全 文 ：北方园艺 2010(7):187 ～ 190 ·中 草药 ·
Study on the Isozyme Changes of Peroxidase of Fritillaria ussuriensis During Morphogenesis
SUN Dan1 , PIAO Xuan-chun2 , DIAO Yan-ling1 , GAO Ri2 , YU Yang3 , LIAN Mei-lan2
(1.Grop Breeding Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences , Harbin , Heilong jiang 150086;2.Key Laboratory of Natural
Resources of Changbai Mountain and Functional Molecules(Yanbian University), Ministry of Education , Yanji , Jilin 133002;3.Grop Culti-
vation Institute of Heilong jiang Academy of Agricultural Sciences , Harbin , Heilongjiang 150086)
Abstract:The current study taking Friti llaria ussuriensis Maxim.as experiment material , and the research objective
were measuring peroxidase isozyme changes in cultures of Friti llaria ussuriensis Maxim.during different stage of tissue
culture.The results showed that POD isozyme bands were stable and got highest of 8 bars and callus presented light col-
our and thin band at Rf=0.275 after forming small buldlet , while other period cultures did not have the band in cultures
during dif ferent stage of tissue culture.POD activity maximized at forming small buldlet.
Keywords:Fritillaria ussuriensis Maxim.;cultures;POD
第一作者简介:张祖荣(1966-),男 ,硕士, 重庆江津人 ,副教授 ,主
要从事植物种植类基础学科的教学与研究工作。 E-mail:yuxixu-
eyuan12@163.com。
基金项目:重庆市教委自然科学研究资助项目(kj071204);三峡库
区生态环。
收稿日期:2009-11-20
珍稀濒危黑桫椤的孢子繁殖技术初探
张祖 荣1 , 张绍 彬1 ,3
(1.重庆文理学院生命科学系,重庆永川 402168;2.西南大学生命科学学院三峡库区生态环境教育部重点实验室 ,重庆 400715;
3.重庆高校园林花卉工程研究中心,重庆 永川 402160)
摘 要:从重庆缙云山采集的华南黑桫椤和齿叶黑桫椤孢子 ,消毒处理后 ,分别播种于未经
消毒和经过消毒处理的3种培养土上 ,在保证水分条件的情况下 ,对温度和光照条件进行单因
素、三水平的分组试验。结果表明:2种黑桫椤的孢子繁殖对培养土和培养条件的要求非常一致 ,
培养土以未经消毒的原生境土为最好 ,光照条件以自然散射光照为最好 ,温度条件则以当地的自
然变温为最好;从配子体的受精到孢子体的形成是整个孢子繁殖过程的关键。
关键词:华南黑桫椤;齿叶黑桫椤;孢子繁殖
中图分类号:S 567.9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2010)07-0187-04
华南黑桫椤(Gymnosphaerametteniana)和齿叶黑桫
椤(Gymnosphaera denticulata)为桫椤科(Gyatheaceae)黑
桫椤属(Gymnosphaera)的2种蕨类植物 ,主要分布于我
国的西南和华南山区。作为第四纪冰川的孑遗植物 ,它
们同桫椤一样被称为植物界的活化石[ 1] 。它们不仅在
研究植物进化以及古代自然地理环境方面有着极其重
要的地位 ,而且还具有祛风除湿 、活血化瘀 、清热止咳等
药用价值[ 2] ,同时也是 2种极具观赏价值的大型珍稀树
状蕨类[ 3] 。由于人们对其赖以生存的森林环境的严重
破坏 ,使其本来就不多的植株数量更是逐渐减少 ,再加
上人们为了取其药用和引种观赏而对野生植株进行私
挖乱采 ,从而导致本来就十分稀少的野生资源已经处于
濒危状态[ 4] ,因此 ,这2种黑桫椤都被列入了国家二级保
护植物和限制出口物种名录[ 5] 。
目前 ,有关这 2种黑桫椤的研究较少 ,且主要集中
在资源现状与保护对策方面[ 6] 。为了进一步做好这 2
种黑桫椤的资源保护和合理利用工作 ,如何利用人工手
段来迅速增大其个体数量是当务之急。根据报道[ 7] ,对
蕨类植物的孢子进行人工繁殖 ,具有繁殖系数大 、繁殖
成本低 、变异性小等特点 ,是人工快速繁殖育苗的有效
途径 ,因此 ,课题组对这 2种黑桫椤的孢子进行了人工
繁殖试验 ,并取得了初步成果。
1 材料与方法
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1.1 试验材料
1.1.1 孢子的采集 华南黑桫椤和齿叶黑桫椤的孢子
采自重庆缙云山。孢子的采集要在孢子囊充分成熟(此
时孢子囊的颜色为黑褐色)而又没有开裂时进行 ,最好
采集羽状叶中下部的孢子 ,因为这一部位的孢子发育最
为成熟[ 8] 。将背面有成熟孢子囊的羽片剪下装入干净
的白色纸袋 ,放置于室内的通风干燥处 ,以便使孢子自
然脱落。经过 7 d左右 ,在装有孢子囊羽片的白色纸袋
外面轻轻拍打 ,以便使已经开裂的孢子囊内的孢子充分
脱落出来 ,取出羽片后把纸袋内的孢子倒在孔径为
0.2 mm 的金属筛上过筛 ,以便去除其它杂质 ,过筛后的
孢子用棕色广口瓶保存备用。
1.1.2 孢子的消毒处理 孢子在播种前最好进行消毒
处理 ,以避免有害微生物的污染。处理方法为:用滤纸
将称量好的每份为2 mg 的孢子包成小包 ,并用细线扎
紧;将孢子小包先在70%的酒精中浸泡 30 s左右 ,此时
还要用镊子将滤纸包中的气泡赶净 ,以使孢子表面完全
被酒精浸润;然后将滤纸包放入 5%的 NaClO溶液中浸
泡5～ 10 min ,捞出后用无菌水冲洗 4～ 5次;在无菌培养
皿中小心打开纸包 ,用 10 mL的无菌水将滤纸上的孢子
全部冲入培养皿中形成无菌孢子悬浮液;将培养皿中的
孢子悬浮液倒入无菌三角烧瓶中 ,并用少量无菌水把培
养皿冲洗干净后全部倒入三角瓶中。
1.1.3 播种器皿 为了便于管理和降低成本 ,播种器皿
为具有良好排水性能 、口径12 cm的白色塑料花盆 ,播种
前清洗干净 ,并用沸水浸煮 3 min左右进行消毒处理。
1.1.4 培养土 根据相关报道[ 7] ,试验选用了腐叶土 、
混合土(腐叶土 、田园土和河沙以体积比为1∶1∶1均匀
混合)以及从2种黑桫椤原生境地采来的表层土(以下
简称原生境土)等3种培养土。把这 3种培养土晾干后
用较细的土壤筛过筛 ,为了进行对比 ,过筛后的每种播
种基质平均分为 2部分 ,其中一部分不作消毒处理 ,另
一部分放入干燥箱中 ,在 120℃高温下干燥 6 h 左右进
行消毒处理。
1.2 试验方法
1.2.1 播种 把干燥的播种基质装入花盆并平整表面 ,
用盆浸法[ 9]对其进行充分湿润 ,然后用经过灭菌处理的
胶头滴管将三角瓶中的孢子悬浮液均匀地喷洒到培养
土表面。为了保证每份孢子悬浮液都能全部彻底地播
种到相应的一盆培养土中 ,三角瓶中的孢子悬浮液被播
种完后 ,还要用无菌水冲洗 3遍 ,每次冲洗下来的无菌
水和原来的孢子悬浮液一样 ,仍用原来的滴管把它们均
匀地喷洒到培养土表面 ,所用滴管要用无菌水清洗 3
遍 ,清洗下来的无菌水也要均匀地喷洒到培养土表面。
1.2.2 培养条件 从已有的研究成果来看[ 7] ,蕨类植物
在进行孢子繁殖时 ,对水分条件的要求是十分一致的 ,
但在温度和光照方面 ,因种类的不同而差异较大。为了
重点探讨温度和光照条件对华南黑桫椤和齿叶黑桫椤
孢子繁殖的影响 ,试验在保证水分条件的基础上 ,对温
度和光照条件采用了单因素、三水平的分组试验方法 ,
具体分组如图1所示。图中的 A代表经过消毒处理的
培养土 ,B代表未经消毒的培养土 ,数字代表培养土盆
数。由于 2种黑桫椤原生境的光照条件是林下荫蔽环
境的散射光照 ,所以试验的自然光照是指模拟它们原生
境光照条件的自然散射光照 ,而不是真正意义上的自然
光照;自然变温也是指与原生境温度条件差别不大的当
地自然温度条件。
图 1 2种黑桫椤孢子繁殖试验的分组示意
1.2.3 播种后的管理 培养土播种后立即按试验分组
放入相应的培养条件里进行培养和观察 ,对萌发的苔藓
和杂草要及时除去 ,出现霉菌时也要尽量清除。
1.2.4 幼苗移栽 当孢子体幼苗长出 3 ～ 4片真叶时即
可进行移栽 ,移栽基质的种类与培养土相同 ,但不进行
干燥消毒。为了便于土壤水分和空气湿度的调控 ,移栽
容器为口径 45 cm、净高 30 cm的塑料花盆 ,盆内土厚
15 cm 。幼苗移栽后用透明塑料薄膜把盆口覆盖 ,并定
时检查盆土和盆内空气湿度 ,尽量使其保持在 60%～
85%之间。移栽 30 d后统计成活率 ,并观察生长状况。
1.2.5 数据处理 对可以进行量化统计的数据采用
SAS 9.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同培养土的繁殖效果
从表 1结果看出 ,不管是华南黑桫椤还是齿叶黑桫
椤 ,3种培养土都有一定的繁殖效果 ,但它们之间又存在
明显差异。多重比较(LSD法 ,下同)结果表明 ,3种培养
土之间的配子体数量、孢子体数量和配子体到孢子体的
转化率都存在极显著差异(均值差>LSD0.01 ,下同),其
中又以原生境土最好 ,混合土次之 ,腐叶土最差。
这说明 2种黑桫椤的孢子繁殖对它们的原生境土
具有较强依赖性 ,而且对土壤条件的要求也比较严格 ,
这也可能是导致它们的自然种群难以扩大的因素之一。
2种黑桫椤在 3种培养土上的繁殖差异基本一致 ,不仅
因为它们是亲缘关系很近的同科属植物 ,而且它们在原
生境中也经常是相伴而生 ,所以生境条件基本一致。另
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外 ,在 3种培养土上 ,华南黑桫椤的繁殖效果明显好于 齿叶黑桫椤 ,这也和二者自然繁殖能力的差异相吻合。
表 1 不同培养土的繁殖效果
培养土 腐叶土 混合土 原生境土未消毒 消毒 合计 未消毒 消毒 合计 未消毒 消毒 合计
华南黑桫椤配子体数量 66.7 51.4 118.1 86.7 61.5 148.2 112.8 83.6 196.4
华南黑桫椤孢子体数量 5.6 3.1 8.7 7.9 4.2 12.1 12.8 5.9 18.7
华南黑桫椤配子体到孢子体的转化率/ % 8.4 6.1 7.4 9.1 6.9 8.2 11.3 7.1 9.5
齿叶黑桫椤配子体数量 42.7 32.5 75.2 52.8 45.6 98.4 66.7 49.2 115.9
齿叶黑桫椤孢子体数量 3.4 2.0 5.4 4.9 3.0 7.9 7.3 3.5 10.8
齿叶黑桫椤配子体到孢子体的转化率/ % 7.9 6.2 7.2 9.3 6.6 8.0 10.9 7.2 9.3
注:表中数据为每盆培养土的平均值 ,下同。
对同一培养土而言 ,经过消毒处理的和未消毒的二
者之间的繁殖效果也存在明显差异。检验结果证明 ,二
者之间的配子体数量 、孢子体数量和配子体到孢子体的
转化率都存在极显著差异( t >t0.01(18)),未消毒的培养
土明显好于经过消毒处理的培养土。这一结果和有些
观点[ 10]之间存在矛盾 ,但也和有些研究者[ 11] 的试验结
果相吻合。出现这一结果的主要原因可能是以下两个
方面:一是土壤消毒在杀灭有害微生物的同时也破坏了
培养土壤里的酶类系统 ,从而降低了土壤养分的有效
性 ,这就严重影响了没有根系而只有假根的配子体对土
壤养分的吸收和利用;二是土壤消毒杀灭了所有菌类 ,
但在温暖潮湿而又不是无菌环境的培养条件下 ,各种霉
菌的出现再所难免 ,而霉菌的出现势必会严重影响黑桫
椤孢子的整个繁殖过程 ,与之相反的是 ,在未消毒的培
养土内 ,由于长时间的相互适应 ,土壤内的各种微生物
之间已经处于相对平衡的状态 ,从而避免了霉菌的出
现 ,因此反而比经过消毒处理的培养土更有利于黑桫椤
孢子的繁殖。
2.2 不同温度条件下的繁殖效果
从表 2结果看出 ,2种黑桫椤孢子对温度变化的反
应是一致的 ,这与它们的亲缘关系及生境的一致性密切
相关。3种温度条件的繁殖效果存在明显差异 ,多重比
较结果表明 ,它们在配子体数量 、孢子体数量和配子体
到孢子体的转化率3个方面都存在极显著差异 ,其中又
以自然温度最好 ,昼夜变温次之 ,昼夜恒温最差。这一
结果说明 ,作为古老的野生蕨类植物 ,2种黑桫椤在孢子
繁殖的温度条件方面 ,已经对有规律变化的自然温度形
成了一定的依赖性 ,反而对没有变化的恒温适应起来比
较困难 ,这种影响在孢子体的形成和成活方面尤其明
显 ,表现为从配子体到孢子体的转化率非常的低下。
表 2 不同温度条件下的繁殖效果
温度条件 自然温度 昼夜变温 昼夜恒温
华南黑桫椤配子体数量 90.8 75.8 57.5
华南黑桫椤孢子体数量 10.4 6.7 2.4
华南黑桫椤配子体到孢子体的转化率/ % 11.5 8.9 4.2
齿叶黑桫椤配子体数量 62.4 56.5 29.5
齿叶黑桫椤孢子体数量 6.6 4.9 1.3
齿叶黑桫椤配子体到孢子体的转化率/ % 10.6 8.6 4.4
2.3 不同光照条件下的繁殖效果
表 3结果说明 ,3种光照条件的繁殖效果也有差异 ,
但多重比较结果表明 ,在配子体数量 、孢子体数量和配
子体到孢子体的转化率 3个方面 ,都是除了自然光照和
昼夜光照之间差异显著(均值差>LSD0.05)外 ,其余均表
现为差异不显著(均值差
照强度和光照时间的要求 ,2种黑桫椤的孢子繁殖对光
照的节律变化并无严格要求。
表 3 不同光照条件下的繁殖效果
光照条件 自然光照 白天光照 昼夜光照华
华南黑桫椤配子体数量 80.5 78.5 74.6
华南黑桫椤孢子体数量 7.0 6.5 5.8
华南黑桫椤配子体到孢子体的转化率/ % 8.7 8.3 7.8
齿叶黑桫椤配子体数量 52.5 48.3 45.2
齿叶黑桫椤孢子体数量 4.5 4.0 3.6
齿叶黑桫椤配子体到孢子体的转化率/ % 8.6 8.3 7.9
2.4 不同移栽基质的幼苗移栽成活状况
表 4结果说明 ,2种黑桫椤幼苗对土壤的反应和孢
子繁殖一样 ,也表现为对原生境土较强的依赖性和对土
壤条件的严格要求 ,但只要其它管理能满足要求 ,腐叶
土和混合土作为移栽基质也能获得较高的成活率。
表 4 不同移栽基质的幼苗移栽成活状况
移栽基质 腐叶土 混合土 原生境土
成活率(%) 67 75 92
生长状况 一般 良好 很好
图版
注:1、4分别为华南黑桫椤和齿叶黑桫椤的配子体;2、
5分别为华南黑桫椤和齿叶黑
桫椤的配子体和孢子体幼苗;3、6分别为华南黑桫椤
和齿叶黑桫椤的移栽成活小苗。
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3 讨论
3.1 条件适宜时 ,2种黑桫椤的孢子繁殖率较高
从试验结果来看 ,只要繁殖条件适当 ,2种黑桫椤的
孢子繁殖率还是较高的。因为一株成熟黑桫椤个体是
能够产生不计其数的大量孢子的 ,试验所用孢子数量只
相当于 1株成熟植株所产孢子数量的 1/4左右 ,在有些
繁殖条件很不理想的情况下 ,仍然繁殖出了 756株孢子
体幼苗。所以 ,只要繁殖条件适当 ,2种黑桫椤的孢子繁
殖率较高 ,完全可以达到经济适用的规模生产要求。
3.2 满足土壤条件和水分要求 ,自然繁殖可以成功
试验结果说明 ,除水分条件外 ,2种黑桫椤的孢子繁
殖条件都以自然条件为最好。因此 ,只要满足土壤条件
和水分要求 ,这 2种黑桫椤孢子的自然繁殖可以成功。
据此推测 ,这2种黑桫椤孢子在自然状态下繁殖率非常
低下的主要原因应该是以下两个方面:一是孢子太轻太
小 ,被风吹散后不易落到条件适宜的土壤上;二是随着
全球的气候变暖和森林植被的破坏 ,黑桫椤孢子繁殖所
要求的严格的水分条件很难得到满足。这样的发现也
给探索黑桫椤的濒危机制提供了重要的信息。
3.3 无菌条件下进行蕨类植物孢子繁殖可提高繁殖率
在试验中 ,尽管未消毒培养土的繁殖效果好于消毒
培养土 ,但在未消毒培养土的孢子繁殖过程中 ,不可避
免地出现了不少的其它植物幼苗 ,从而大大降低了培养
土应有的孢子繁殖率。如果采用消毒培养土在无菌条
件下进行孢子繁殖 ,不仅可以避免霉菌的危害 ,同时也
能消除其它植物孢子或种子萌发的影响 ,既方便了管
理 ,又能在一定程度上提高孢子的繁殖率 ,是一个更为
理想的繁殖途径。
3.4 2种黑桫椤的转化率低 ,说明受精作用很关键
从试验结果可以明显看出 ,2种黑桫椤从配子体到
孢子体的转化率都很低下 ,最高也只有 12.8%,说明从
配子体的受精到孢子体的形成是整个孢子繁殖的关键 ,
也给研究其配子体的受精机制提出了新的要求。
3.5 2种黑桫椤的配子体和孢子体幼苗十分相似 ,说明
它们的亲缘关系非常亲近
2种黑桫椤的配子体和孢子体幼苗十分相似(如图
版所示),在常规放大镜下根本看不出二者之间的差别 ,
并且它们的孢子繁殖条件也非常一致 ,这些现象都进一
步证明了二者之间有着非常亲近的亲缘关系。
参考文献
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Exploring on Spore Breeding Techniques of RareMedicining Using and Decorative
Gymnosphaeras in Severe Danger
ZHANG Zu-rong1 ,2 ,ZHANG Shao-bin1 ,3
(1.Department of Life Science , Chongqing University of Arts and Sciences , Yongchuan ,Chongqing 402168;2.Key Laboratory of Eco-environ-
mentsin Three Go rges Reservoir Region (Miristry of Education), School of Life Sciences , Southwest University , Chongqing 400715;3.
Chongqing College Garden and Flower Engineering Research Center , Yongchuan , Chongqing 402160)
Abstract:The collected spores of Gymnosphaerametteniana and Gymnosphaera denticulata from Jinyun Mountain.After
having been disinfected , we planted the spores in three kinds of cultivating soil which had been disinfected or not.Under
the condition that there had been enough water , the did single-factor and three-levels grouping experiments about the
temperature and illumination.The result showed that the cultivating soil and condition for the spores of the two Gymno-
sphaeras were just the same.The non-disinfected original surrounding soil was the best cultivating soil.The natural
scat tering ray w as the best illumination.The local natural changing temprature was the best temprature.The whole
spore breeding process f rom the impregnation of the gametophytes to the birth of the sporophytes were the key.
Keywords:Gymmosphaera metteniana;spore breeding;Gymnosphaera denticulata
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