全 文 ：第 26 卷第 3 期
2002 年 5 月
南 京 林 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版)
Journal of Nanjing Forest ry University(Natural Sciences Edition)
Vol.26 , No.3
May., 2002
石蒜单染色体的显微分离及体外扩增
邓传良 ,李湘阳 ,周 坚＊
(南京林业大学森林资源与环境学院 , 江苏 南京 210037)
摘 要:建立了石蒜单染色体的分离及体外扩增的方法 。石蒜根尖经卡诺固定液固定后 ,再用
果胶酶和纤维素酶酶解处理 ,制得标本。在倒置显微镜下 ,用自制的毛细管针挑取目的染色
体。将分离的石蒜染色体放入0.2 mL Eppendorf管中 ,经蛋白酶 K处理后 ,进行 DOP-PCR扩
增 ,获得 DNA片段 。琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物的长度大约为 100 ～ 5 000 bp 。此法为构
建石蒜单染色体基因组文库和筛选其特异性探针奠定了基础。
关键词:石蒜;显微分离;PCR扩增;单染色体
中图分类号:S722 文献标识码:A 文章编号:1000-2006(2002)03-0072-03
Microdissection and PCR Amplification of Single Chromosome
of Lycoris radiata
DENG Chuan-liang , LI Xiang-yang ,ZHOU Jian＊
(Co llege of Forest Resources and Environment Nanjing Forestry University , Nanjing 210037 , China)
Abstract:A method of single chromosome isolation and amplification in Lycoris radiata was established.Root
tip fixed by Carnoy fixative w as digested w ith an enzyme mix ture of cellulase and pectoly ase , then used to pre-
pare chromosome samples.The target chromosome was microdissection by using a hand-made capillary needle
under an inverted microscope.Each Eppendorf tube contained one chromosome.The dissected Lycoris radiata
chromosomes were digested by proteinase K in 0.2 mL Eppendorf tubes respectively.After degenerating
oligonucleotide-primed-PCR amplification(DOP-PCR), DNA fragments w ere acquired.The size of DNA frag-
ments in PCR products varied from 100 to 5 000 bp.This w ork w ould facilitate to const ruct the genomic DNA li-
brary of single chromosome and to screen the specif ic probes of single chromosome in Lycoris radiata .
Key words:Lycoris radiata;Microdissection;PCR amplification;Sing le chromosome
石蒜属(Lycoris)植物是球根花卉 ,其花朵色泽鲜艳 ,形态别致 ,为观赏佳品;且鳞茎中含有的石蒜碱 、
加兰他敏 、力可拉敏等成分为临床医疗的要药 。因此 ,石蒜属植物不仅是一类很有开发潜力的花卉资源 ,
而且也是颇有发展前途的药用植物资源 。石蒜属植物在染色体数目和核型上存在着较大的变异 ,既有三
倍体[ 1](2n=33=33t),又有二倍体[ 2](2n =22 、2n =22+1B和 2 n=21+1B)。因此该属植物是进行植物
多倍体研究较好的材料。
染色体微分离及微扩增是传统细胞生物学和现代分子生物学相结合而发展起来的一项新技术 。自
1981年 Scalenghe[ 3]等首次在果蝇唾腺染色体上取得成功后 ,这项技术很快在人类及动物分子遗传学研究
中得到广泛应用 ,并取得很多有价值的结果 。近年来 ,该技术被应用到植物染色体的研究中 ,先后对蚕
豆[ 4] 、王百合[ 5] 、玉米[ 6] 、黑麦[ 7]进行了染色体的分离和扩增 。在显微分离染色体的体外扩增研究方法
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收稿日期:2001-11-22 修回日期:2002-03-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970626)
作者简介:邓传良(1975-),男 ,山东定陶人 ,南京林业大学森林资源与环境学院硕士生。
＊通讯作者(Corresponding Author)
中 ,DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR)即简并引物(随机)扩增法只需一个简并引物就可把
大多数染色体片段扩增出来 ,故简单快捷。利用单染色体显微分离及体外扩增技术可以建立特定染色体
或染色体特定片段的 DNA文库 ,并对标记辅助育种 、在图谱基础上分离基因乃至染色体遗传图及精细物
理图谱构建等研究都极为有利 。笔者利用染色体微分离及微扩增技术 ,对石蒜的单条染色体进行了分离
和扩增。经琼脂糖凝胶电泳检测 ,证明了扩增产物的存在。
1 材料和方法
石蒜(Lycoris radiata)由南京林业大学林木遗传育种组提供;PCR试剂购自南京生工生物技术服务
中心 ,南京生达生物研究所;引物设计参照 Telenius等报道的序列 ,由上海生工生物工程公司合成 。
(1)石蒜染色体标本制备 将石蒜的鳞茎水培发根 ,待根长至 1 ～ 2 cm 时 ,用对二氯苯预处理7.5 h ,
然后用卡诺固定液固定 40 min后立刻转入 70%乙醇中 ,4 ℃条件下保存备用 。制备染色体标本时 ,取根
尖于 1.5%纤维素酶与 3%果胶酶混合液中 37 ℃处理 40 min ,卡宝品红染色 ,常规压片 ,液氮冰冻去盖片 ,
稍气干后 ,立即用于显微分离染色体。
(2)染色体显微分离 用直径 1 mm 的毛细管 ,在拉针仪上拉成尖端直径为 1 μm 左右的毛细管针 。
在显微镜下挑选分散好的石蒜染色体 ,加一滴无菌水 ,用制好的 1 μm 左右的毛细管针挑取目的染色体 。
将粘在毛细管针上的染色体及针尖一同折断于 0.2 mL Eppendorf管中 ,高速离心数秒 , -20 ℃条件下保
存待用。
(3)染色体 DNA的 PCR扩增 将装有石蒜染色体的微量离心管加入 2 μL 蛋白酶 K(5 mg/mL)、18
μL 无菌水 ,55 ℃保温 30 min后 ,于 95 ℃下10 min。然后进行 PCR扩增。采用引物为一可随机扩增的简
并引物(5 -CCG ACT CGA GNNNNNN ATG TGG-3 )。PCR条件基本根据 Vega等的方法稍加改动 。
向含 DNA水溶液中加入引物 1.5μmol/L ,4种 dNTP 各 200μmol/L ,MgCl2 2 mmol/L , 10×Taq buf fer 5
μL ,Taq酶 2.5 U , 无菌水补至 50 μL ,先在 94 ℃下 10 min ,随之进行 94 ℃、1 min ,30 ℃1.5 min ,30 ～ 72
℃缓慢升温 3 min的 10个循环;然后在下列条件下进行 35个循环的扩增:94 ℃、1 min , 62 ℃、1 min , 72
℃、2.5 min;最后在 72 ℃下延伸 10 min 。对照中除不加染色体外 ,其余成分及反应过程均相同。初级扩
增后 ,取初级扩增产物 10 μL 做模板进行次级扩增 ,各扩增反应物浓度与初级扩增相同 ,先在 94 ℃下 2
min ,然后进行 94 ℃、1 min , 62 ℃、1 min , 72 ℃、2.5 min的 38个循环;最后在72 ℃下延伸 10 min 。
(4)琼脂糖凝胶电泳 取 PCR产物 5 μL 于 2%琼脂糖凝胶电泳 ,天能 UV-2 000系列紫外分析仪中
300 nm 紫外灯下观察并照相。
图 1 石蒜染色体的形态图(1 200×)
Fig.1 The mo rphology of somatic chromosomes
of Lycoris(1 200×)
2 结果和讨论
2.1 石蒜染色体的核型
石蒜染色体既有三倍体又有二倍体 ,该实验选用的
为二倍体 2n=22如图 1所示 。对其进行了核型分析后
发现与邵建章等[ 8]报道的基本一致。其核型公式为 2n
=22=12st+10t ,染色体组总长度为 129.15μm ,染色体
长度变异范围在 8.33 ～ 14.16 μm , 比值为1.69 , 属
“4A”核型 。在实验过程中 ,挑选了 3条不同形态的染
色体 ,进行显微分离及体外扩增 , 以求获得不同的扩增
产物 ,为进一步建立石蒜染色体 DNA 文库奠定基础。
2.2 单染色体的体外扩增
将显微分离所得 3条石蒜单染色体分别经 DOP-
PCR扩增后 ,用 2%琼脂糖凝胶电泳检测的结果见图
2。泳道 M 为标记 ,泳道 1 、2 、3为 3条不同的染色体的
扩增产物 ,泳道 4为对照 。从图中可以看出扩增产物的分子量在 100 ～ 5 000 bp ,并且不同的染色体其扩
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2002年 总第 99 期 邓传良等:石蒜单染色体的显微分离及体外扩增
图 2 石蒜 3 条染色体 PCR扩增产物
Fig.2 PCR products of the 3 chromosomes
of Lycoris
增产物不同。1 号染色体各分子量DNA 片段信号比较
均匀 ,2 号染色体产物则在低分子量区域信号较强 ,而
3 号染色体的高分子量DNA 片段信号更强 。这证明3
条不同的染色体 ,其扩增信号的差异是较大的 。对照4
没有信号 ,证明扩增产物的可靠性 。对石蒜染色体进
行第一次扩增 ,只获得微弱的扩增信号(图略)。然后
又以第一次扩增产物为底物 ,进行第二次扩增。这一
次就得到了较强的信号 ,其扩增产物已完全可用于进
一步的实验分析 。
对于石蒜三倍体 2n =33 的来源 ,有两种推测 ,一
种可能是起源于二倍体和四倍体的杂交 ,但至今在石
蒜属中未见到任何四倍体植株。另一种方式是通过石
蒜一个二倍体未减数配子与另一个二倍体的正常配子
结合而产生 。 Inariyama[ 9]曾证明石蒜是同源三倍体。
因此 ,邵建章等认为三倍体石蒜来源于后一种方式。
杨继认为植物多倍体基因组主要起源于 3种不同的途
径 ,即:体细胞染色体加倍(somatic doubling)、未减数配
子的融合(union of unreduced gametes)和多精受精(poly spermy)[ 10] 。至于石蒜三倍体基因组起源于哪一
种方式 ,至今尚未阐明。
3 结 语
利用染色体微分离及微扩增技术 ,成功地对石蒜的单条染色体进行了分离和扩装置。通过石蒜单染
色体切割及扩增 ,可建立石蒜单染色体文库 ,并从中可筛选出特异探针。利用探针结合 FISH 等技术则不
仅可以为研究石蒜属植物多倍体基因组的起源提供一个新的研究手段 ,而且为从分子遗传角度研究多倍
体基因组中重复基因或重复基因组的进化动态提供一条有效的途径 。
[ 参 考 文 献 ]
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(责任编辑 郑琰炎炎)
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南 京 林 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版) 第 26卷 第 3期