所.中国植物志(第 16卷)[ M] .北京:科学出版社 , 1989:16-17.
[ 2] 　周守标 ,余本祺 ,罗琦 ,等.六个石蒜居群的核型及四倍体石蒜的发现[ J] .植物分类学报 , 2007 , 45(4):513-522.
[ 3] 　徐炳声 , KURITAS ,俞志洲 ,等.石蒜属植物概述[ J] .S IDA , 1994 , 16:301-331.
[ 4] 　秦卫华 ,周守标 ,汪恒英 ,等.石蒜属植物研究进展[ J] .安徽师范大学学报:自然科学版 , 2003 ,(4):385-390.
[ 5] 　刘琰 ,徐炳声.石蒜属的核型研究[ J] .植物分类学报 , 1989 , 27(4):257-264.
[ 6] 　周守标 ,秦卫华 ,余本祺 ,等.安徽产石蒜两个居群的核型研究[ J] .云南植物研究 , 2004 , 26(4):421-426.
[ 7] 　秦卫华 ,余本祺 ,周守标.安徽省九华山野生石蒜居群的核型研究[ J] .安徽师范大学学报 , 2004 ,(4):440-442.
[ 8] 　FURUTAY , NISHIKAWAK , SAGIHARAM.C hromosomalevolutioninthegenus Lycoris[ J] .Herbertia , 1989 , 45:156-162.
[ 9] 　任秀芳 ,周守标 ,郑艳 ,等.中国石蒜属植物花粉形态的研究[ J] .云南植物研究 , 1995 , 17(2):182-186.
[ 10] 　周守标 ,余本祺 ,罗琦 ,等.石蒜属植物花粉形态及分类研究[ J] .园艺学报 , 2005 , 32(5):914-917.
[ 11] 　张露 ,蔡友铭 ,诸葛强 ,等.石蒜属种间亲缘关系 RAPD分析[ J] .遗传学报 , 2002 , 29(10):915-921.
[ 12] 　SHI S D , QIU Y X , LI E X , et al.Phylogenetic relationships and possible hyb rid origin of Lycoris species(Amaryllidaceae)revealed by ITS
sequences[ J] .Biochemical Genetics , 2006 , 44:198-206.
[ 13] 　CHUNG M G.Notes on allozyme variation in Lycoris radiata(Amaryllidaceae)f rom Korea[ J] .Bot Bull Acad S in , 1999 , 40:227-230.
[ 14] 　CHUNG M G.Allozyme diversity in the endangered herb Lycoris sanfuinea var.koreana(Amaryllidaceae)[ J] .Ann Bot Fennici , 1999 , 36:1
-7.
[ 15] 　聂刘旺 ,张定成 ,张海军 ,等.石蒜属植物三种同工酶的研究[ J] .生物学杂志 , 2003, 20(2):27-29.
158 安 徽 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2011 年
[ 16] 　王中仁.植物等位酶分析[ M] .北京:科学出版社 , 1996:82-135.
[ 17] 　袁晓华 ,杨中汉.植物生理生化实验[ M] .北京:高等教育出版社 , 1983:203-233.
[ 18] 　陈存武 ,周守标.大别山区六种黄精属植物的五种同工酶分析[ J] .广西植物 , 2006, 26(4):395-399.
[ 19] 　HUNT ER R L , MARKET C L.Histochemical demonst ration of enzymes separated by ione elect rophoresis in starch gels[ J] .Science , 1957 ,
125:1294-1295.
[ 20] 　COOK R E.Clonal plant populations[ J] .Amer Sci , 1983 , 77:244-253.
[ 21] 　杨继.植物种内变异及机制的研究[ J] .武汉植物研究 , 1991 , 9(2):185-195.
Study on Evolution Relationships of Different Species in Lycoris and Different
Populations in Lycoris radiata Based on POD Isozyme
XIA Qi-ping 1 , 　YU Ben-qi2 , 　ZHOU Shou-biao1
(1.College of Life Sciences , Anhui Normal Universi ty , Wuhu 241000 , China;2.Foreign Languages College , Anhui Polytechnic University , Wuhu
241000 , China)
Abstract:The POD isozyme zymograms of nine Lycoris species and six teen populations of L .radiata were
analy zed and compared in this paper.The results w ere as follows:(1)There were 24 POD isozyme bands
founded in the tested taxa including 12 bands for interspecies and 12 bands for inter-populations , five of w hich
w ere characteristic bands including 3 bands for interspecies and 2 bands fo r inter-populations.(2)According to
POD isozyme zymog ram , the nine species could be divided into two clusters.One cluster consisted of seven
species w ith two-types karyotypes (I-shaped and V-shaped)L .chinensis , L .aurea , L .longi tuba , L .
squamigera , L .anhuiensis , L .incarnata and L .albi f lora , and the other included tw o species w ith
monotypes karyotypes (I-shaped)L .radiata and L .sprengeri .The closest relationship existed betw een L .
chinensis and L .aurea .The results were similar to that of morphological and cy tological study .(3)Relative
rich variance of POD isozyme existed in L .radiata , corresponding w ith the high diversity of chromosome
karyo type and number wi thin this species.Based on POD isozyme , it w as indicated that genetic distance w as not
correlated w ith geog raphical distance among populations of L .radiata .The results showed that analysis of
isozyme variation w as an effect ive method to investig ate the interspecific relationships of Lycoris genus and
genetic diversity of L .radiata .
Key words:Lycoris;Lycoris radiata ;population;perox idase isozyme;interspecific relationship;genetic
diversi ty
15934卷第 2期　　　夏齐平 ,余本祺 , 周守标:　基于 POD同工酶对石蒜属种间和石蒜居群间进化关系的研究