全 文 ：异源表达白羽扇豆酸性磷酸酶基因对
白三叶草磷吸收的影响
谷俊涛1 , 2 ,李金才1 ,韩胜芳1 , 2 ,肖凯1*
(1.河北农业大学农学院 ,河北保定 071001;2.河北农业大学生命科学学院 ,河北保定 071001)
摘要:利用子叶下胚轴为外植体 , 通过农杆菌 T i 质粒介导遗传转化途径 , 建立了表达白羽扇豆酸性磷酸酶基因
(APase)的白三叶草转基因系。 PCR检测发现 , APase基因已整合到转基因植株的基因组中。 Northern 印迹分析
表明 , APase基因在部分转基因系中高水平表达。此外 , 在异源表达 APase 的白三叶草中 , 位于 A Pase 上游的
Pa tatin 信号肽具有将翻译产物引导至细胞间隙和根际的能力。在以植酸盐为唯一磷素供源的条件下 ,与转化空载
体的对照植株相比 , 高水平表达 APase的白三叶草转基因系植株的磷素累积量 、鲜重和干重显著增加。结果表明 ,
异源表达白羽扇豆 APase基因能明显增强白三叶草吸收有机态磷的能力。
关键词:三叶草;遗传转化;白羽扇豆 APase基因;磷素吸收
中图分类号:Q945. 12;Q943　　文献标识码:A　　文章编号:1004-5759(2007)04-0069-07
* 　　磷是植物必需的大量元素之一 ,是核酸和生物膜的重要组分 ,在植物光合 、呼吸等能量代谢和许多其他生化
代谢反应中具有重要的作用[ 1] 。通常 ,土壤中的绝大部分磷以有机化合物的形式或被矿质颗粒吸附的方式存在 ,
很难被植物吸收[ 2 , 3] 。磷素供应不足造成世界范围内 30%以上的农田作物生长和产量受到限制[ 4] 。因此 ,增强
作物对土壤难溶性磷的吸收能力 ,对于改善植株的磷素营养状况 ,进而提高农作物的产量及促进农业的可持续发
展具有重要意义 。
有机态磷占土壤全磷量的 30%～ 80%,其中一半左右又以植酸盐的形式存在[ 5] 。增强植株对土壤中植酸盐
等有机态磷的吸收 ,是改善植株的磷素营养 、缓解磷素资源紧缺和促进磷素资源的可持续利用的一条有效途径。
白羽扇豆(Lupinus albus)是耐低磷的重要植物之一 ,对生长介质中的磷素胁迫具有较强的抵御能力[ 6] 。研究发
现 ,缺磷条件下 ,通过诱导大量排根发生 、分泌苹果酸和柠檬酸以及由根系中向根际分泌大量的酸性磷酸酶
(APase)是白羽扇豆耐低磷胁迫的重要原因[ 7 , 8] 。其中 ,酸性磷酸酶具有将根际植酸盐等有机磷分解为有效态
磷 ,并由此改善植株磷素营养的作用[ 8 , 9] 。M iller 等[ 10] 克隆了一个低磷胁迫诱导表达的具有向根际分泌特征的
APase基因 ,并表明该基因编码蛋白在白羽扇豆抵御磷胁迫中可能具有较重要的作用。
白三叶草(Tri f ol ium repens)具有品质优良 ,营养丰富 ,适口性好等特点 ,主要用作反刍动物的饲草饲料 ,是
一种世界性分布与栽培的优良豆科牧草[ 11 , 12] 。此外 ,白三叶草在提高土壤肥力 、增加地面覆盖 、控制杂草生长 、
保持土壤温度 、减少土壤侵蚀和防风固沙中具有重要作用[ 13] 。本研究以白三叶草(Irrigation品系)种子的子叶
下胚轴为受体材料 ,利用农杆菌(Agrobacterium tume f aciens)介导遗传转化法 ,建立了异源表达白羽扇豆 APase
基因的白三叶草转基因系 。结果表明 ,在马铃薯(Solanum tuberosum)patatin 信号肽的引导下 ,高效表达 APase
基因的转基因系 ,目的基因的翻译产物能分泌至细胞间隙和根际 。与转化空载体的对照植株相比 ,在以有机态磷
植酸盐(phy tate)为唯一磷供源的条件下 ,转基因植株的磷素累积量 、鲜重和干重均显著增加。表明超量表达白
羽扇豆酸性磷酸酶基因具有改善白三叶草利用土壤中有效态磷的能力。
1　材料与方法
1. 1　供试品种
供试白三叶草品系为 Irrigation ,由作者实验室保存。
第 16卷　第 4期
Vol. 16 , No . 4
草　业　学　报
ACTA PRATACULTURAE SINICA
　　69 - 75
8 /2007
*收稿日期:2006-07-05
基金项目:国家粮食丰产科技工程项目(2004BA520A07-04)和河北省自然科学基金(2006000434)资助。
作者简介:谷俊涛(1967-),男 ,河北宁晋人 ,副教授 ,博士。 E-mai l:gujun tao@heb au. edu. cn
*通讯作者。 E-mai l:xiaokai@hebau . edu. cn
1. 2　APase表达载体构建
选用的质粒为双元表达载体 pCAMBIA3301。用 Miller等[ 10] 克隆的白羽扇豆 APase基因(GeneBank登录
号:AF309552)序列设计正向引物 5′-CCA TGGCCAGCACTTA TGTGAGGAA (含 N coI 切点)和反向引物 5′-
TCACGTGAACAT TATAAATCTTGG T (含 PmlI 切点)。以白羽扇豆 APase cDNA 克隆质粒(M iller 博士惠
赠)为模板 ,扩增不含有可能信号肽(N 端 23个 aa)的 APase基因编码阅读框 。PCR扩增条件为:94℃预变性 5
min;94℃变性 45 s , 55℃退火 45 s ,72℃延伸 45 s ,30个循环;72℃7 min(TaKaRa试剂)。扩增的PCR产物与 T
载体(Promega产品)连接 ,转化大肠杆菌(E. coli)DH5α,提取质粒后用 NcoI和 PmlI 酶切 ,收获目的片段与用
N coI和 PmlI 酶切后的 pCAMBIA3301 连接 , 得到 pCAMBIA3301-APase 质粒。用正向引物 5′-GCCA TG-
GCAACTACTAAATCTT T (含 NcoI切点)和反向引物 5′-GCCA TGGCCGTAGCACATGT TGAACT(含 N co
切点)从马铃薯 DNA中扩增 patatin信号肽 ,转化大肠杆菌 DH5α,提取质粒后用 Nco酶切 ,获得目的片段插入
N co酶切后的 pCAMBIA3301-APase中。通过序列分析鉴定 ,获得 patatin 信号肽(sp)与 APase 正确拼接的表
达载体 pCAMBIA3301-sp-APase。在该表达载体中 ,目的基因上游用已证实能高效引导翻译产物至细胞间隙和
细胞外部的信号肽[ 14] ,替换了 APase的可能信号肽 ,旨在实现目的基因翻译产物高效率地向根际分泌 。采用冻
融法将 pCAMBIA3301-sp-APase导入农杆菌 C58。从 YEB平板上挑取阳性菌落 ,接种于含卡那霉素 50 mg /L
的 YEB液体培养基中 ,28℃、200 r /min振荡过夜(约 14 h)。然后 ,以 2%转接量接种于 20 mL 无抗生素 YEB培
养液中 ,振荡培养至 OD600约 0. 3 ,备用 。
1. 3　农杆菌介导的三叶草遗传转化
将三叶草种子 Irrigat ion用 70%乙醇浸泡 3 min ,然后转入 3%次氯酸钙溶液磁力搅拌消毒 40 min ,再用灭
菌重蒸水冲洗 6 ～ 8次后 ,转入盛有 10 mL 灭菌重蒸水的小瓶内 。在 15℃下暗处放置 16 h 。在遗传转化之前 ,于
解剖镜下用解剖针拨去种皮 ,将萌动种子沿两子叶交界处分为 2部分。浸入备用农杆菌菌液中 40 min后 ,转到
共培养培养基[ Murashige和 S koog(MS)培养基 , pH 值 5. 8 , 苄基腺嘌呤(BAP)4. 4 μmol /L ,萘乙酸(NAA)0. 5
μmol /L ,蔗糖 30 g /L ,琼脂 8 g /L] ,在光照培养箱内培养3 d。培养时的光周期为 16 h ,温度 25℃/20℃(白天 /黑
夜)。之后转到加有 PPT 的选择培养基[除共培养基的各组分外 ,另加头孢噻肟(Cefotaxime)250 mg /L ,草铵膦
(Glufosinate ammonium PPT) 5 mg /L] ,每 2周继代 1次 。4周左右将在选择培养基上发生丛生芽用刀片切下 ,
分别移至装有选择培养基的三角瓶中 , 4 周后转移至根系诱导培养基(1 /2 M S 培养基 , pH 值 5. 8 ,吲哚乙酸
(IBA) 1μmol /L ,Cefo taxime 250 mg /L ,蔗糖 10 g /L ,琼脂 8 g /L)中诱导生根 ,生根后的植株移栽花盆中转移至
温室内生长。
1. 4　PCR检测
采用 CTA B方法提取对照和转基因系的 DNA[ 15] 。用从 APase cDNA 的 3′端序列进行转基因系和对照的
PCR检测。正向引物为 5′-GAAA TACAAGG T TGA TG T TG TGT 和反向引物 5′-ATA TA TTGGTAA TGA-
CA TACAT TC 。扩增的片段长度为 468 bp 。
1. 5　Nor thern印迹分析
以 APase基因的 cDNA 质粒为模板 ,用对照和转基因系 PCR检测中采用的引物和扩增条件 ,扩增 APase基
因片段 ,用α-32P-dCTP 标记 PCR扩增的片段作探针 。参照 Xiao等[ 16] 的方法进行 Northern印迹分析。
1. 6　植株根系和细胞间隙植酸酶活性的测定
选取生长整齐一致的转基因和对照植株 ,转移至盛有蛭石和石英砂(1∶1)的塑料钵(直径 15 cm ,装有介质
500 g)中 ,其中均匀混有 2%的植酸盐(my-ino sito l hexaphosphoric acid dodecasosium salt f rom rice , Sigma , St.
Louis , MO),每钵 1株 。对照和转基因系 3和8分别移栽12株 。每 2 d浇灌 1次不含有无机磷(Pi)的 Hoag land
培养液 。植株生长 20 d后 ,采用 Gilbe rt等[ 17]的方法测定转基因系和对照的根系 APase活性 。采用 Yu等[ 18] 的
方法获得根系细胞间隙汁液后 ,同样参照采用 Gilbert等[ 17] 的方法 ,测定根系细胞间隙中的植酸酶活性 。
1. 7　植株含磷量和磷素累积量的测定
采用根系和根系细胞间隙植酸酶活性测定的植株样本 ,依据 Ames[ 19] 的方法 ,测定转基因系和对照植株的含
70 AC TA PRATACULTURAE SINICA(Vo l. 16 , No. 4) 8 /2007
磷量和植株磷累积量 。
1. 8　植株鲜重和干重的测定
同样采用根系和根系细胞间隙植酸酶活性测定的植株样本 ,测定转基因系和对照植株的鲜重和干重 。植株
干重的测定方法是 ,测定完植株鲜重后 ,将植株放置在 100℃下 30 min ,然后在 80℃下烘至恒重 。
2　结果与分析
2. 1　APase双元表达载体的构建
采用 PCR技术和特异性引物 ,从白羽扇豆 APase 的 cDNA 克隆和马铃薯 DNA 中分别扩增出 APase不含
有可能信号肽的编码阅读框(ORF)和 patatin 信号肽(sp)。构建了目的基因 APase 上游融合 patatin 信号肽的
双元表达载体(图 1)。
图 1　构建的融合马铃薯 patatin信号肽(sp)和 APase基因的双元表达载体
Fig. 1　The diagram of binary expression vector fused patatin signal peptide(sp) of
S. tuberosum and APase gene of white lupin
2. 2　转基因植株的 APase的 PCR检测
图 2　不同转基因系和对照(CK)APase的 PCR 检测
Fig. 2　PCR identification of APase in dif ferent transgenic
T. repens lines and empty vector transformed
control plants(CK)
随机选取 12个转基因株系 ,以转化空载体的植
株(CK)作对照 , 分别提取 DNA , 进行目的基因
Apase的 PCR检测 。结果表明 ,除转基因系 6外 ,
其他测试转基因系均扩增出 PCR产物 ,且扩增出的
产物与特异性目的片段的大小一致(图 2)。
2. 3　转基因植株 Apase基因的表达分析
选取对照(CK)和 PCR呈阳性的转基因系 1 ～
5和 7 ～ 9 ,进行目的基因 APase的 Northern 杂交 。
发现除转基因系 2外 ,其他测试的转基因系中均检
测到 APase基因的表达(图 3)。表明本研究中测试的多数三叶草转基因系均能表达外源目的基因 APase。在表
达水平上 ,不同转基因系之间差异很大 ,以 3的表达水平最高 ,8次之。
2. 4　转基因植株根系和细胞间隙的 APase活性
以高水平表达 APase的转基因系 3 、8和对照(CK)为材料 ,测定了上述材料在植酸盐为唯一磷供源条件下
生长 20 d后的根系和根系细胞间隙 APase活性。结果表明 , 以整个根系为测试样本时 , 转基因系的 APase活性
图 3　不同转基因系 APase和对照(CK)的 Northern杂交分析
Fig. 3　Northern blot analysis of Apase in different transgenic T. repens lines
and empty vector tansformed control plants(CK)
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3和 8较 CK 增加 26. 82%和 9. 19%(图 4A);以根系细胞间隙汁液为测试样本时 , 3和 8 的 APase活性分别较
CK 增加 4. 68和 1. 80倍(图 4B)。这表明 ,在高效表达 APase的转基因系中 , APase基因翻译产物在 patat in信
号肽的引导下大量地分泌至细胞间隙。
图 4　转基因系和对照(CK)的根系 APase活性(A)和根系细胞间隙 APase活性(B)
Fig. 4　The APase activity in whole roots(A) and root apoplasts(B) in transgenic
T. repens lines and empty vector transformed control plants(CK)
2. 5　转基因植株的含磷量和磷素累积量
对在植酸盐为唯一磷供源条件下生长 20 d的转基因系 3 、8 和 CK 植株的含磷量和植株磷素累积量测定结
果表明 ,与 CK 相比 ,转基因系 3和 8的植株含磷量分别较 CK 增加 30. 23%和 16. 28%(图 5A),植株磷素累积
量增加2. 10和0. 87倍(图5B)。转基因系 3和8在植株磷素累积量上较 CK的增加幅度明显大于在植株含磷量
上较对照的增加幅度 。这与转基因植株 CK 具有含磷量的同时 ,还表现为明显增加的植株干重有关(图 6B)。
图 5　转基因系和对照(CK)的植株含磷量(A)和植株磷素累积量(B)
Fig. 5　The phosphorus concentration(A) and accumulative phosphorus amount(B) in plants in transgenic
T. repens lines and empty vector transformed control plants(CK)
2. 6　转基因植株的鲜重和干重
与植株磷素累积量表现相似 ,在以植酸盐为唯一磷供源条件下 ,转基因系 3 和 8植株的鲜重和干重较对照
(CK)显著增加 。其中 ,转基因系 3和 8的植株鲜重较对照增加 1. 55和 0. 72 倍(图 6A),植株干重较对照增加
1. 38和 0. 61倍(图 6B)。表明由 patatin信号肽引导的超量表达的 APase ,具有分泌至根际降解根际植酸盐 、释
放出无机态磷 ,进而改善植株在有机态磷条件下生长的能力 。
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图 6　转基因系和对照(CK)的植株鲜重(A)和干重(B)
Fig. 6　The fresh weight (A) and dry weight(B) in transgenic T. repens lines
and empty vector transformed control plants(CK)
3　讨论
土壤中磷素与其他元素存在较强的交互作用 ,且易被吸附和固定 。施入农田的磷肥有 50%～ 80%的磷素被
固定 ,变为难于被植物吸收的难溶态和有机态[ 2 , 3] 。致使土壤中的磷素表现为有效性和移动性差 、难于被植物吸
收利用的特征。世界范围内许多农田 、甚至肥沃农田均出现缺磷现象[ 4] 。长期以来 ,大量施用磷肥已成为缓解土
壤磷素胁迫 、实现作物高产稳产的重要措施之一。有估测指出 ,按现有的磷肥生产能力 ,磷矿石资源将在 60 ～ 90
年内枯竭[ 4] 。因此 ,提高土壤中磷素和施用磷肥的利用效率对于农业的可持续发展具有重要作用。
前人研究表明 ,在磷胁迫条件下 ,耐低磷植物通过改变根体构型 、分泌对土壤中难溶性磷有活化作用的有机
物质在一定程度上抵御磷胁迫逆境 。在耐低磷能力强的白羽扇豆中 ,缺磷条件下 ,植株诱导出大量排根 ,根系中
酸性磷酸酶基因的表达增强 ,向根际分泌的苹果酸和柠檬酸等有机酸类物质的数量增加[ 7 , 8] 。研究发现 ,土壤中
的有机态磷含量占土壤中全磷量的一半左右[ 5] 。因此 ,提高作物根系对植酸盐的吸收能力 ,对于改善磷胁迫条件
下植株的磷素营养 ,进而提高作物对土壤难溶性磷的利用效率具有重要意义 。 Tarafdar 和 Claassen[ 20] 、Duff
等[ 21]研究表明 ,植株分泌至根际酸性磷酸酶(APase)具有分解有机态磷的能力 。磷胁迫条件下植物根系分泌的
APase的数量和活力大小与植株吸收磷的数量呈正相关[ 9 , 22] 。表明在磷胁迫下 ,植株根系向根际分泌的酸性磷
酸酶的数量增加 ,具有使土壤中的植酸盐等有机态磷活化的效果 ,在改善植株的磷素营养中具有较重要的作用。
因此 ,改善植株向根际分泌大量有活性的能分解植酸盐等有机态磷的酶类 ,如 APase和植酸酶 ,使有机态磷分解
为易于被利用的有效态磷 ,可能是增强植株抵御磷胁迫逆境的一条有效途径。
生物技术为牧草的遗传改良提供了新的手段[ 23 , 24] 。前人以植酸酶基因为靶基因 ,研究了高效表达植酸酶基
因对植物吸收有机态磷的影响 。Li等[ 14] 将黑曲霉的植酸酶基因(phyA)转入了大豆(Glycine max)的细胞悬浮
系中 ,在细胞水平上研究了重组后有活性的植酸酶在植物种属中的表达 。Xiao 等[ 16] 和 Richardson 等[ 25] 分别将
黑曲酶植酸酶基因(phy A)和截叶苜蓿(Medicago truncatula)植酸酶基因(MtPHY1)转入到模式植物拟南芥
(Arabidopsis thal iana)中 ,发现高效表达外源基因的转基因系与对照相比 ,利用植酸盐(phy tate)的能力显著增
强。Zimmermann等[ 26] 以合成的植酸酶基因为靶基因 ,建立了外源基因在植物根系中高效特异表达的马铃薯转
基因植株 ,转基因植株利用有机态磷的能力也明显增加 。上述研究为今后创建高效利用磷素的作物品种提高了
有益的指导。本项研究中 ,以磷胁迫诱导表达且翻译产物具有分泌至根际特征 、在活化土壤有机态磷可能具有重
要功能的白羽扇豆酸性磷酸酶(APase)基因为靶基因 ,通过农杆菌介导的遗传转化法获得了高效表达 APase的
白三叶草转基因系。研究表明 ,外源 APase基因能高效整合在白三叶草的基因组中 ,且多数转基因系 APase外
源基因呈高效表达。在以有机态磷(phy tate)为唯一磷供源的条件下 ,与对照相比 ,高效表达 APase的转基因系
具有明显提高植酸酶活性 、明显增加植株磷素累积量 、鲜重和干重 。此外 ,在 phy tate 为唯一磷供源条件下 ,高效
表达 APase基因的转基因系使生长介质中的植酸盐的利用效率显著增加 。表明在白三叶草以及其他相似物种
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中超量表达 APase基因 ,对于改善上述作物对土壤中高比例的有机态磷植酸盐的利用 ,进而改善植株磷素营养
具有潜在的应用前景 。
植物体内的蛋白质存在于细胞的各个部位 ,如原生质 、质膜 、细胞璧 、细胞间隙和细胞器等 。核糖体上翻译的
蛋白质通过内质网分选(so rting)后 ,在蛋白质的导肽引导下靶向细胞的特定部位[ 27] 。研究表明 ,马铃薯信号肽
序列(patatin signal peptide)的存在 ,是转真菌植酸酶(phy tase)基因的转基因细胞悬浮系 ,向细胞外分泌有活性
真菌植酸酶的前提条件;在靶基因前没有融合信号肽序列的转基因细胞悬浮系 ,失去将靶基因翻译产物向细胞外
部生长介质中分泌的能力[ 14] 。前期工作表明 ,马铃薯 patatin 信号肽具有将高效表达的来自植物种属的植酸酶
编码产物向根际高效转运的特征[ 16] 。本研究中 ,在 APase基因的编码区前以正确读码框融合 pa tatin 信号肽的
表达载体 ,超量表达 APase基因的白三叶草转基因系 ,与对照相比 ,根系细胞间隙的植酸酶活性显著增加 。表明
马铃薯 patatin信号肽能高效地将靶基因的翻译产物分泌至细胞间隙和根际 。该信号肽在今后根际分泌 APase
以及分泌其他外源基因产物的转基因研究中 ,具有重要的应用价值。
参考文献:
[ 1] 　Raghothama K G . Phosphate acquisitio n[ J] . Annual Review Plant Phy siology and P lant Mo lecular Biolo gy , 1999 , 50:665-
693.
[ 2] 　von Uexkü ll H R, Mutert E. G lobal ex tent , development and economic impact of acid soils[ J] . Plant Soil , 1995 , 171:1-15.
[ 3] 　Whitelaw M A . G row th promo tion of plants inoculated with pho sphate-so lubilizing fungi[ J] . Advances in Agronomy , 2000 ,
69:99-151.
[ 4] 　Vance C P , Uhde S C , Allan D L. Pho spho rus acquisition and use:Critical adapta tions by plants fo r securing a nonrenew able
re sour ce[ J] . New Phy to lo gist , 2003 , 157:423-447.
[ 5] 　Dalal R C. So il org anic pho sphorus[ J] . Advancse in Ag ronomy , 1977 , 29:83-117.
[ 6] 　Neumann G , Massonneau A , Mar tino ia E , et al . Phy sio log ical adaptations to phospho rus deficiency during pro teoid ro ot de-
velopment in w hite lupin[ J] . Planta , 1999 , 208:373-382.
[ 7] 　Johnson J F , Vance C P , Allan D L. Phospho rus deficiency in Lupinus albus:Altered later al r oo t development and enhanced
expression of pho sphoenolpy ruva te carboxy lase[ J] . Plant Physio lo gy , 1996 , 112:31-41.
[ 8] 　Ozaw a K , Osaki M , Matsui H , et al . Purification and proper ties o f acid pho sphatase secreted from lupin roo ts under phos-
pho rus-deficiency conditions[ J] . Soil Science and Plant Nutritio n , 1995 , 41:461-469.
[ 9] 　Go ldstein A H , Baer tlein D A , McDaniel R G. Phospha te sta rvation inducible metabolism in Lycopersicon esculentum I. Ex-
cretion o f acid phospha ta se by tomato plants and suspension-cultured cells[ J] . Plant Physio lo gy , 1988 , 87:711-715.
[ 10] 　Miller S S , Liu J , Allan D L , et al. Mo lecular contro l of acid pho sphatase secretion into the rhizo sphere o f pro teoid roo ts
f rom phospho rus-stressed w hite lupin[ J] . Plant Phy siolog y , 2001 , 127:594-606.
[ 11] 　胡迪先 , 封朝壁 , 朱邦长. 白三叶草营养动态的研究[ J] . 草业学报 , 1994 , 3(2):44-50.
[ 12] 　张振霞 , 符义坤 , 储成才. 豆科牧草基因工程研究进展[ J] . 遗传 , 2002 , 24(5):607-612.
[ 13] 　何能学 , 朱朝壁. 白三叶草种植技术及经济价值[ J] . 四川畜牧兽医 , 2003 , 30(2):42.
[ 14] 　Li J , Hegeman C E , Hanlon R W , et al . Secretion o f active r ecombinant phy tase from soybean cell-suspension cultures[ J] .
Plant Phy siolog y , 1997 , 114:1103-1111.
[ 15] 　M urray M G , Thompson W F. Rapid iso lation of high mo lecular weight plant DNA[ J] . Nucleic Acid Research , 1980 , 8:
4241-4245.
[ 16] 　Xiao K , Har rison M , Wang Z Y. T ransgenic expression of a novel M. truncatula phytase gene results in improved acquisi-
tion of o rganic phospho rus by Arabidopsis[ J] . Planta , 2005 , 222:27-36.
[ 17] 　Gilbe rt G A , Knight J D , Vance C P , et al . Acid phospha tase activity in pho sphorus-deficient w hite lupin roo ts[ J] . Plant
Cell Environment , 1999 , 22:801-810.
[ 18] 　Yu Q , Tang C , Chen Z , et al . Ex traction o f apoplastic sap f rom plant r oo ts by centrifug ation[ J] . N ew Phy to l , 1999 , 143:
299-304.
74 AC TA PRATACULTURAE SINICA(Vo l. 16 , No. 4) 8 /2007
[ 19] 　Ames P H. Assay o f inor ganic phosphate , to ta l phosphate and pho sphatases[ A] . In:Neufeld E , Ginsburg V . Methods in
Enzymology[ M] . N ew York:Academic P ress , 1966. 115-118.
[ 20] 　Tarafdar J C , Claa ssen N. O rganic pho sphorus compounds as a pho spho rus source for higher plants thr ough the activity o f
phospha tases produced by plant ro o ts and microo rg anism s[ J] . Bio log y and Fer tilized Soils , 1988 , 5:308-312.
[ 21] 　Duff S M G , Sara th G , P lax ton W C. The ro le o f acid phospha ta ses in plant phospho rus metabolism[ J] . Phy sio log ium Plant ,
1994 , 90:791-800.
[ 22] 　Haran S , Logendra S , Seskar M , et al. Characteriza tion o f Arabi dopsis acid phospha ta se promo ter and regulation of acid
phospha tase expression[ J] . Plant Physio log y , 2000 , 124:615-626.
[ 23] 　易自力 , 陈智勇 , 蒋建雄 , 等. 多年生黑麦草遗传转化体系的建立及其转化植株的获得[ J] . 草业学报 , 2006 , 15(4):1-3.
[ 24] 　刘建利 , 张占路 , 吴燕民 , 等. 百脉根农杆菌快速高效遗传转化体系的建立[ J] . 草业学报 , 2006 , 15(3):128-131.
[ 25] 　Richardson A E , H adobas P A , H ayes J E. Ex tracellula r secretion o f Aspergi llus phy tase from arabidopsis roo ts enables
plants to obtain pho sphorus fr om phy tate[ J] . Plant Journal , 2001 , 25:641-649.
[ 26] 　Zimmermann P , Zardi G , Lehmann M , et al . Eng ineering the roo t-soil inte rface via tar geted expression o f a synthe tic phy tase
gene in trichobla sts[ J] . P lant Biotechno log y Journal , 2003 , (1):353-360.
[ 27] 　Chen M H , Huang L F , Li H , et al. Signal peptide-dependent ta rge ting of a rice-amy la se and carg o pro teins to plastids and
extr acellula r compar tments of plant cells[ J] . Plant Phy sio log y , 2004 , 135:1367-1377.
Effect of ectopic expression of Lupinus albus APase gene on phosphorus uptake in Trif olium repens
GU Jun-tao1 , 2 , LI Jin-cai1 , HAN Sheng-fang1 , 2 , XIAO Kai1
(1. College of Ag ronomy , Agricultural University of Hebei , Baoding 071001 , China;2. Col lege
of Life Science , Agricul tural Univer si ty of Hebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:Transgenic Tri folium repens line s ectopic expressing the APase gene o f Lupinus albus were estab-
li shed from T. repens co tyledon explants derived f rom Agrobacterium tumef aciens-mediated methods. PCR a-
nalysis indicated that the APase gene w as integrated into the genome o f transgenic T. repens lines and No rthern
blo t results show ed that the APase gene in some transgenic T. repens lines w as expressed at high levels. It w as
also found that the t ranslated APase in transgenic T. repens lines directed by a patatin signal pept ide could be
secreted to the apoplast and the rizho sphere. Under the grow th condi tions in w hich the phy tate w as the sole
source of pho sphate , the accumulated amount o f P , f resh w eight and dry weight of t ransgenic plants w ere all
significant ly higher than tho se of the empty vecto r t ransfo rmed contro l plants(CK). Therefore , the ectopic ex-
pression of the L. albus APase can signif icantly increase the ability of T. repens to uti lize org anic pho sphate.
Key words:Tri f ol ium repens;genetic t ransfo rmation;APase gene f rom Lupinus albus;pho spho rus uptake
75第 16 卷第 4 期 草业学报 2007 年