全 文 :[基金项目]新疆名医名方与特色方剂学实验室开放项目(编号:XJDX0910-2010-06) [作者简介]孙芸,女,硕士,讲师,主要从事中药新剂
型、新技术研究,电话:0991-4361850,E-maiL:sunyun330@163.com. [通讯作者]王新军,电话:0991-4362548,E-mail:wxj6283@sina.com
膝痹膏方中当归的提取工艺
孙芸1,2,葛亮1,2,刘俊昌2,周岑2,王新军2 (1.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室,新疆 乌鲁木齐830011;2.新疆
医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐830011)
[摘要] 目的:研究膝痹膏方中当归的最佳提取工艺。方法:采用L9(34)正交试验设计,以当归中阿魏酸的含量为指标,考察
乙醇体积分数、用量及提取时间对提取工艺的影响。结果:当归中阿魏酸最佳提取工艺为:7倍量50%乙醇加热回流提取3
次,每次2.5 h。结论:优选出的最佳提取条件,经验证其结果稳定,方法可行。
[关键词] 膝痹膏方;当归;提取工艺;正交
[中图分类号]R943 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2012)09-0686-03
Study on the best extraction technology of Angelicafrom knee and arthralgia herbal paste
SUN Yun1,2,GE Liang1,2,LIU Jun-chang2,ZHOU Ceng2,WANG Xin-jun2(1.Xinjiang Key Laboratory of Fa-
mous Prescription and Science of Formulas,Xinjiang Urumqi 830011,China;2.SchooL of Traditional Chinese Medicine,Xin-
jiang Medical University,Xinjiang Urumqi,830011,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To study the best extraction technology of Angelicafrom knee and arthralgia herbal paste.METH-
ODS The extraction technique was designed by orthogonal design,the content of ferulic acid was taken as indicators,explo-
ring the influence of factors such as ethanol concentration,ethanol volume,extraction time and so on.RESULTS For extrac-
tion of ferulic acid in Angelica,the optimum conditions were as folows:7 times the amount of 50%ethanol refluxing extract
three times,2.5 h each time.CONCLUSION The repeated experimental results are stable,and the method is feasible.
KEY WORDS:knee and arthralgia herbal paste;Angelica;extraction;orthogonal
膝痹膏方源自《千金翼方·卷十六·诸膏第三》苍
梧道士陈元膏,结合多年临床研究,并添加新疆本地
维吾尔药材,最终形成具有中维医特色的复方制剂。
该方为外用制剂,由当归等6味药组成,具有活血化
瘀,消肿止痛的作用,用于治疗膝痹疼痛。膝痹为新
疆地区的高发病种。方中当归为君药,主要有效成
分为阿魏酸及挥发油。本实验以 HPLC法测定当
归中阿魏酸含量为考察指标,采用正交试验设计,对
膝痹膏方的提取工艺进行优选。
1 材料
1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪包括(LC-6A高
压泵;SPD-20A型紫外检测器;CBM-20A色谱
工作站 (日本岛津公司);XS105型十万分之一电子
天平(梅特勒-托利多公司);Direct-Q3超纯水仪
(美国密理博公司);KX-1型智能恒温电热套(郑州
长城科工贸有限公司)。
1.2 试药 阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定
所,批号110773-201012);甲醇(色谱纯,飞世尔实
验器材有限公司);乙腈(色谱纯,飞世尔实验器材有
限公司);实验用水均为超纯水;磷酸(分析纯,天津市
富宇精细化工有限公司);其余试剂均为分析纯。
当归、黑附片、白芷、细辛、干姜等药材均购自新
疆自治区中医医院,秋水仙药材购自新疆维吾尔医
医院,以上药材经新疆自治区中医医院药学部李永
和主任药师鉴定为正品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonds C18柱(4.6 mm
×150 mm,5μm);流动相:乙腈-0.085%磷酸溶液
(17∶83);检测波长:316 nm;柱温:35℃;流速:1.00
mL·min-1;定量环体积:20μL。此条件下阿魏酸
峰与相邻峰分离度>1.5,理论塔板数按阿魏酸峰计
算不低于5 000。阴性无干扰。
图1 高效液相色谱图
A.阿魏酸对照品;B.样品
Fig 1 HPLC chromatogram
A.ferulic acid;B.sample
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取阿魏酸对照品
·686· 中国医院药学杂志2012年第32卷第9期Chin Hosp Pharm J,2012 May,Vol 32,No.09
DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2012.09.007
2.55 mg,用70%甲醇定容至25 mL量瓶中,得
0.102 mg·mL-1对照品溶液,摇匀即得,备用。
2.2.2 样品溶液 按处方比例称取当归、黑附片、
秋水仙、白芷、细辛、干姜等6味药材,捣碎,加70%
乙醇回流提取2次,合并提取液,回收乙醇,定容至
250 mL量瓶中。精密量取2 mL,过滤,即得样品溶
液,备用。
2.3 方法学考察[1-2]
2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下阿魏
酸对照品溶液50,100,200,400,600,1 000μL,分
别至10 mL量瓶中,70%甲醇定容,摇匀。以“2.1”
项下条件测定。以浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为
纵 坐 标,绘 制 标 准 曲 线,得 回 归 方 程 Y =
144 580 287 X+41 655.63(R2=0.999 9)。结果
表明,阿魏酸在0.51~10.2μg·mL
-1范围内与峰面
积呈良好的线性关系。
2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品
溶液,重复进样5次,根据峰面积积分值计算RSD
为0.28%(n=5)。结果表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 精密吸取“2.2.2”项下制备的
样品溶液,按“2.1”项下的方法分别于0,2,4,6,8,
10 h进样,测定峰面积积分值计算RSD为0.81%(n
=6)。结果表明样品溶液在10 h内稳定。
2.3.4 重复性试验 按“2.2.2”项下方法制备6份
样品溶液,按“2.1”项下的方法测定,计算含量,结果
表明方法重复性良好,RSD为0.98%(n=6)。
2.3.5 回收率试验 精密吸取按“2.2.2”项下方法
制备、已知含量的样品6份,每样吸取5 mL,分别精
密加入阿魏酸对照品溶液1 mL,按照“2.1”项下方
法测定含量,同时计算回收率。结果测得的阿魏酸
平均回收率为100.72%,RSD为1.76%(n=6)。
表1 回收率试验结果(n=6)
Tab 1 Results of recovery experiment(n=6)
编号
取样量
/mL
样品中阿魏
酸量/mg
添加阿魏
酸量/mg
实测阿魏
酸量/mg
回收率
/%
平均回
收率/%
RSD
/%
1 5 0.126 1 0.102 0 0.227 3 99.22
2 5 0.125 0 0.102 0 0.228 1 101.08
3 5 0.119 8 0.102 0 0.224 4 102.55
100.72 1.764 5 0.123 5 0.102 0 0.223 8 98.33
5 5 0.126 7 0.102 0 0.231 5 102.75
6 5 0.125 5 0.102 0 0.227 9 100.39
2.4 当归最佳提取工艺的确定
2.4.1 提取方法的筛选
(1)乙醇回流法:称取处方量药材1份,5倍量
70%乙醇回流2次,每次1.5 h,合并提取液,减压浓
缩至250 mL,备用[3]。
(2)水提法:称取处方量药材1份,加水煎煮3
次(一煎加6倍量水,煎煮90 min;二煎加4倍量水,
煎煮60 min;三煎加4倍量水,煎煮30 min),合并
提取液,减压浓缩至250 mL,备用[4]。
(3)超声波辅助萃取法:称取处方量药材1份,
于锥形瓶中,加12倍量60% 的乙醇溶液,放入超声
萃取槽中,上接冷凝管.调节水浴温度80℃,超声功
率225 W,提取2次,每次60 min,合并提取液,减
压浓缩至250 mL,备用[5]。
分别精密吸取上述溶液,按“2.1”项下的方法测
定,计算含量。结果,乙醇回流法、水提法和超声波
辅助萃取法提取测定的阿魏酸含量分别为6.539 4,
3.376 0,1.927 1 mg。故选择乙醇回流法进行正交
试验。
2.4.2 正交试验设计[6] 以阿魏酸含量为考察指
标,采用L9(34)正交表安排试验,结果见表2和表
3。提取次数为3次。
表2 正交试验因素水平表(n=3)
Tab 2 Factors of orthogonal experiment(n=3)
水平
因素
A乙醇体积分数/% B溶剂用量/倍 C提取时间/h
1 30 5 1.5
2 50 7 2.0
3 70 9 2.5
表3 正交试验因素水平表
Tab 3 Results of orthogonal experiment
实验号
因素
A B C D
阿魏酸含
量/mg·g-1
1 1.000 0 1.000 0 1.000 0 1.000 0 6.087 0
2 1.000 0 2.000 0 2.000 0 2.000 0 7.636 0
3 1.000 0 3.000 0 3.000 0 3.000 0 8.167 0
4 2.000 0 1.000 0 2.000 0 3.000 0 10.848 0
5 2.000 0 2.000 0 3.000 0 1.000 0 12.463 0
6 2.000 0 3.000 0 1.000 0 2.000 0 11.901 0
7 3.000 0 1.000 0 3.000 0 2.000 0 7.791 0
8 3.000 0 2.000 0 1.000 0 3.000 0 7.829 0
9 3.000 0 3.000 0 2.000 0 1.000 0 8.069 0
K1 21.890 0 24.726 0 25.817 0 26.619 0
K2 35.212 0 27.928 0 26.553 0 27.328 0
K3 23.689 0 28.137 0 28.421 0 26.844 0
R 13.322 0 3.411 0 2.604 0 0.709 0
SS 34.832 4 2.436 8 1.201 3 0.087 5
SS f S F P
A 34.832 4 2.000 0 17.416 2 398.053 3 P<0.01
B 2.436 8 2.000 0 1.218 4 27.847 2 P<0.05
C 1.201 3 2.0000 0.600 7 13.728 4
D 0.087 5 2.0000 0.043 8 1.0000
注:F1,0.05(2,2)=19.00
由正交表试验结果和方差分析表明,因素A(乙
醇体积分数)和因素B(溶剂用量)对当归中阿魏酸的
提取有显著影响;而因素C(提取时间)对当归中阿魏
酸的提取无显著影响。由极差R得出影响因素大小
顺序为A>B>C,即乙醇体积分数>溶剂倍量>提
取时间。由此得出阿魏酸最佳提取工艺为A2B3C3,
即50%乙醇,加9倍量水提取2.5 h,提取3次。
2.4.3 验证试验 按照理论最佳提取工艺A2B3C3
·786·中国医院药学杂志2012年第32卷第9期Chin Hosp Pharm J,2012 May,Vol 32,No.09
进行验证试验。结果阿魏酸提取平均为(0.187 9±
0.011 51)mg·g-1。
3 讨论
实验前按照2010年版中国药典相关标准[7],用
规定方法提取所购药材当归中阿魏酸,并进行含量
测定,得出结果表明,所购得当归中阿魏酸含量
>0.050%,符合药典标准。最初试验对处方中六味
药进行乙醇回流提取时,未将药材粉碎,阿魏酸的提
取率较低。后改进试验方法,提取时将药材用冲钵
粉碎,对比结果,测出阿魏酸提取率有明显增高。但
若粉碎过细,样品提取液较难过滤,故粉碎粒度应适
当。
参考文献:
[1] 陈超超,王艳,梁超.高效液相色谱法测定当归中阿魏酸的含量
[J].成都大学学报(自然科学版),2008,27(4):284-286.
[2] 唐力英,王祝举,赫炎,等.高效液相色谱法测定当归中阿魏酸
的含量[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(2):14-15.
[3] 易延逵,陈志良.当归提取成分种类与提取工艺相关性的探究
[J].山西医科大学学报,2010,41(4):335-338.
[4] 刘洪涛,韦友国,闫光军.当归水提液制备方法的研究[J].齐鲁
药事,2005,26(6):370-380.
[5] 金汝城,李贵文,马素丽,等.当归中阿魏酸提取工艺的优化研
究[J].中成药,2008,30(4):516-519.
[6] 吴清,李云谷,杜守颖,等.当归、川芎提取工艺研究[J].中国实
验方剂学杂志,1999,5(6):17-18.
[7] 中国药典.二部[S].2010:124-125.
[收稿日期]2011-07-11
[作者简介]李玉山,男,硕士,工程师,电话:13700229536,E-mail:liyushan0508@sina.com
石杉碱甲的分离纯化工艺
李玉山 (西安惠丰生化集团股份有限公司,陕西 西安710075)
[摘要] 目的:研究一种石杉碱甲的工业化分离纯化工艺,以达到批量生产之目的。方法:通过对石杉碱甲理化性质的分析,
以中性氧化铝为填料对石杉碱甲粗品进行柱色谱分离纯化,采用薄层色谱-柱色谱考察了各因素的影响,以石杉碱甲回收率和
含量为考察指标,寻找最佳工艺参数。结果:柱色谱最佳分离条件为:洗脱剂体系为氯仿-甲醇(v/v)=100∶5,100∶10,流速为3
mL·min-1,柱床体积比为25∶1,进料量为10 mL,柱温为室温,在此条件下石杉碱甲回收率达97.6%,含量达99.2%。结论:
该工艺条件能够在简单的条件下实现石杉碱甲批量分离纯化,具有工业应用价值。
[关键词] 石杉碱甲;薄层色谱;氧化铝;柱色谱;纯化
[中图分类号]R285 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2012)09-0688-04
Study on the separation and purification technics of huperzine A
LI Yu-shan(Xi'an Huifeng Biochemistry Group,Share Co.,LTD,Shanxi Xi'an,710075,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To study the separation and purification process of huperzine A for industrialization,and to achieve
mass production purposes.METHODS Through analysis of the physical and chemical properties of huperzine A,a neutral a-
lumina was found as filer for purification of huperzine A crude product by column chromatography;thin-layer chromatography-
column chromatogram was adopted for study of the impact of various factors;the content and recovery of huperzine A were
taken as the indexes to find the best process parameters.RESULTS The best separation conditions for column chromatogra-
phy:eluent system chloroform:methanol(v/v)=100∶5,100∶10,flow rate 3 mL·min-1,column bed volume ratio of 25∶1,
feed volume of 10 mL,the column temperature was at room temperature,in this condition huperzine A recovery rate was
97.6%,content concentration of 99.2%.CONCLUSION The process conditions in the most simple conditions can achieve hu-
perzine A batch purified with strong industrial applications.
KEY WORDS:huperzineA;thin layer chromatography;aluminum oxide;column chromatography;purification
石杉碱甲属胆碱酯酶抑制剂,是用于预防老年
痴呆的天然药物[1]。石杉碱甲提取自中国民间草药
蛇花石杉(又名千层塔),具有多种药理作用,如调节
Aβ前体蛋白的代谢、抗氧化、减弱谷氨酸介导的兴
奋性细胞毒性、对神经生长因子信号的调节、抗神经
细胞凋亡等[2]。石杉碱甲用于治疗阿尔茨海默病患
者具有一定疗效[3],石杉碱甲能改善轻度认知功能
障碍患者的认知功能[4]。石杉碱甲能很好地改善老
年痴呆的认知功能、行为,对其日常生活能力的恢复
具有积极作用[5]。石杉碱甲用于治疗重症肌无力取
·886· 中国医院药学杂志2012年第32卷第9期Chin Hosp Pharm J,2012 May,Vol 32,No.09