全 文 ：　文章编号:0559-7234(2000)03-0338-06
獐毛愈伤组织耐盐性研究及
耐盐变异体的筛选
岳　玮1　夏光敏1　陈惠民1　冯素萍2
(1.山东大学生命科学学院发育研究所 ,山东济南 250100;
2.山东大学 实验中心 ,山东　济南 250100)
摘要:獐毛(Aeluropus l it toralis var.sinensis)匍匐茎茎尖来源的原始型愈伤组
织 ,测定其耐盐范围为 0.3%～ 1.5%.盐胁迫下 ,脯氨酸及 K+、Na+、Ca2+离子
在渗透调节中起重要作用.用直接筛选的方法 ,将原始型愈伤组织放在含 2%
NaCl的选择培养基上连续筛选 ,获得耐盐性进一步提高的愈伤组织耐盐变异
体 ,在选择培养基上 ,变异型愈伤组织鲜重相对生长率显著大于原始型愈伤组
织 ,在变异型愈伤组织耐盐性提高中 ,脯氨酸及无机离子 K+、N a+ 、Ca2+起重要
作用.耐 2%NaCl的变异型愈伤组织在无 NaCl培养基中培养 11代后 ,仍能耐
受 2%NaCl ,愈伤组织的耐盐性没有退化 ,说明筛选得到的耐盐变异体不是生理
适应性的而是由遗传变异而来的.
关键词:獐毛;组织培养;耐盐性变异体
中图分类号:Q946　　　文献标识码:A
植物离体细胞存在自发的染色体变异 ,因此许多研究工作者认为用细胞或组织培养
方法 ,可以获得丰富的遗传变异.[ 1]把愈伤组织转在加有高浓度盐分的培养基上培养 ,有
可能筛选出耐盐的细胞系.近 20多年来 ,这种方法受到了众多学者的重视 ,并取得了一定
的进展.但是抗性变异体的愈伤组织经过长期选择后即不易产生再生植株 ,这对禾本科植
物来说尤为困难 ,目前仅有有限的几种植物如玉米 ,水稻 ,狼尾草野生种 ,甘蔗等耐盐愈伤
组织再生植株成功.[ 3 , 6]对于耐盐筛选而得到的遗传变异愈伤组织 ,他们虽难以再生植
株 ,但如能通过体细胞杂交将其高耐盐性转移到其他非耐盐植株中 ,则可对抗盐材料扩大
其利用及其抗性的转移大为有利 ,是一值得探索的途径.
獐毛是一种能在1%全盐量土壤中正常生长的盐生植物 ,其整株水平的耐盐性研究
收稿日期:1998-12-20
基金项目:国家自然科学基金项目(39570465)
作者简介:岳玮(1974-),女 ,在读博士 ,从事发育生物学研究.
第 35 卷　第 3 期
Vol.35　No.3 　　　　　　
山　东　大　学　学　报(自然科学版)
JO URNAL OF SHANDONG UNIVERS ITY
　　　　　2000 年 9 月
Sept.2000
已有报道 , [ 7]但细胞水平上 ,愈伤组织的耐盐性及耐盐的筛选尚未见报道.本文从獐毛诱
导产生愈伤组织 ,用 N aCl筛选出耐盐愈伤组织变异体.我们期望以后通过此高耐盐的獐
毛愈伤组织与普通小麦体细胞杂交 ,将其耐盐性状转移到普通小麦中.
1　材料与方法
1.1　獐毛愈伤组织的诱导
以野生獐毛(Aeluropus l it toral is var.sinensis ,采自山东省滨州地区)的匍匐茎茎
尖 、子房 、胚珠 、幼胚及成熟颖果 、花药为外植体 ,在 MB培养基[ 8]的基础上添加不同浓度
及配比的 2 ,4-D 、IAA 、KT 及蔗糖 ,诱导愈伤组织 ,经半年的继代与筛选 ,挑取黄白色细小
颗粒状愈伤组织进行耐盐变异体的筛选 ,愈伤组织颗粒大小约为 0.5 ～ 1.0 mm .
1.2　原始型獐毛愈伤组织的耐盐性测定
将獐毛愈伤组织接种在含 NaCl 0.3%、0.5%、0.7%、1%、2%的 MS+2 mg/L , 2 , 4-
D培养基上 ,以不含 NaCl培养基中的愈伤组织为对照 ,每组设 3 个重复 ,每 17d 继代 1
次 ,第 12d 测定愈伤组织脯胺酸含量 、K +、Na+、Ca2+离子含量 ,第 17d测定鲜干重 ,计算
鲜重的相对生长率 R 及鲜干重比(W F∶W D)
1.3　獐毛耐盐变异体的筛选及耐盐性鉴定
采用直接筛选的方法 ,直接将原始型愈伤组织移入含选择浓度 N aCl及 2 mg/L 2 , 4-
D的 MS 培养基中 ,每 17d继代 1次 ,每次继代时挑选生长正常的颗粒状愈伤组织分为小
于 2 mm 的体积进行下一轮筛选.连续筛选 4代 ,获得耐盐变异愈伤组织.该愈伤组织于
无 NaCl的培养基中培养 11代后 ,再次转入含不同含量的 N aCl的培养基中 ,比较不同含
量的 NaCl对原始型愈伤组织和变异型愈伤组织鲜重的相对生长率 、鲜干重比 、脯氨酸及
K+ 、Na+、Ca2+含量(质量分数)的影响 ,鉴定其耐盐性.
愈伤组织鲜重的相对生长率 R 按R =3×(W 1/32 —W 1/31 )/(T 2 — T 1)计算.[ 9] W 2 为
生长 17d后的鲜重 , W 1为接种量 , T 2 — T 1=17d.脯胺酸含量的测定方法参考文献[ 10] .
K+ 、Na+、Ca2+用 Variant-TecktronAAb 型原子吸收分光光度计测定 ,样品用浓硝酸消
化.
2　结果与讨论
2.1　獐毛不同来源外植体的培养及愈伤组织的诱导
不同来源的獐毛外植体在含 1 mg/L 和 2 mg/L 2 ,4-D的 MB 培养基上只有匍匐茎
茎尖能成活且诱导出愈伤组织 ,诱导成功率为 98%,经半年的继代与挑选 ,得到黄白色细
小颗粒(1 mm 左右)组成的愈伤组织.在分化培养基(MB+0.5 IAA +0.5 ZT)上无分化
能力.而其他来源于生殖器官的外植体均未能增殖.将来源于生殖器官的外植体在 MB
培养基基础上不加任何激素及改变 2 , 4-D 浓度 0 ～ 2 mg/L ,K T 0 ～ 0.5 mg/L , IAA 0 ～
0.5 mg/L 及蔗糖浓度 3%～ 6%均未诱导出愈伤组织.由此可见獐毛成熟种子 、幼胚的培
养及胚性愈伤组织的诱导难以成功 ,这说明獐毛不同来源外植体的脱分化能力有着显著
339第 3 期　　　　　　岳　玮等:獐毛愈伤组织耐盐性研究及耐盐变异体的筛选　　　
的不同 ,自然生长条件下 ,獐毛的繁殖主要靠匍匐茎 ,茎尖的分生能力较强 ,而其种子小 ,
成熟种子仅 0.5 mm ×1.0 mm 大小 ,且结实率低 ,生活力弱 ,这可能是未能诱导脱分化进
行细胞分裂的原因.
2.2　獐毛原始型愈伤组织的耐盐性
獐毛原始型愈伤组织在 0.3%～ 2%NaCl培养基中 ,随 NaCl含量的增加 ,愈伤组织
鲜重的相对生长率逐渐下降 ,为对照 0.82 ～ 0.22倍 , W F∶WD 也逐渐下降(图 1),为对照
的 0.83 ～ 0.59.0.3%～ 1.3%的 NaCl中愈伤组织生长较为旺盛 ,未有变褐死亡现象出
现 ,相对生长率为对照的 0.82 ～ 0.40;1.5%NaCl培养基中 ,愈伤组织生长变慢 ,相对生
长率为对照的 0.40 ～ 0.37 ,个别愈伤组织团中有变褐死亡的细胞;2%的 NaCl浓度下 ,愈
伤组织的相对生长率为对照的 0.22 ,且 17d 后 50%愈伤组织局部出现变褐死亡 , 30%虽
有明显生长但较对照生长缓慢 ,其余 20%无明显生长 ,该浓度下 ,愈伤组织的生长与对照
差异极显著.因此 2%的 NaCl可作为耐盐变异体筛选的选择含量 ,选取该含量下有明显
生长的愈伤组织进行耐盐筛选.
图 1　原始型愈伤组织在不同 NaC l含量下的鲜干重比
Fig.1　Fresh w eig ht to dry w eigh t ration (WF/ W D)
of original type calli in various NaC l concent ration
图 2　原始型愈伤组织在不同 NaC l含量下的
脯氨酸含量(质量分数)
Fig .2　Proline con tent of original type cal li
in various NaC l concent ration
　　在含 NaCl培养基中 ,脯氨酸含量较对照均有所增长 ,但增长的幅度不同.在 0.3%～
0.7%的 NaCl含量下 ,脯氨酸增长的幅度较小 ,且各含量间相差不大;在 1%NaCl含量
下 ,脯氨酸含量有大幅度的增加 ,为对照的 12倍 ,并达到各处理中的最大值;超过 1%N a-
Cl含量 ,脯氨酸含量下降 , 2%含量下仅为对照的 2.6倍(图 2).
随 NaCl含量的增加 ,愈伤组织中 Na+含量以较大速度上升 , K+则平稳下降 ,含量较
少的Ca2+作少量的升高 ,Na++K++Ca2+总量不断上升(表 1).值得指出的是 ,直到 N a-
Cl 1.5%的高含量而细胞尚未受害时 ,獐毛愈伤组织中 Na+比在无盐时的含量提高了 30
多倍 , 3种离子总量增加了 1倍 ,表明獐毛愈伤组织具有很高的耐受 Na+积累的能力 ,并
藉此提高细胞的渗透潜势.直到 NaCl 2%极限时细胞内 Na+剧烈增加 ,盐总量随之猛增.
显然 ,此时细胞在过高盐度下已受到损害 ,外界离子发生大量的侵入.
340 　　　　　　　　山　东　大　学　学　报(自然科学版)　　　　　　　　　第 35 卷
表 1　不同NaCl 浓度下原始型愈伤组织 K +、Na +、C a2+离子含量(质量分数)
K +, Na +, Ca2+content of original type calli in dif f erent NaC l containing medium 　　　m g/ g
N aCl Na + K + Ca + Na+/K + K ++Na ++C a2+
C oncent ration
/ %
0(CK) 1.0 22.5 0.90 0.040 24.40
0.7 19.3 20.5 1.21 0.941 41.10
1.5 35.2 15.3 1.52 2.300 52.02
2.0 90.1 16.9 1.30 5.300 108.3
　　从以上 NaCl对原始型獐毛愈伤组织生长 、脯氨酸含量 、离子含量的影响可以看出 ,
在细胞水平上 ,原始型愈伤组织的渗透调节中脯氨酸和无机离子 K+ , Na+ ,Ca2+起到重
要的作用.已知獐毛在整株水平上较高的脯氨酸含量和无机离子是维持其耐盐性的重要
原因 , [ 8]本实验在细胞水平上对原始型愈伤组织进行耐盐性的研究 ,证明在细胞水平与整
株水平上 ,獐毛的渗透调节有相似之处.
2.3　愈伤组织耐盐变异体的筛选
在 2%NaCl含量下进行耐盐变异体的筛选 ,每 17d 继代一次 ,每次继代时挑选明显
生长的淡黄色愈伤组织 ,将愈伤组织体积分割为 2 mm 左右 ,变褐死亡及生长不好的愈伤
组织淘汰掉.4轮筛选结束后 , 2%N aCl培养基中 ,变异型愈伤组织已不再变褐死亡 ,鲜重
的相对生长率及脯氨酸含量比原始型显著提高 ,分别为同盐度下原始型的 3.5 倍 、5.3
倍 ,脯氨酸含量较无 NaCl培养下增长了 11倍(表 2);变异型愈伤组织 K+含量比原始型
高 ,Ca2+含量略有下降 , Na+含量较低 ,Na+/K+较小(表 3), Na+对细胞的毒害作用减
小 ,细胞能维持渗透调节.继续筛选 ,愈伤组织相对生长率不再发生显著变化.
表 2　变异型和原始型愈伤组织鲜重的相对生长率 、脯氨酸含量(质量分数)的比较
Table 2　Com parision of th e RG rate of fresh w eight and proline conten t betw een variant
an d original type calli mg/g
The time for
Com pari sion
C on tent
of NaC l
(%)
Origin al type
Relative
g row th rate
Prolin e content
(mg/g)
Variant type
Ralat ive
grow th rate
Proline con tent
(m g/ g)
Ju st af ter
Fou r passages 2 14.2 8.5 50 45
of selection
After 11
times of
subcu ltu re
in salt-f ree
medium
0.0 75.5 3.5 90.1 4.1
0.3 57.9 16.0 97.8 50.3
0.5 45.9 18.2 98.0 63.8
0.7 63.7 18.6 98.6 65.3
1.0 34.3 42.8 103.7 83.5
1.3 30.1 30.5 101.1 50.2
1.5 28.1 16.2 73.1 40.7
2.0 16.9 9.5 56.0 50.5
341第 3 期　　　　　　岳　玮等:獐毛愈伤组织耐盐性研究及耐盐变异体的筛选　　　
表 3　变异型和原始型愈伤组织 K +、Na +、Ca2+含量(质量分数)的比较
T able 3　C omparision of K +, Na +and Ca2+ conten t(m g/ g)betw een variant an d original type calli
mg/g
The time for
Comparision
Content
of NaCl
(%)
O riginal type
N a
+
K
+
Ca
2+
N a
+/K +K ++Na++Ca2+
V ariant type
Na
+
K
+
Ca
2+
N a
+/K +K ++N a++Ca2+
Ju st af ter four
passages of 2 88.15 17.03 1.04 5.18 106.1 65.72 21.25 0.80 3.09 87.77
selection
Af ter 11 0.0 1.2 24.08 0.83 0.05 26.11 29.07 28.84 3.65 1.01 61.55
times of 0.7 18.2 20.80 1.05 0.87 40.05 51.64 22.40 1.14 2.30 75.18
subculture 1.5 33.7 16.13 1.39 2.09 51.22 73.79 17.43 0.68 4.23 91.90
in salt-f ree 2.0 88.2 17.03 1.04 5.18 106.27 61.50 14.05 0.85 4.38 76.40
medium
2.4　耐盐变异体长期无盐培养后的耐盐性
变异型愈伤组织于 2%NaCl含量的培养基中转入无 NaCl培养基中每 17d继代 1次 ,
培养11代后 ,与原始型愈伤组织分别移入含NaCl0%、0.3 %、0.5%、0.7%、1.0%、
1.3%、1.5%、2.0%的培养基中.变异型愈伤组织在有盐条件和无盐条件下相对生长率
均高于原始型(表 2).在 0.3% ～ 1.3%NaCl含量中 ,变异型愈伤组织生长情况与对照相
差不大 ,生长旺盛 ,有较高的鲜重相对生长率;在 1.5%～ 2%NaCl含量中 ,原始型愈伤组
织生长缓慢或部分坏死 ,而变异型愈伤组织生长良好 ,无坏死现象.
在无 NaCl培养基中 ,变异型的脯氨酸含量略大于原始型 ,但在含 NaCl 的各培养基
中 ,变异型的脯氨酸含量显著高于原始型 ,这在 2%NaCl 含量下表现尤为突出(表 2).离
子含量的比较(表 3)发现变异型与原始型愈伤组织在盐含量逐渐增加时 , K+含量均逐渐
下降 ,Na+含量增加 ,而原始型增加的比率大于变异型 ,因而 Na+/K+比升高的比例原始
型也大于变异型.Ca2+含量原始型变化也不大 ,变异型有一定减少.但不论各离子含量在
盐度增大时的变化如何 ,在 NaCl含量为 2%时 ,它们各自的含量和当初经过 4 次筛选而
还没有放到无盐培养基上时是接近的.除无机离子外 ,脯氨酸含量(表 2),愈伤组织相对
生长量(表 2)也是如此.
以上充分说明 ,獐毛耐盐变异体经长期无 N aCl培养 ,变异型愈伤组织的耐盐性并没
有退化 ,仍保持 2%N aCl的耐盐性 ,这说明筛选得到的耐盐变异体不是生理适应性的 ,而
是可遗传的耐盐变异体.
综上所述 ,通过用 N aCl 对耐盐植物獐毛的培养和筛选 ,可以进一步提高其耐盐能
力 ,获得抗高含量 NaCl的遗传变异体.下一步将进行把此耐盐变异体与普通小麦进行体
细胞杂交 ,验证其耐盐性是否能传递给小麦.
342 　　　　　　　　山　东　大　学　学　报(自然科学版)　　　　　　　　　第 35 卷
参考文献:
[ 1] 罗士韦 ,何卓培.高等植物突变细胞系的研究[ J] .细胞生物学杂志 , 1982 , 4:2.
[ 2] 周荣仁 ,杨燮荣 ,余叔文.应用组织细胞培养研究植物耐盐机理与筛选耐盐突变体的进展[ J] .植物生理学通讯 ,
1989 , 5:11.
[ 3] 张举仁 ,高树芳 ,于家驹 ,王兴安.玉米耐盐愈伤组织的筛选及植株再生[ J] .植物学报 , 1991 , 33(11):887～ 893.
[ 4] S I Yano , M Ogaw a and Y Yam ada.In:A Fujiw ara.Plan t form ation f rom selected rice cells resi stan t to salt s[ A ] .
Plant Tissue culture[ C] , T ok yo:Maruzen , 1982 , 495～ 500.
[ 5] C handler S F ,V asil I K S election an d ch aracterization of NaC l tolerant cells f rom embryogenic cultures of Penn ise-
tum pu rp ureum S chum.(Napier grass)[ J] .Plan t Sci Let t , 1984 , 37:157～ 164.
[ 6] T Yasda , H M aegaw a and T Yamaguchi.In:A Fujiw ata.T he selection for the toleran ce of m ineral st ress in t ropical
plant tis sue cul tu re[ A] .Plant Tissue C ulture[ C] , Tokyo:M aruzin , 1982 , 491～ 494.
[ 7] 李孟扬 ,刘有菊.鲁北黄河三角洲的盐生植物[ J] .曲阜师范学院学报 , 1994 , 125～ 133.
[ 8] 夏光敏 ,李忠谊 ,周爱芬等.小麦悬浮细胞系的结构与原生质体植株再生[ J] .生物工程学报 , 1995(1):63～ 66.
[ 9] Causton DR.A biologis t′s mathematics[ M ] .London:Edw ard Arnold , 1977.
[ 10] 赵可夫 ,李明亮 ,刘家尧.不同类型盐生植物脯氨酸含量的测定[ J] .曲阜师范学院学报 , 1984 , 113～ 114.
STUDY ON SALT-TOLERANCE OF CALLI OF
AELUROPUS LI T TORALIS VAR.S INES IS AND SELECT ION
FOR HIGH SALT-TOLERANT VARIAN T
YUE Wei1 ,XIA Guang-min1 ,CHEN Hui-min1 ,FENG Su-ping 2
(1.College of l i fe Science , S handong Univ ., J inan 250100 , Shandong , China
2.Experiment center , Shandong Univ ., J inan 250100 , Shandong , China)
Abstract:Calli of Aeluropus l it toral is var.sinesis were initiated from the apex of creep-
ing stem .I t′s maximum salt tole rance measured w as 1.5% NaCl.Proine ,K + and N a+
play an important role in the o smo tic regulation of such calli.After repeated subcul ture
on medium cntaining 2%NaCl , a variant type of calli w ith tolearance up to 2%NaCl w as
selected.O n the medium for select ion , the relative grow th rates of f resh w eight of the
variant type calli w as remarkably g reate r that that of the original type , and proline ,K+
and Na+ we re involved in the promo tion of salt tolerance of the va riant calli.After 11
terms of NaCl f ree subcul ture , the vatiant type calli could sti ll tolerate up to 2%NaCl , in-
dict ing that the selected high salt resistant calli w ere genetic variant and no t a phy siologi-
cal adapted type.
Key words:Aeluropus li ttoralis var.sinesis;tissue culture;salt tolerant variant
343第 3 期　　　　　　岳　玮等:獐毛愈伤组织耐盐性研究及耐盐变异体的筛选