全 文 ：收稿日期:2012 － 08 － 15 修回日期:2012 － 12 － 25
基金项目:2012 年漳州市自然科学基金项目“中国水仙叶色突变体的生理生化及 IRAP、REMAP分子标记技术研究”(ZZ2012J11)．
作者简介:林晓红(1964 －) ，女，硕士，副教授，福建农林大学园艺学院高级访问学者． 研究方向:观赏植物栽培与分子生物学． Email:
18965203718@ 163． com．通讯作者潘东明(1956 －) ，男，教授，博士生导师．研究方向:园艺产品采后贮运保鲜． Email:pdm666@ 126． com．
中国水仙自然变异体的 IRAP分析
林晓红1，2，3，潘东明2，3
( 1．福建漳州城市职业学院，福建 漳州 363000; 2．福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002;
3．福建农林大学园艺产品贮藏保鲜研究所，福建 福州 350002)
摘要:以漳州水仙花主产区主栽品种“金盏”和“玉玲珑”为参照，利用 IRAP标记技术对花变异体“金三角”及叶色变异体
“金边水仙”进行变异分析． 4 对 IRAP引物共获得 177 个位点，有 123 个多态性位点，4 份中国水仙种质资源间的相似系数
介于 0．946 － 0．657 之间．研究结果表明，变异体“金三角”和“金边水仙”与主栽品种“金盏”和“玉玲珑”的区别明显，转座
插入和逆转座子间重组可能是引起中国水仙变异的重要机制之一．
关键词:中国水仙;变异体;IRAP;分子标记
中图分类号:S682．2 + 1 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2013)03-0242-04
Natural variants identification based on IRAP analysis in Narcissus tazetta var． chinensis
LIN Xiao-hong1，2，3，PAN Dong-ming2，3
(1． Zhangzhou City University，Zhangzhou，Fujian 363000，China;2． College of Horticulture，Fujian Agriculture and
Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;3． Institute of Storage Science and Technology of
Horticultural Products，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:With“Jinzhan”and“Yulinglong”，the dominant varieties of narcissus in the main growing area in Zhangzhou as the con-
trol，the IRAP marker technology was used to conduct the variation analysis on“Jinsanjiao”(the flower variant)and“Jinbian”
(the leaf color variant)． 177 sites and 123 polymorphic loci were obtained from 4 IRAP primers． The coefficients of similarity a-
mong 4 Chinese narcissus germplasm resources were between 0．946 and 0．657． It has been proved that the narcissus variants“Jin-
sanjiao”and“Jinbian”were significantly different from the dominant varieties“Jinzhan”and“Yulinglong”，the transposon inser-
ting and retrotransposon recombination was an important mechanism which caused the variation of Chinese narcissus．
Key words:Narcissus tazetta var． chinensis;variant;IRAP;molecular marker
IRAP(inter-retrotransposon amplified polymorphism，反转录转座子位点间扩增多态性)是由 Kalendar et
al［1］创建的一种基于植物反转录转座子的分子标记．反转录转座子是真核生物中数量最丰富、分布最广的
遗传元件，以多拷贝形式广泛分布在生物基因组中，并在物种间或物种内表现出丰富的多态性［2 － 3］． IRAP
分子标记具有灵敏度高、多态性丰富及基因组覆盖度广等特点，IRAP技术可广泛用于植物基因组分析、遗
传图谱构建、基因分离测序、杂交育种等研究，尤其适用于种质鉴定［4］．近年来，IRAP分子标记技术已在谷
类作物［5 － 6］、香菇［7］、柿属［8］、苹果［9 － 10］、烤烟［11］、茄子［12］、百合［13］等植物的品种鉴定上取得较好应用．但
该技术对中国水仙的研究仍属空白．
中国水仙(Narcissus tazetta var． chinensis)属三倍体，高度不孕，无法以常规的杂交育种获得新品种;此
外中国水仙具较高的遗传稳定性，在近千年的栽培历史中，极少有变异品种出现．本研究以漳州水仙花主
产区的变异体“金三角”及叶色变异体“金边水仙”为供试材料，利用 IRAP标记技术进行变异鉴定，比较它
们与该产区的主栽品种“金盏”和“玉玲珑”的亲缘关系，在 DNA 分子水平上探讨漳州中国水仙品种(品
系)的遗传变异，为中国水仙新品种(品系或株系)的鉴定，以及进一步阐明中国水仙变异机理奠定基础，
同时也为中国水仙反转录转座子的研究提供依据．
福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷 第 3 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2013 年 5 月
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2013.03.015
1 材料与方法
1．1 材料
以漳州水仙花主产区的主栽品种“金盏”与“玉玲珑”，花变异体“金三角”，叶色变异体“金边水仙”等
4 个样品为供试材料(表 1)．材料采自漳州市水仙文化艺术研究院的种植基地．每份材料随机取 20 个单
株幼嫩叶片混合，存放于 －80 ℃备用．试验于 2012年 6月在福建农林大学园艺产品贮运保鲜研究所进行．
表 1 材料的基本信息
Table 1 Major information of materials
编号 名称 性状描述 原产地
1 金边水仙 多花水仙，花单瓣，叶缘出现金边 福建漳州
2 金盏 多花水仙，花单瓣，花被白色，副花冠黄色 福建漳州
3 金三角 多花水仙，花单瓣，花被白色，黄色副花冠下合上 3 裂 福建漳州
4 玉玲珑 多花水仙，花重瓣，黄白相间，雄蕊花瓣状 福建漳州
1．2 方法
1．2．1 DNA提取与检测 取供试水仙花的幼嫩叶片，采用改良 CTAB 法提取叶片总 DNA［12］．使用 1%琼
脂糖凝胶电泳检测其完整性;使用 UV-1810 型紫外 /可见分光光度计测定 D260 nm和 D280 nm，检测提取的
DNA质量．提取的 DNA置于 4 ℃保存．
1．2．2 IRAP设计与合成 IRAP引物序列参考 Kalendar et al［1］的方法，根据得到的反转录转座子 LTRs序
列，运用 PRIMER 5．0 软件设计 IRAP正反向引物，在预试验基础上设计了 6 对引物(引物代号为 IRAP 3、
IRAP 4、IRAP 6、IRAP 8、IRAP 9、IRAP11) ，由上海博尚生物有限公司合成．
1．2．3 IRAP-PCR扩增反应体系 20 μL反应体系中采用模板 DNA40 ng、dNTPs 0．4 mmol·L －1、引物 0．2
μmol·L －1、Taq酶 1 U和 10 × Buffer(含 Mg2 +)2 μL．
PCR反应在 Biometra T-gradient PCR仪上进行，IRAP-PCR扩增程序:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 40
s，退火(根据不用引物 Tm值设定温度，表 2)40s，72 ℃延伸 2 min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min;最后置 4
℃保存．
PCR产物用 1．5%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，凝胶成像系统成像．
1．3 自然变异体的数据分析
以清晰可见且可重复为标准，对于同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为 1 个位点，有条带记
为“1”，无条带记为“0”，所得数据输入 Excel软件，建立原始表征数据矩阵．任一位点若有 1 个或 1 个以上
个体不同于其他个体即为 1 个多态位点． 遗传相似系数(genetic similarity，GS)按公式 GS = 2NXY /(NX +
NY)进行计算．其中，NX 和 NY 为种质 X和 Y的扩增片段，NXY为该两种质间共有的片段数．利用 SPSS 13．0
软件构建所有种质基于 ISSR数据的 UPGMA树状图．
2 结果与分析
图 1 基因组 DNA的 1%琼脂糖凝胶电泳检测
Fig． 1 The 1% agarose gel electrophoresis detection of genome DNA
2．1 DNA提取与检测
采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测水仙基因组 DNA
的纯度．
4 个中国水仙品种(品系)基因组 DNA 的电泳条
带均匀、清晰，无拖尾现象，说明所提取的 DNA 无
RNA污染，纯度较高，可用于 IRAP分析(图 1)．
D260 nm /D280 nm值为 1． 75 － 1． 90，说明得到的 DNA
质量较高，可满足 IRAP分析的要求，将各材料的 DNA
浓度稀释至 20 ng·μL －1，置 － 20 ℃保存备用．
2．2 中国水仙 IRAP扩增结果
利用 6 对 IRAP引物对 4 个中国水仙品种(品系)
·342·第 3 期 林晓红等:中国水仙自然变异体的 IRAP分析
表 2 IRAP引物扩增信息
Table 2 Summary of PCR amplification corresponding
to individual primer in IRAP analysis
引物
Tm值
℃
总扩增数
条
多态性条
带数 /条
多态性比例
%
IRAP 3 55 9 0 0
IRAP 4 53 22 12 54．5
IRAP 6 49 17 12 70．6
IRAP 8 51 7 0 0
IRAP 9 47 14 6 42．9
IRAP 11 52 21 10 47．6
进行 PCR扩增．其中，4 对引物适宜． 4 对 IRAP引
物逐个对 4 个水仙花种质的基因组 DNA 进行
PCR扩增，共获得 177 个位点，有 123 个多态性位
点，多态性 69．49%(表 2)．
4 对引物共扩增出 74 条清晰可辨的条带，
DNA片段为 200 － 2500 bp． 引物 IRAP 4 扩增的
DNA片段为 200 － 2500 bp，引物 IRAP 6 扩增的
DNA片段为 500 － 1900 bp，引物 IRAP 9 扩增的
DNA片段为 200 － 2000 bp，引物 IRAP 11 扩增的
DNA片段为 300 － 2500 bp;平均每对引物扩增出 18．5 条，其中 40 条带具有多态性，多态性条带占 54．1%，
表明供试材料的 IRAP多态性较丰富．在 4 对引物中，引物 IRAP 4 扩增的条带最多(22 条) ，引物 IRAP 9
扩增的条带最少(14 条)．引物 IRAP 6 多态性条带最高(70．6%)．
箭头表示特异条带．
图 2 4 对引物在中国水仙中的扩增结果
Fig． 2 IRAP profiles of 4 different retrotransposon primers in Chinese narcissus
采用 IRAP 4 扩增时，“金盏”在约 470 bp
处缺失 1 条带，“金边”在约 1300 bp 处缺失 1
条带;采用 IRAP 6 扩增时，“金边”在约 800、
1900 bp处各缺失 1 条特异谱带，“玉玲珑”在
约 700 bp处缺失 1 条带;采用 IRAP9 扩增时，
“金盏”在约 1400bp 处扩增出 1 条特异谱带，
“金边”在约 8000 bp处扩增出 1 条特异谱带;
采用 IRAP 11 扩增时，“金三角”在约 600 bp
处扩增出 1 条特异谱带，“金边”在约 8000 bp
处扩增出 1 条特异谱带(图 2，表 3)． 说明
IRAP可以较好地鉴别中国水仙变异体．
表 3 用于鉴别 4 份中国水仙的有效 IRAP标记1)
Table 3 Useful IRAP markers for the identification of 4 Chinese narcissus
样品
扩增出特征谱带
IRAP 4 IRAP 6 IRAP 9 IRAP 11
缺失的特征谱带
IRAP 4 IRAP 6 IRAP 9 IRAP 11
金边 Y N N N N
金盏 Y Y N
金三角 Y Y
玉玲珑 N N N N
1)N表示缺失特征条带，Y表示扩增出特异条带．
图 3 中国水仙种质的 UPGMA树状图
Fig． 3 UPGMA cluster analysis of Chinese narcissus
2．3 遗传距离与聚类分析
利用 SPSS 13．0 软件对中国水仙自然
变异体种质基于 ISSR 数据进行聚类分析
(图 3)． 4 份中国水仙种质资源间的相似
系数在 0．946 － 0．657 之间;在相似系数 0．
68 处可以把 4 个水仙种质区分为两个类
群，其中“金边”单独分为一类;“金盏”和
“金三角”的相似系数最高，为 0．946，这两
者特别接近是因为“金三角”是“金盏”的
花变异体;而“金边”与其他 3 个品种的相似系数最低，为 0．657，可能因为“金边”的叶色和其他 3 个品种
的叶色不一样引起的． 4 份中国水仙种质的 ISSR标记分析结果与形态学观察及传统分类结果基本一致．
·442· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
3 讨论与结论
逆转座子变异可能是植物变异的机制之一，IRAP标记性极高，是进行栽培种内遗传多样性分析时非
常有利用价值的一种标记［1］．许明辉等［14］用 235 个随机引物对 23 个烤烟和晒晾烟品种进行了 RAPD 分
析，25 个引物(占 10．64%)可以扩增出多态性带，平均每条引物扩增的多态性带为 2．9 条．常爱霞等［15］对
2 个烤烟品种进行多态性标记分析，从 500 个 RAPD引物中仅筛选到 4 个具多态性的引物．赵福宽等［13］对
32 个百合品种进行 IRAP扩增，共扩增出 163 条多态性带，每个品种的扩增位点数介于 0 － 8 之间，可将供
试百合品种完全区分开． Smykal［16］利用 Ty3-gypsy类型反转录转座子设计的引物对 33 个豌豆栽培品种扩
增，包括亲缘关系很近的品种，都获得到独特的谱带．
本项目研究基于不同逆转座子 LTRs设计的引物，在其中不仅扩增出丰富的条带，且表现出多态性，
但多态性水平不同．研究结果表明，开发的 IRAP 技术适合于中国水仙无性系的鉴定，同时也说明这些逆
转座子在中国水仙基因组内分布广，拷贝数高．
本研究结果也表明逆转座子可能参与了中国水仙变异系的形成，而不同试材间的相似系数的差异，可
能反映基因组变异的部分细节．
由于已发现的中国水仙的变异体(品种、品系)很少，本试验供试样本数也受到限制，因此，尚无法比
较花和叶的变异相似系数高低及进行可能原因分析．此外，“金边”叶变异可能与叶片中叶绿体结构和叶
绿素含量的改变有关，即与叶绿体的遗传物质的改变有关，而叶绿体受细胞核基因和质体基因(ctDNA)的
双重遗传控制．因此，花和叶的变异机率也应不同，其机理、机制值得今后进一步研究．
在中国水仙变异系中，不仅有 IRAP的特征谱带产生，也有特征谱带的缺失．这是因为除转座插入外，
逆转座子特有的转座方式使其成为了重组热点．本研究表明，转座插入和逆转座子间重组是引起中国水仙
变异的重要机制之一，本试验所开发的引物是进行中国水仙变异系研究的有力工具，为进一步阐明中国水
仙变异系的变异机理奠定基础．
参考文献
［1］KALENDAR R，Greb T，Regina M，et al． IRAP and REMAP:two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques
［J］． Theor Appl Genet，1999，98(5) :704 － 711．
［2］KUMAR A，BENNETZEN J． Plant retrotransposons［J］． Annu Rev Genct． 1999，33(1) :479 － 532．
［3］FEDOROFF N． Transposons and genome evolution in plants［J］． ProcNral Acad Sci USA，2000，97(13) :7002 － 7007．
［4］BRETO M P，RUIZ C，PINA J A． The diversication of Citrus clementina Hort Ex Tan．，a vegetatively propagated crop species
［J］． Mol Phylog and Evol，2001，21(2) :285 － 293．
［5］马秀芳，高勇，华泽田，等．水稻逆转座子的研究现状［J］．分子植物育种，2003(4) :515 － 521．
［6］邢少辰，王文明，朱立煌．在水稻突变体中分离逆转座子初报［J］．河北农业大学学报，2003(4) :75 － 79．
［7］肖扬，李黎，刘伟，等．香菇反转录转座子间扩增多态性(IRAP)PCR 反应体系的研究［J］．中国农学通报，2009，25(7) :
47 － 51．
［8］杜晓云，罗正荣．部分柿属植物 IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建［J］．农业生物技术学报，2006(6) :931 － 936．
［9］孙俊，房经贵，高兵，等．苹果中 Ty1-copia型逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析［J］．果树学报，2005(3) :．
［10］孙俊，周军永，孙其宝，等．苹果元帅系和富士系芽变品种的 IRAP鉴定［J］．西北植物学报，2010(10) :1952 － 1958．
［11］肖炳光，杨本超．利用 IRAP标记分析烤烟品种间遗传差异［J］．西北植物学报，2006，26(6) :1119 － 1124．
［12］赵海艳，赵纯，杨爱珍，等． IRA分子标记在茄子种质资源亲缘关系分析中的应用［J］．华北农学报，2008，23(10) :194
－ 197．
［13］赵福宽，张建京，夏婧，等．百合品种 IRAP指纹图谱构建［J］．中国园艺文摘，2010(12) :5 － 7．
［14］许明辉，郑民慧，刘广田．烟草品种 RAPD分子标记遗传差异研究［J］．农业生物技术学报，1998，6(3) :282 － 284．
［15］常爱霞，瞿永生，贾兴华．烟草 RAPD反应体系优化及品种多态性标记研究［J］．中国烟草科学，2004(2) :9 － 13．
［16］SMYKAL P． Development of an efficient retrotransposon-based fingerprinting method for rapid pea variety identification［J］．
Appl． Genetic，2006，47(3) :221 － 230．
( 责任编辑: 吴显达)
·542·第 3 期 林晓红等:中国水仙自然变异体的 IRAP分析