全 文 ：第 47卷 第 5期 土　壤　学　报 Vol.47, No.5
2010年 9月 ACTA PEDOLOGICA SINICA 　Sep., 2010
＊国家自然科学基金项目(30700488)、国家 863计划(2007AA10Z143)和教育部重点项目(107060)资助
通讯作者 , E-mail:yiyong1973@njau.edu.cn
作者简介:曾后清(1986— ),男 ,江西吉安人 ,博士研究生 ,主要从事缺磷胁迫下植物中 miRNA的研究。 zenghouqing@163.com
收稿日期:2009-08-19;收到修改稿日期:2009-11 -04
白羽扇豆缺磷胁迫下 miR399与磷响应基因的
表达及关系＊
曾后清　朱毅勇 　尹晓明　董彩霞　沈其荣
(南京农业大学资源与环境科学学院 ,南京　 210095)
　　摘　要　　通过 microRNA(miRNA)基因芯片及 RT-PCR研究了白羽扇豆在缺磷胁迫下 miR399与磷响
应基因的表达变化。结果表明:缺磷处理后根系生物量显著高于供磷处理 , 但地上部生物量降低 , 并且植株
体内磷含量明显减少。 基因芯片结果表明 , 缺磷白羽扇豆根 、茎和叶中分别有 10、 7和 3个不同成员的
miR399s表达上调 , 平均上调倍数分别为 4.4, 3.8和 2.5。 6个磷响应基因 LaATPase、LaPT1、LaMATE、La-
PEPC3、LaSAP和 LaMDH1在缺磷排根中的表达均高于供磷侧根 ,启动子序列分析表明 LaPT1和 LaMATE启
动子区域有与 PHR1或 WRKY转录因子结合的磷响应元件 。在此基础上得出有关 miR399, PHR1与这些受
缺磷诱导的基因之间的调控关系。研究表明 , miR399和磷响应基因对白羽扇豆适应缺磷环境起着重要作用。
　　关键词　　白羽扇豆;缺磷;miR399;基因表达
中图分类号　　Q74　　　　文献标识码　　A
　　磷是植物生长必需的营养元素之一 ,其广泛参
与植物体内的生化合成 、能量转移 、信号转导等代
谢过程 。但是土壤中磷的有效性却很低 ,主要原因
是施入到土壤中的可溶性无机磷(肥)除一小部分
被植物直接吸收外 ,大部分会向吸附态或难溶性无
机磷酸盐转化 ,导致植物根系无法吸收和利用 [ 1] 。
白羽扇豆(LupinusalbusL.)是一种耐低磷的模式植
物 [ 2-4] ,在缺磷时形成大量排根(如图 1),这些小根
簇紧密地排列在一级侧根上 ,大大增加了根系在土
壤中吸磷的表面积 , 而且排根还会大量分泌有机
酸 [ 3, 5] 、酸性磷酸酶 [ 6] ,提高土壤中磷的有效性 。
目前在白羽扇豆中已经发现不少对缺磷响应
的基因 ,包括磷酸盐转运蛋白 LaPT1[ 7] 、酸性磷酸
酶 LaSAP[ 8] 、多药和毒素外排蛋白 LaMATE[ 9] 、苹
果酸脱氢酶 LaMDH[ 10] 、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
LaPEPC[ 1 1]等 。 Uhde-Stone等 [ 1 2]从缺磷白羽扇
豆的排根 cDNA文库中发现有 35个基因在缺磷
胁迫后表达上调 ,这些基因涉及碳代谢和次生物
质代谢途径 、磷转运 、激素代谢及信号转导等各
个方面 。然而关于白羽扇豆中这些受缺磷诱导
的下游基因的表达是受上游哪些因素的调控仍
不明确 。
miRNA是真核生物中一类非编码的小分子单
链 RNA,长度约为 20 ～ 24个核苷酸 。它是一类负
调控因子 , 主要在转录后水平上通过介导靶基因
mRNA的切割或抑制翻译来调节植物基因的表
达[ 13] 。 miRNA不仅参与调控植物的形态发育 、激
素分泌 、信号转导 ,而且对环境胁迫 ,如干旱 [ 14] 、重
金属 [ 15] 、养分缺乏 [ 16, 17] 也具有调控作用。其中 ,
miR399是植物缺磷诱导的具有调节体内磷素平衡
的一种 miRNA,在拟南芥中 miR399可以调控下游
对缺磷响应的基因 ,目前正受到国内外研究者的
重视 [ 18-21] 。
尽管有关白羽扇豆的耐低磷机制研究很多 ,但
是同时将 miR399与这些缺磷诱导基因研究还未见
报道 ,它们之间是否还存在某种关系呢? 因此 ,本
文利用基因芯片研究了白羽扇豆中 miR399在缺磷
时的表达模式 ,并利用 RT-PCR验证了 miR399在根
茎叶中的表达特征 ,并对排根中受缺磷诱导的基因
表达进行了研究 。在此基础上分析了这些下游基
因与上游 miR399及其他调控因子之间的关系 ,旨
在为研究白羽扇豆耐缺磷的生理和分子机制提供
理论依据 。
972　 　土　　壤　　学　　报 47卷
图 1　白羽扇豆受缺磷诱导后形成的排根 [ 22]
Fig.1　Growthofproteoidrootsofwhitelupininduced
byPdeficiency[ 22]
1　材料与方法
1.1　供试植物
白羽扇豆种子(LupinusalbusL.cv.Amiga)由德
国李比希大学植物营养研究所提供。
1.2　实验处理
植物采用水培方法 ,用 5L的塑料盆钵进行栽
培 ,每盆种植 5棵白羽扇豆 ,营养液配方参照 Zhu
等[ 2] 。人工气候室内生长 ,光强 300 μmolm-2 s-1 ,
光周期 14h;温度为昼 /夜 23 /18℃。白羽扇豆种子
萌发 4d后将苗移入营养液中培养 ,营养液 pH6.0,
每 3d更换一次 ,缺磷营养液不含磷 ,对照植物供磷
KH2PO4 0.25 mmolL-1。
1.3　缺磷对植物生长及磷含量的影响
本实验在培养 21d后分别采集每株植物地上部
分与地下部分样品 , 测定鲜重 , 烘干后测定植株地
上和地下部分的磷含量 。所有实验独立重复三次 。
1.4　利用基因芯片分析根茎叶中 miR399的表达
由于植物中的成熟 miRNA在不同的物种中具
有高度的保守性[ 13] , 因此本研究用已知植物的
miR399成熟序列去除重复后做成探针通过基因芯
片(Exiqon8.1版 miRNA芯片 ,丹麦 Exiqon公司提
供)对白羽扇豆根茎叶中的 miR399表达进行分析 。
利用上述培养的白羽扇豆 ,分别采集缺磷植物的排
根 、茎 、叶和供磷植物的侧根 、茎 、叶 ,送交博奥生物
有限公司进行分析。最后挑选出缺磷和供磷样品
两者芯片杂交信号值差异达显著(p<0.05),并且
差异倍数高于 1.5的探针作为白羽扇豆缺磷胁迫下
具有表达差异的 miR399。
1.5　利用 RT-PCR分析磷响应基因的表达
采集缺磷植物的排根 、供磷植物的侧根 ,分别
提取其总 RNA。 RNA经电泳鉴定质量合格后进行
oligodT反转录 , 最后 PCR扩增相应的基因。以
Ubiquitin为内参基因 , 扩增 Ubiquitin、LaATPase、
LaPT1、LaMATE、LaPEPC3、LaSAP和 LaMDH1的引
物 、产物长度和循环数见表 1。
表 1　RT-PCR表达分析所用的引物
Table1　PrimersforexpressionanalysisbyRT-PCR
基因 基因号 引物正反向 引物序列(5′-3′) 长度(bp) 循环数
Gene AccessionNumber Forward/Reverse Primersequences(5′-3′) Length(bp) Cycles
Ubiquitin CA410752 Forward GGCAAGACCATCACTCTCGA 227 25
Reverse ACCTCAAGGGTGATGGTCT
LaATPase AY989893 Forward CCTGAGCAGATCATGATCCT 329 28
Reverse GAAGATGGATGCATATTCGT
LaPT1 AF305623 Forward ATAGTCCAAATTCTGTGTTGGC 473 28
Reverse ATGGTTTTCCCTGCGCCTCTTC
LaMATE AY631874 Forward GGATTCCAAGTTTGCCTTCAAGT 493 27
Reverse GTTCCTGTTCCCATTCTCCAAAC
LaPEPC3 AY663387 Forward TCGTGACCCGAACTTTAATGTG 251 30
Reverse TTTTGGTGAGTGCAACTATGAT
LaSAP AF309552 Forward TCCACTCGTTACCATACTCC 442 30
Reverse CCTTCTAGGTTTCCTCCATCC
LaMDH1 AF459645 Forward CCAAAAACCCAGTTCGTGTT 198 30
Reverse CCTTTAAGAAGGGGGAATGC
5期 　　曾后清等:白羽扇豆缺磷胁迫下 miR399与磷响应基因的表达及关系 973　
2　结　果
2.1　磷胁迫对白羽扇豆生长的影响
在营养液中培养 21d后 , 缺磷处理白羽扇豆
根系鲜重显著高于供磷处理 ,枝叶鲜重显著低于
供磷处理(图 2a)。此外 ,缺磷处理根系和枝叶
磷含量都显著低于供磷处理 ,但相比于枝叶 ,缺
磷处理的植物根系磷含量更接近于供磷处理(图
2b)。
974　 　土　　壤　　学　　报 47卷
2.2　利用基因芯片分析 miR399在缺磷胁迫下
的表达状况
　　植物中的成熟 miRNA序列在不同的植物中具
有高度的保守性 ,通过基因芯片分析缺磷和供磷白
羽扇豆根 (缺磷为排根 , 供磷为侧根 )、茎和叶中
miR399的表达谱 ,其中 12个不同的 miR399的探针
在缺磷样品的信号值显著高于供磷样品(p<0.05),
这些 miRNA分别对应拟南芥 Arabidopsisthaliana
(ath)、水稻 Oryzasativa(osa)、毛果杨 Populustricho-
carpa(ptc)和蒺藜苜蓿 Medicagotruncatula(mtr)等四
个物种的保守序列。在根 、茎和叶中分别有 10、7和 3
个 miR399成员在缺磷胁迫下表达上调(图 3),各器
官中 miR399表达上调倍数总体上是根 >茎 >叶 ,根
中平均上调倍数为 4.4,茎中为 3.8,叶中为 2.5。通
过聚类分析发现 ,其中有 2个 miR399(ath-miR399f和
mtr-miR399a)在根 、茎和叶中表达都上调 , 有 4个
miR399(ath-miR399e、 ptc-miR399h、 ptc-miR399k和
osa-miR399h)只在根和茎中表达(图 4)。
图 4　根 、茎和叶中不同成员的成熟 miR399的聚类分析
Fig.4　ClusterofmaturemiR399sofdifferentmembersdetectedinroot, 　　　　
stemandleaf
2.3　缺磷诱导基因在白羽扇豆根中的表达
为了研究白羽扇豆其他耐缺磷基因的表达 ,本
研究采集了缺磷处理的排根和供磷处理的侧根 ,分
析了 6个典型的对磷响应基因的表达 。结果发现酸
性磷酸酶基因(LaSAP)和多药和毒素外排蛋白(La-
MATE)在供磷侧根中表达很弱或几乎不表达 ,而在
缺磷胁迫下表达却很强 ,磷酸盐转运蛋白(LaPT1)、
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (LaPEPC3)和细胞膜
H+-ATPase在供磷条件下有不同程度的表达 ,但都
明显低于缺磷处理(图 5)。
2.4　缺磷响应基因启动子区域中缺磷响应元件
的分析
　　除了 miR399可以调控下游基因的表达之外 ,
在植物中还分离到两个在缺磷信号中起正调控作
用的元件 PHR1 element和 W-box,其中 PHR1 ele-
ment可以与属于 MYB-CC家族的 PHR1(phosphate
starvationresponsive1)转录因子相互作用 , W-box能
够与 WRKY家族的 WRKY75转录因子结合 ,转录
因子通过与下游基因启动子区域的顺式作用元件
相互结合 ,从而调控一系列基因在缺磷条件下增强
表达 [ 23, 2 4] 。基于上述原因 ,本实验利用生物信息
图 5　白羽扇豆缺磷(-P)排根与供磷
(+P)侧根中缺磷响应基因的表达
Fig.5　ExpressionofPresponsivegenesinP-defi-
cientproteoidrootandP-suficientlateralroot
5期 　　曾后清等:白羽扇豆缺磷胁迫下 miR399与磷响应基因的表达及关系 975　
学方法分析了这些已知的缺磷诱导表达的基因的
上游启动子序列 ,到目前为止除了 LaPHT1和 La-
MATE基因的上游启动子已克隆外 ,其他的几个基
因由于还未获得上游序列故无法分析 。结果表明
在 LaMATE启动子区域有 1处 PHR1元件和 3处
W-box元件 ,在 LaPHT1启动子区域有 2处 PHR1元
件(表 2)。因此可以推测这两个基因上游启动子能
和 PHR1或 WRKY转录因子结合 。
表 2　LaMATE和 LaPHT1基因启动子区域磷响应元件
的分析
Table2　AnalysisofPresponsiveelementsinthepromoter
regionsofLaMATEandLaPHT1
基因 基因号 顺式元件 元件序列 位置 1)
Gene　GeneaccessionNo.Cis-element Sequence Position
LaMATE AY631873 PHR1 elemen GNATATNC -1677
W-box TTGAC(C/T)-2401 -207 -179
LaPHT1 AY026321 PHR1 elemen GNATATNC -1259 -116
　　注 Note:1)“位置 ”是指元件的 5端相对于转录起始位点而言
“Position” indicatesthe 5 endofelementsrelativetotranscription
startsite
3　讨　论
土壤中磷有效性低是限制作物生长与产量的
主要原因之一 [ 25] 。开发磷高效利用植物资源或培
育耐低磷植物具有重要的意义。白羽扇豆通过形
成大量的排根扩大根系吸磷面积 ,同时分泌有机
酸 、酸性磷酸酶来活化土壤中难溶性磷素 ,从而提
高对磷的利用效率 。本实验中 ,缺磷白羽扇豆根系
生物量显著高于供磷处理 (图 2A),可见排根的大
量产生扩大了根系的生长 ,是适应缺磷的典型的形
态学适应机制。但是 ,根系中磷含量在缺磷时与供
磷处理差异不明显 ,而枝叶中则相差很大(图 2B),
这说明地上部分的磷含量是诱导下游生理反应的
信号来源[ 26] 。
在白羽扇豆的排根中已发现一些与缺磷诱导
有关的基因及蛋白 ,如 LaPT1编码高亲和性磷转运
蛋白 ,对于增强磷的吸收和体内转移具有重要作
用 [ 7] 。本实验中 LaPHT1在缺磷排根中诱导表达与
已报道的结果吻合(图 5)。酸性磷酸酶可以将根际
植酸盐等有机磷水解为有效态磷 [ 27] ,缺磷白羽扇豆
的排根会分泌大量的酸性磷酸酶(APase)[ 6] 。本实
验中 LaSAP在缺磷排根的表达显著强于供磷侧根
(图 5),从分子水平证实了 LaSAP在耐缺磷胁迫中
的重要作用。据 Zhu等报道缺磷诱导柠檬酸 、苹果
酸的大量分泌是白羽扇豆耐缺磷胁迫的重要适应
机制 [ 3] 。由于 PEPC在有机酸合成过程中起着重要
的作用[ 28] ,研究发现 ,白羽扇豆排根的 PEPC活性
要高于侧根[ 2] ,本实验也证实排根中 PEPC3的表达
明显高于供磷侧根 (图 5)。 Uhde-Stone等 [ 10]克隆
了 PEPC和 MDH的全长 cDNA,发现这两个基因的
增强表达定位于分泌有机酸的排根中 ,本研究结果
也证实了这一点(图 5)。而有机酸的分泌 ,尤其是
柠檬酸的分泌与细胞膜上的阴离子通道有关 [ 29] 。
MATE蛋白是一类参与多种药和毒素排泄的运输蛋
白[ 30] ,根据最近的研究推断 , MATE基因很可能是
控制有机酸分泌的一种细胞膜上的运输蛋白 [ 9] ,本
实验中也证实了 LaMATE在排根中受缺磷诱导表
达。由于白羽扇豆排根合成与有机酸分泌和细胞
膜 H+ATPase主动排出质子有关[ 3, 5] ,因此本实验利
用由本研究小组自己克隆的白羽扇豆 H+ATPase基
因序列分析了其表达情况 ,发现在排根中表达上调
(图 5)。上述 LaPT1、LaSAP、LaPEPC、LaMDH、La-
MATE和 LaATPase基因在排根中受缺磷胁迫诱导
表达 ,说明它们都参与了白羽扇豆对缺磷胁迫的下
游生理反应 ,可以用来作为缺磷诱导的标志基因 。
miR399是受缺磷特异诱导表达且具有调节植
物体内磷酸盐动态平衡的功能[ 20] 。基于 miRNA成
熟序列在不同物种中的高度保守性 [ 13] ,本研究通过
基因芯片探测了 miR399在缺磷胁迫的根 、茎和叶
中的表达 ,结果表明缺磷处理下 miR399的表达都
上调(图 3)。芯片结果同时也反应出白羽扇豆中的
miR399与拟南芥 、苜蓿 、水稻以及杨树中的 miR399
具有较高的同源性(图 4)。 Pant等 [ 21]表明 miR399
是一种长距离的信号物质 ,因为在缺磷植物的韧皮
部汁液中能检测到 miR399。本实验发现在根 、茎和
叶中同时探测到 ath-miR399f和 mtr-miR399a(图
4),进一步说明了不同器官之间存在成熟 miRNA的
转移 。芯片结果还表明根中探测到的 miR399个数
要多于茎和叶 ,并且缺磷时上调倍数也要高于茎和
叶。已有研究表明拟南芥在缺磷条件下根系中成
熟 miR399的表达量要大于地上部[ 17] 。可见 ,
miR399受缺磷诱导时遍布白羽扇豆整个植株(图
4),这对于增强磷酸盐的吸收和转运 ,调节体内磷
素营养起着重要的作用 。
结合已有的研究结果与本实验结果 ,我们初步
976　 　土　　壤　　学　　报 47卷
描绘了缺磷诱导的基因与 miR399及其他上游调控
因子之间的关系(图 5)。miR399直接调节靶基因
PHO2,一种遍在蛋白缀合酶 (ubiquitin-conjugating
E2 enzyme)[ 18] ,而 PHO2是高亲和磷酸盐转运蛋白
PHT1负调控因子 [ 18, 20] 。最近在菜豆中又发现 ,受
miR399负调控的靶基因 PvPHO2能对缺磷响应基
因 PvAPC5、PvAP和 PvPHT1进行负调节 ,前两个基
因均为酸性磷酸酶 [ 31] 。因此推断在白羽扇豆中
miR399先对 LaPHO2负调控 , LaPHO2又对 LaPHT1
和 LaSAP进行负调控。此外 ,其他上游调控因子 ,
如拟南芥中 PHR1可与缺磷响应基因的启动子区域
的元件(GNATATNC)形成二聚物而调控下游基因
的表达 [ 23] 。拟南芥 phr1突变体中 , miR399以及一
系列缺磷诱导基因的表达均受到抑制 ,但在 pho2突
变体中表达上调 ,证明了 PHR1是 miR399和 PHO2
更上游的磷信号通路 [ 19] 。在菜豆中用 RNAi技术
干扰 PvPHR1也得出了相同的结论 [ 31] 。通过生物
信息学技术 ,本研究发现 LaPHT1以及 LaMATE启动
子区域中转录起始位点的上游都存在着与 PHR1结
合的位点(表 2)。因此 PHR1在白羽扇豆中可能还
会直接调控 LaPHT1和 LaMATE的转录表达(图 6)。
图 6　白羽扇豆 miR399和磷响应基因参与的磷信号模式图
Fig.6　ModelofwhitelupinPisignalinginvolvingmiR399 　　
andPresponsivegenes
至于 LaMATE,以及其他下游基因 LaATPase、LaMDH
及 LaPEPC是否也可能受 PHO2的直接调控 , 即
miR399的间接调控 ,或是受 PHR1的直接调控 ,则
有待进一步的研究。它们是否还可能受到其他调
控因子的作用 ,例如 LaMATE受到 WRKY的调控 ,
这些也是今后需要研究的内容与方向。
4　结　论
综上所述 , miR399与其他转录因子一起与磷响
应基因之间组成了磷信号级联式通路 ,其中 miR399
作为一种特殊的上游调控因子 , 可以通过抑制
PHO2的表达 , 再间接增强下游基因的表达 , 如
LaPHT1和 LaSAP的表达 , miR399可以作为一种长
距离运输的信号物质 ,对植物体内各部位适应缺磷
的生理机制进行调控。本研究为进一步研究植物
耐缺磷的分子机理和培育磷高效利用植物奠定了
基础 。
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EXPRESSIONOFMIR399 ANDPRESPONSIVEGENESANDTHEIR
RELATIONSHIPINWHITELUPINUNDERPSTRESS
ZengHouqing　ZhuYiyong 　YinXiaoming　DongCaixia　ShenQirong
(ColegeofResourcesandEnvironmentalSciences, NanjingAgriculturalUniversity, Nanjing　210095, China)
Abstract　ExpressionofmicroRNA399 (miR399)andPresponsivegeneswasanalyzedinwhitelupinunderP
stressbymiRNAmicroarayandRT-PCR, respectively.Samplesofroot(proteoidrootandlateralroot), stemand
leafwereharvestedfromwhitelupinplants, whichwereculturedinhydroponicnutrientsolutionwithorwithoutP
978　 　土　　壤　　学　　报 47卷
for21 days.ResultsshowthatPdeficiencysignificantlyincreasedrootbiomassofwhiteluipn, butafectednega-
tivelyshootbiomasandPicontentoftheplant.TheresultsofmiRNAmicroarayindicatedthat10 membersofthe
miR399 familyinroot, 7 instemand3 inleaf, wereup-regulatedintheplantsunderPstress, onaverageby4.4,
3.8 and2.5 folds, respectively.LaATPase, LaPT1, LaMATE, LaPEPC3, LaSAPandLaMDH1 werethe6 Pre-
sponsivegenes, ofwhichexpressionwasmuchhigherintheproteoidrootsoftheplantswithoutPthaninthelateral
rootsoftheplantswithP.PutativePresponsiveelementswerefoundbindingtranscriptionfactors, PHR1 or
WRKY, inthepromoterregionsofLaPHT1 andLaMATE.Basedonthefindings, regulatoryrelationshipofmiR399
andPHR1 withPresponsivegeneswereexplored, suggestingthatmiR399 andPresponsivegenesplayanimpor-
tantroleinwhitelupinadaptingtoPdeficiency.
Keywords　Whitelupin;Pdeficiency;miR399;Geneexpression