全 文 ：第 24卷第 4期 重庆工商大学学报(自然科学版) 2007年 8月
Vol.24　No.4 JChongqingTechnolBusinessUniv.(NatSciEd) Aug.2007
收稿日期:2007-04-20;修回日期:2007-05-15。
作者简介:叶林奇(1962-), 男 ,重庆长寿人 , 讲师 ,主要从事植物生物化学研究。
　　文章编号:1672-058X(2007)04-0371-06
濒危植物桫椤过氧化物酶的分离纯化与性质
叶林奇 , 向邓云
(长江师范学院 生命科学系 ,重庆 408003)
摘　要:将齿叶黑桫椤叶片提取液经硫酸铵盐析 、透析 、DEAE-琼脂糖凝胶柱层析和
SephacrylS-200凝胶柱层析分离得到纯化的 POD,其纯化倍数为 26.29,回收率为 27.04%;通
过 SDS-PAGE法测得 POD的分子量为 43 000D;通过 IEF-PAGE法测得 POD的等电点为
4.55;齿叶黑桫椤 POD最适 pH在 4左右;最适温度在 45 ℃左右;Km值在最适温度 45 ℃、最适
pH4的条件下为 0.07 mol/L。
关键词:齿叶黑桫椤;过氧化物酶;分离纯化;性质
中图分类号:Q753　　　　文献标识码:A
桫椤科(Cyathcaceae)植物是地球上最古老的蕨类植物 ,在地球上已有 2亿多年历史 ,中生代侏罗纪
时期生长繁茂 ,但由于第四纪冰川的侵袭 ,桫椤的生存受到严重影响 ,分布范围大大缩小 ,幸存的桫椤数
量十分有限 [ 1-11] 。在 《国家重点保护野生植物名录 》中 ,已被国家列为一级保护植物 [ 12] 。
过氧化物酶 [ peroxidase, POD, EC1.11.1.7(x)]是广泛存在于各种动物 、植物和微生物体中的 ,其结构和
作用机理并不完全相同的一类含血红素的氧化酶 ,一般含有铁或铜等金属离子。其功能主要有保护细饱免
受有毒过氧化物的损害;应激高氧化环境压力;在木质素的生物降解中起重要作用;参与细胞壁和生长素合
成;负责 H2O2的清除;使植物体内的自由基维持在一个动态的正常水平 ,以提高植物的抗逆性等 [ 13-19] 。
对桫椤科植物己有较多的研究 ,多数集中在生态学 、解剖学 、繁殖生物学以及核型研究等方面 。近年
在重庆涪陵磨盘沟发现了大面积的天然桫椤林 ,已有黄建明 [ 20] 、尚进[ 21, 22]等学者对其进行调查和种群特
征和分布格局的研究 。探讨了此地区的齿叶黑桫椤的 POD分离纯化及动力学性质 ,为保护和有效利用桫
椤资源提供参考依据 。
1　实验材料与方法
1.1　材料来源
实验材料以桫椤科(Cyathcaceae)齿叶黑桫椤(Gymnosphaeradenticulata)的新鲜幼叶作样品 ,采自重
庆市涪陵区江东磨盘沟桫椤林保护区 。
1.2　主要化学试剂
三羟基氨基甲烷(Tris)为 Farco产品;丙烯酰胺(Acr);N, N′-甲叉双丙烯酰胺(Bis);DEAE-琼脂
糖 、SephacrylS-200、等电点标准品等为 AmershamPharmacia产品;其他试剂为国产分析纯 。标准蛋白为
中科院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产。
1.3　主要仪器
LKB-柱层析系统为 Pharmacia产品;F-20S冷冻干燥仪为日本 Nihon产品;高速冷冻离心机为日本
酒保公司产品;UV2100紫外可见光分光光度计为日本岛津产品;垂直平板电泳装置和等电聚焦电泳槽为
北京六一电泳仪厂生产。
1.4　样品液的制备
将采回的两种桫椤幼叶用蒸馏水冲洗干净 ,并用洁净滤纸吸干 ,按 1(样品)∶2(提取液)比例于冰浴
研磨提取 ,匀浆于 10 000g离心 30 min,取上清液加等量 40%的蔗糖液和 3%的溴酚蓝几滴作供试酶液 ,
置于 0 ～ 4℃的冰箱中备用。
1.5　POD酶活性测定
过氧化氢与酶液接触后 ,立即产生蓝色物质 ,分光光度计上光密度读数不断上升 ,但随着时间延长 ,
光密度变化减少 。在开始反应的 15 ～ 60s之内 ,光密度呈直线上升。取 15 ～ 45 s之间的光密度变化 ,按
孙文全 [ 23]联苯胺比色法测 POD酶活性的方法 ,用公式计算其活性:
E=[ ΔO.D.580 nm(45 s-15s)] ×2×总稀释倍数 。
单位为:ΔO.D.45-15 /mg/min(F.W.)
1.6　蛋白质的测定
用紫外分光光度法测定蛋白质[ 24] 。在测定中 ,利用在 280nm及 260nm下的吸收值计算蛋白质的浓度:
样品蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45A280nm -0.74A260nm)×稀释倍数
其中:A280nm是蛋白质溶液在 280nm下测得的光吸收值;A260 nm是蛋白质溶液在 260nm下测得的光吸收值。
样品总蛋白质浓度(mg)=样品蛋白质浓度(mg/mL)×样品总体积
1.7　粗酶液的提取
取重为 30.345 g幼叶 ,加入 0.05 mol/L、pH7.2磷酸缓冲液 60.69 mL,用组织捣碎机匀浆 ,于 4 ℃的
冰箱中浸提 4 h, 8 000g离心 30 min。收集上清液约 68 mL,加固体硫酸铵分级沉淀 ,取 20% ～ 60%饱和
度的沉淀对 pH7.2、0.05 ml/L的磷酸缓冲液进行透析 12 h得粗酶液。
1.8　DEAE-Sepharose离子交换柱层析
装柱(26×140)mm后先用 0.05 mol/LPBS(pH7.2)平衡层析柱。每次上样量为 10 mL。用 0 ～
0.5mol/L线形梯度的 NaCl(含 0.05 mol/LPBS, pH7.2)洗脱 ,流速 30mL。每管收集 5 mL,用 280 nm紫
外线检测每管的蛋白质含量和 POD活性 ,并将活性较高的收集管洗脱液合并 ,经透析脱盐后冷冻干燥并
测定其活性 。
1.9　SephacirylS-200凝胶过滤
装柱(16×835)mm后先用 0.05 mol/LPBS(pH7.2)平衡层析柱过夜 。每次上样量为 2 mL。用
0.1mol/L的 NaCl(含 0.05 mol/LPBS, pH7.2)洗脱 ,流速 18mL。每管收集 3 mL,用 280 nm紫外光检测
每管的蛋白质含量和 POD活性 ,并将活性较高的收集管洗脱液合并 ,经透析脱盐后冷冻干燥 ,得到纯化的
POD酶蛋白 。
1.10　分子量的测定
用 SDS-PAGE测 POD分子量 ,按杨安钢 [ 25]方法 ,凝胶浓度 12%,用考马斯亮蓝 R250染色。
样品的准备:用样品溶解液 200 μL溶解标准品 ,然后分装于 18个小离心管中。黑桫椤纯化样品也用
200μL样品溶解液溶解 ,两者均置于沸水浴中加热 5 min后 ,放入冰箱冷冻室中保存备用。使用前先置
于室温融化后 ,再沸水浴中加热 3 ～ 5 min后上样。
1.11　等电点测定
采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IEF-PAGE)。
1.12　POD部分理化性质研究
包括最适 pH、最适温度 、表观 Km值的测定。
2　实验结果
2.1　POD酶活力的测定结果
齿叶黑桫椤的 POD酶活性在 580 nm处的活性 E=(0.999-0.675)×2 ×1 000 /10=64.8 ΔO.
D.45-15 /mg/min(F.W.)。
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2.2　蛋白质浓度测定结果
在 280nm及 260 nm下的吸收值计算齿叶黑桫椤的蛋白质浓度为:
样品蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45A280nm -0.74A260nm)×稀释倍数 =(1.45×2.04-0.74×2.887 5)×
20=15.845(mg/mL)
样品总蛋白质浓度(mg)=样品蛋白质浓度(mg/mL)×样品总体积 =15.845×68=1 077.46mg
2.3　粗酶液的提取
经过硫酸铵分级沉淀后 ,放入透析袋中对 pH7.2、0.05 mL/L的磷酸缓冲液进行透析 12 h得到粗酶
液 45mL。
2.4　DEAE-Sepharose(琼脂糖)离子交换柱层析结果
测定每个收集管在 280 nm处蛋白质含量和 POD活性 ,得到一个蛋白峰和一个 POD活性峰 ,结果如
图 1所示。
图 1　黑桫椤 POD的 DEAE-琼脂糖柱层析
2.5　SephacrylS-200凝胶层析
测定每个收集管在 280nm处蛋白质含量和 POD活性 ,得其结果如图 2和表 1。经过硫酸铵分级分离
后 , SephacrylS-200凝胶柱层析后 ,比活力从 4.089 6 U/mg提高到 877.69 U/mg,纯化倍数为 26.29,回
收率是 27.04%(表 1)。
图 2　经 DEAE-琼脂糖柱分离的黑桫椤 POD的 SephacrylS-200凝胶过滤
373第 4期　　　　　　　　　　　　　　　　叶林奇 ,等:濒危植物桫椤过氧化物酶的分离纯化与性质
表 1　齿叶黑桫椤 POD的纯化
纯化步骤 总蛋白质 /mg 总活力 /U 比活力 /(U/mg) 回收率 /% 纯化倍数
粗酶液 1 077.46 4 406.40 4.089 6 100 1
硫酸铵盐析 28.422 522 18.366 11.18 4.5
透析 11.25 310 27.56 59.38 1.5
DEAE-琼脂糖层析 6.321 211 33.38 68.06 1.21
S-200层析 0.065 57.05 877.69 27.04 26.29
收集 SephacrylS-200凝胶柱层析后的活性较高的洗脱液 ,透析 、冷冻干燥 ,然后进行 SDS-PAGE测
POD分子量 、IEF-PAGE测 POD等电点以及部分动力学性质研究 。
2.6　齿叶黑桫椤 POD分子量的测定结果
齿叶黑桫椤 POD在 SDS-PAGE中呈现一条带(图 3), POD的分子量与标准品的第 3条带相当 ,约为
43 000道尔顿。这与从其他植物组织中提取的 POD的分子量接近 。
2.7　齿叶黑桫椤 POD等点点测定结果
齿叶黑桫椤 POD在 IEF-PAGE中呈现一条带(图 4), POD的分子量与标准品的第 10条带相当 ,约
为 4.55,为酸性蛋白质。
图 3　齿叶黑桫椤 POD的 SDS-PAGE图谱 图 4　齿叶黑桫椤 POD的 IEF-PAGE图谱
2.8齿叶黑桫椤 POD部分性质研究
(1)齿叶黑桫椤 POD最适 pH。实验结果见图 5,齿叶黑桫椤 POD的活力在 pH4处最强 ,故齿叶黑
桫椤 POD最适 pH在 4左右 。这与从豆壳 [ 32] 、甘蔗[ 33]等中提取的 POD的最适 pH相当 。
图 5　齿叶黑桫椤 POD的最适 pH 图 6　齿叶黑桫椤 POD的最适温度
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图 7　齿叶黑桫椤 POD的 Km值
　　(2)齿叶黑桫椤 POD最适温度 。实验结果见图 6 ,齿
叶黑桫椤 POD的活力在 45 ℃处最强 ,故齿叶黑桫椤 POD
最适温度在 45℃左右 。
(3)齿叶黑桫椤 POD的 Km值。以 0.1、0.05、0.033、
0.025、0.020 mol/L不同浓度的 H2O2与酶液在最适温度
45 ℃,最适 pH4的条件下反应 。以底物浓度的倒数为横坐
标 ,反应速度的倒数为纵坐标作 POD的 Lenewenver-burk
图 ,求得该酶的 Km值等于0.07mol/L(图 7)。
3　讨　论
桫椤科植物过氧化物酶的分离和纯化是一个非常复杂的难题 ,原因是其在叶片中的含量不高 。通过
对不同种属的桫椤叶片进行同功酶分析后 ,发现齿叶黑桫椤的 POD含量比较高 ,故以此为材料进行了分
离纯化和部分动力学性质的分析研究 。
齿叶黑桫椤幼叶的 POD酶活性很高 。实验结果显示 ,齿叶黑桫椤 POD的分子量约为 43 000道尔顿 ,
与从其他植物组织中提取的 POD的分子量接近 。齿叶黑桫椤的 POD酶的等电点约为 4.55,为酸性蛋白
质;其最适 pH在 4左右 ,这与从豆壳 、甘蔗等中提取的 POD的最适 pH相当。齿叶黑桫椤 POD最适温度
在 45℃左右 ,与一般植物的最适温度相当。该酶的 Km值等于 0.07 mol/L。由此可见 ,齿叶黑桫椤的
POD酶在一定温度及酸性条件下能有效发挥其作用 ,并保持相对稳定 。
桫椤科植物作为最古老的蕨类植物 ,在地球上已有 2亿多年的历史 ,在 《国家重点保护野生植物名
录 》中 ,已被国家列为一级保护植物。因此开展对桫椤科植物的研究 ,不论在生态学 、解剖学 、繁殖生物学
以及核型研究等方面 ,还是对其 POD进行的分离纯化研究都将有利于濒危的桫椤科植物保护。
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Purificationandpropertiesofperoxidasesfromtheendangered
speciescyathcatceae
YELin-qi, XIANGDeng-yun
(LifeScienceDepartment, ChangjiangNormalColege, Chongqing408003, China)
Abstract:Inthispaper, GymnosphaeradenticulataPODisseparatedandpurifiedfromabstractedliquidof
Gymnosphaeradenticulataleavesthroughsaltingprecipitaion, dialysis, DEAE-Sepharosecolumnchromatogra-
phy, SephacrylS-200 Gelfiltrationcolumnchromatography.PurifiedfoldofPODis26.29 andrecoveryrateis
27.04%.DeterminedbySDS-PAGEmethod, themolecularweightofPODisapproximately43, 000dalton.De-
terminedbyIEF-PAGE, isoelectricpointofPODis4.55.TheoptimalpHofPODisabout4.Theoptimaltem-
peratureofPODisabout45℃.TheKmvalueofPODis0.07mol/Lintheconditionof45℃andpH4.
Keywords:Gymnosphaeradenticulata;peroxidase;isolationandpurification;properties
责任编辑:田　静
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