全 文 ：收稿日期:2007-06-08;　修订日期:2007-12-22
基金项目:国家自然科学基金(No.30460045);
贵州省科技厅中药现代化专项项目(No.200440);
科技部重点项目(No.2004DFB02800)
作者简介:顾　然(1977-),男(汉族),贵州贵阳人,现为贵阳医学院在读博
士研究生,硕士学位 ,主要从事神经分子生物学研究工作.
＊通讯作者简介:官志忠(1951-),男(汉族),江苏扬州人 ,现任贵阳医学院
教授 ,博士学位 ,主要从事神经分子生物学 、中草药开发与老年性痴呆研究
工作.
当归抗 β -淀粉样蛋白
所引起的神经细胞毒性作用研究
顾　然 ,刘如玉 ,张蓝江 ,郝小燕 ,肖　雁 ,齐晓岚 ,单可人 ,任锡麟 ,官志忠＊
(贵阳医学院 ,贵州 贵阳　550004)
摘要:目的 研究当归对 β -淀粉样蛋白引起的 SH-SY5Y神经细胞中尼古丁受体亚单位在蛋白质水平降低 、细胞损伤及
脂质过氧化的拮抗作用 ,了解其神经保护作用的可能机制。方法 选取一定浓度的当归预处理 SH-SY5Y细胞后, 再加入 β
-淀粉样蛋白处理 ,用比色法测定细胞 MTT还原率 ,从细胞整体水平了解当归对细胞活性的影响;用 Westernbloting方法
测定神经型尼古丁受体亚单位(α3和 α7)蛋白表达水平的变化;用 TBA比色法测定脂质过氧化产物(丙二醛)的水平, 以了
解当归的抗氧化能力。结果 安全浓度的当归提取物能减弱 β -淀粉样蛋白引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高 , 对抗
β -淀粉样蛋白引起的 α3和 α7尼古丁受体亚单位蛋白质水平降低。结论 当归有一定的神经保护作用。
关键词:当归;　SH-SY5Y细胞;　尼古丁受体;　β -淀粉样蛋白;　脂质过氧化
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)07-1554-03
AntagonistEffectofAngelicaonNeurotoxicityInducedbyβ -amyloidPepitideinSH-
SY5YCels
GURan, LIURu-yu, ZHANGLan-jiang, HAOXiao-yan, XIAOYan, QIXiao-lan, SHANKe-ren, RENXi-lin, GUAN
Zhi-zhong＊
(DepartmentofMolecularBiologyandPathology, GuiyangMedicalUniversity, Guiyang550004, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryefectsofAngelicaontheneurotoxicityandthedecreasedexpressionofnAChRs
inducedbyb-amyloidpeptide(Ab)inhumanneuroblastoma(SH-SY5Y)cells.MethodsTheSH-SY5Ycelsweretreatedby
acertainconcentrationofangelica, andthenexposedto10mlAβ 25-35.MTTreductionassaywascarriedouttodetectthecellvi-
ability, lipidperoxidationwasmeasuredbyTBARStoobservethelevelofoxidativestress, andtheexpressionofnicotinicreceptor
α3 orα7 subunitsatproteinlevelwasdetectedbyWesternblot.ResultsAngelicaatasafety-doseinhibitedtheneurotoxicityand
theincreasedlipidperoxidation, andpreventedthedecreasedexpressionofα3andα7 nAChRsubunitproteininSH-SY5Ycells
inducedbyAβ.ConclusionAngelicacanplayanimportantroleinneuroprotection.
Keywords:Angelica;　 SH-SY5Ycells;　nAChR;　β -amyloidpepitide;　Lipidperoxidation
　　阿尔茨海默氏病(Alzheimersdisease, AD)是一种以智力缓慢
性进行性丧失为特征的神经退变性疾病 ,是痴呆病中最常见的类
型 [ 1] 。AD的病因及发病机制至今尚不十分清楚 ,目前认为 AD是
由遗传学因素 、环境因素和代谢因素等多种因素共同作用所引起
的一种疾病, 病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年
斑形成为主要特征 [ 2]。老年斑的主要成分为 β 淀粉样蛋白 (β -
Amyloidprotein, Aβ),是一种神经毒性物质 , 可损伤大脑皮层与海
马等与记忆相关脑区结构与功能 ,在 AD发病机制中起关键作用。
神经型尼古丁乙酰胆碱受体 (Nicotinicacetylcholinereceptor,
nAChR)(或称尼古丁受体)与学习和记忆等认知功能密切相关 ,
并具有明显的神经保护作用 [ 3 , 4] 。在较早的一些研究中就发现 ,
AD患者大脑皮层尼古丁受体出现持续的和严重的丢失, 大脑皮层
的尼古丁受体缺失与 AD患者的认知障碍有显著的相关性。当归
为伞形科植物当归(Angelicasinensis)的干燥根 ,当归入药 , 历史悠
久 ,应用广泛 ,有 “十方九归”之说。近年很多研究表明以当归作
为主要药材的复方中药制剂具有改善痴呆小鼠学习记忆障碍的作
用 [ 5 , 6] ,但是当归所起的作用及其相关机制目前还不清楚。因此本
研究用 Aβ25-35处理来源于人脑的 SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞
作为研究对象, 以初步了解当归对 Aβ 引起的尼古丁受体表达降
低及细胞毒性损害的拮抗作用 , 为当归在 AD治疗中的应用提供
理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂 当归药材产于甘肃 ,购于贵阳市三桥药材市场,
经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定。当归水煮提取物制剂由贵阳医
学院药学院提供 , 浓度为:1g生药 /ml;源于人脑的神经母细胞瘤
细胞株(SH-SY5Y细胞)购自 GermanColectionofMicroorganisms
andCelCultures公司;Aβ25-35购自 Sigma公司;DMEM培养液购自GibcoIntrovagen公司;小牛血清购自华美公司;MTT比色法主要试
剂购自 Sigma公司;羊抗 a3、a7及鼠抗 β -肌动蛋白(β -Actin)
多克隆抗体及 HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自 SantaCruzBio-
technology公司;聚乙烯二氟(PVDF)膜 、ECL-Plus发光试剂 、高效
显影胶片购自Amersham公司;TBA比色法试剂盒购自南京建成公
司;其它化学试剂均购自 Sigma公司。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养 用含 10%小牛血清 、双抗(青霉素 25 U/ml, 链
霉素 25 U/ml)的 DMEM作为培养基 , 5%CO2 、饱和水气、37℃恒温
培养。
1.2.2　3-4, 5-二甲基噻唑 -2, 5-二酚四唑溴化物 [ 3-(4, 5-
dimethyl-thiazol-2 -yl)-2, 5 -diphenyltetrazoliumbromide,
MTT]比色法筛查中药安全浓度 比色法测定 MTT水平 [ 7] , 测定波
长为 490 nm, 常用来表示细胞的损伤程度和功能状况。
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 7期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.7　
向 96孔细胞培养板中 ,加入一定数量(约 1×104 /孔)待检测
细胞 ,加入当归水煮提取物 ,终浓度分别为:0, 0.05, 0.25, 0.5, 1, 2.
5, 5, 10, 25mg/ml培养 24 h后测定 MTT水平。
1.2.3　细胞分组诱导及相应的药物干预
对照组:不经药物处理 ,培养期为 48h。
Aβ 处理组:在培养的细胞中加入 10 μMAβ
25-35 ,培养时间为
48h(细胞培养前将 Aβ 25-35用 PBS溶解后 , 37℃孵育 3～ 4h,以保证
获得有毒性作用的聚集性 Aβ)。
单纯中药处理组:加入中药培养 48 h。
中药和 Aβ处理组:先加入中药培养 24h后 , 再按照 Aβ处理
组的方法进行处理。
1.2.4　药物处理后MTT还原率测定 向 96孔细胞培养板中, 加入
一定数量(约 1×104 /孔)待检测细胞 , 分组药物处理细胞后测定
MTT水平。
1.2.5　尼古丁受体亚单位蛋白表达测定 参照 Guan等 [ 8]的方法
进行提取细胞膜蛋白及用蛋白印迹(Westernbloting)方法检测尼
古丁受体 α3, α7亚单位蛋白水平。以 Labworks软件分析结果时
以 β -Actin蛋白条带作为内参照 ,计算 α3, α7蛋白条带与 β -Ac-
tin蛋白条带像素灰度的百分比值作为 α3, α7亚单位蛋白质表达
的相对计量水平比。
1.2.6　脂质过氧化水平测定 收集培养神经细胞的培养液 ,测定
丙二醛(脂质过氧化的中间产物)含量 , 测定波长为 532 nm,操作
按照试剂盒说明书进行。
1.2.7　统计学分析 将每组所得结果用 x±s表示, 结果用
SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析。
2　结果
2.1　中药安全浓度筛查 当归水煮提取物浓度 >5mg/ml时 SH-
SY5Y神经细胞 MTT还原率出现下降趋势 , 浓度 >10 mg/ml时细
胞 MTT还原率明显降低, 表明当归浓度过高对细胞有毒性作用。
因此选择 2.5mg/ml作为本次研究当归水煮提取物的安全浓度。
见图 1。
　　以不同浓度的当归水煮提取物处理细胞 24 h,测定SH-SY5Y神经细胞 MTT还
原率 ,结果用单因素方差分析法统计分析(n=6), ＊＊表示与对照组相比差异有统计
学意义(P<0.01)
图 1　经不同浓度当归水煮提取物处理的SH-SY5Y神经细胞MTT还原率
2.2　药物处理后 MTT还原率 药物处理后测定 MTT还原率测
定发现 , 10 μMAβ25-35处理细胞后引起 MTT还原率明显降低;
2.5mg/ml当归处理不影响细胞功能;而用当归预处理细胞后可
减弱 Aβ 对细胞的毒性作用 , Aβ组与当归 +Aβ 组之间的差异有
统计学意义(P<0.01)。见图 2。
2.3　尼古丁受体蛋白表达水平
2.3.1　尼古丁受体 α7亚单位蛋白质表达水平半定量结果 10
μMAβ 25-35处理细胞后引起尼古丁受体 α7亚单位蛋白质表达水
平明显降低;2.5 mg/ml当归处理不影响该受体蛋白水平;而用
当归预处理细胞后可减弱 Aβ对细胞 α7亚单位蛋白质表达水平
的下调作用 , Aβ组与当归 +Aβ 组之间的差异有统计学意义(P
<0.01)。见图 3。
　　细胞分组及相应的药物处理后 ,测定SH-SY5Y神经细胞 MTT还原率 ,结果用
单因素方差分析法统计分析(n=6), ＊表示与对照组相比差异有统计学意义(P<
0.05), ＊＊表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。 Con:对照组;Aβ:Aβ
处理组;AS:单纯当归处理组;AS+Aβ:当归和 Aβ处理组
图 2　SH-SY5Y神经细胞药物处理后 MTT还原率
　　细胞分组及相应的药物处理后 ,用Westernbloting法测定 SH-SY5Y神经细胞
α7尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平 ,结果用单因素方差分析法统计分析(n=
6), ＊表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05), ＊＊表示与对照组相比差异
有统计学意义(P<0.01)。 Con:对照组;Aβ:Aβ处理组;AS:单纯当归处理组;AS+
Aβ:当归和Aβ处理组;α7:α7尼古丁受体亚单位;β -Actin:β -肌动蛋白。上方为
统计分析结果 ,下方分别为α7和 β -ActinWesternbloting结果
图 3　SH-SY5Y神经细胞药物处理后尼古丁受体α7亚单位蛋白质表达水平
2.3.2　尼古丁受体 α3亚单位蛋白质表达水平半定量结果 10
μMAβ 25-35处理细胞后引起尼古丁受体 α3亚单位蛋白质表达水
平明显降低;2.5 mg/ml当归处理不影响该受体蛋白水平;而用
当归预处理细胞后可减弱 Aβ对细胞 α3亚单位蛋白质表达水平
的下调作用 , Aβ 组与当归 +Aβ 组之间的差异有统计学意义(P
<0.01)。见图 4。
　　细胞分组及相应的药物处理后 ,用Westernbloting法测定 SH-SY5Y神经细胞
α3尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平 ,结果用单因素方差分析法统计分析(n=
6), ＊表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05), ＊＊表示与对照组相比差异
有统计学意义(P<0.01)。 Con:对照组;Aβ:Aβ处理组;AS:单纯当归处理组;AS+
Aβ:当归和Aβ处理组;α3:α3尼古丁受体亚单位;β -Actin:β -肌动蛋白。上方为
统计分析结果 ,下方分别为α3和 β -ActinWesternbloting结果
图 4　SH-SY5Y神经细胞药物处理后尼古丁受体α3亚单位蛋白质表达水
平
2.4　TBA法测定 MDA水平 结果表明 , 10 μMAβ 25-35处理细胞
后引起细胞脂质过氧化水平明显升高;2.5 mg/ml当归处理不影
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.7 时珍国医国药 2008年第 19卷第 7期
响 MDA含量;而当归预处理细胞后可减弱 Aβ 所引起的脂质过
氧化水平升高 , Aβ组与当归 +Aβ 组之间差异有统计学意义(P
<0.05)。见图 5 。
　　细胞分组及相应的药物处理后 ,用 TBA法测定 SH-SY5Y神经细胞 MDA水
平 ,结果用单因素方差分析法统计分析(n=6), ＊表示与对照组相比差异有统计学
意义(P<0.05), ＊＊表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)
图 5　TBA法测定 MDA
3　讨论
目前认为 , Aβ 是一种具有神经毒性作用的物质 , 由 39 ～ 43
个氨基酸构成 , 神经毒性必需结构是 Aβ 中 25 ～ 35的氨基酸序列
(Aβ 25-35)。 Aβ 由 β -淀粉样蛋白前体蛋白(β -Amyloidpre-cursorprotein, APP)通过 β -分泌酶和 γ-分泌酶参与的 β 裂
解过程产生 [ 9] 。近来有研究表明 [ 10] , β -淀粉样蛋白造成的损
伤作用是 AD发生发展的首要因素 ,其损伤机制之一是通过增强
氧化应激反应和释放自由基产物 ,从而引起神经元受损。
本研究以 Aβ25-35处理来源于人类的 SH-SY5Y神经细胞 ,
模拟 AD患者脑内神经细胞的病理过程 ,以此作为当归水煮提取
物体外研究的类似 AD细胞模型。研究结果显示 , 与对照组相
比 , Aβ
25-35处理组 SH-SY5Y神经细胞的 MTT还原率明显降
低 , MDA水平明显升高 , 同时尼古丁受体 a3和 a7亚单位表达明
显下降。这一结果与许多文献报道是一致的 [ 8] , 表明 Aβ 25-35可
造成细胞损伤 , 细胞脂质过氧化水平升高 , 尼古丁受体表达下调 ,
这些表现与 AD患者脑内的神经细胞受损情况很类似。
尼古丁受体是神经系统中一类非第二信使介导性神经递质
结合的离子通道 , 是一类明确的具有神经保护功能的受体 , 其减
少与 AD的发生有关。 AD患者脑内尼古丁受体 -配体结合率降
低 , 其亚基的蛋白表达水平也降低。在 SH-SY5Y神经细胞中 ,
α3和 α7是主要的尼古丁受体亚单位。本研究中 , 通过测定尼
古丁受体 α3和 α7亚单位蛋白质水平发现 , Aβ 25-35能够明显降
低 α3, α7亚单位蛋白质的表达。当归水煮提取物对 Aβ 25-35所导
致的 α3, α7亚单位蛋白质表达降低有拮抗作用。实验还发现 ,
当归水煮提取物预处理的 SH-SY5Y神经细胞能够对抗 Aβ 引
起的 MTT还原率降低 , 表明该中药具有抗 Aβ 细胞毒性的作用。
对 MDA水平的测定表明 , 当归水煮提取物具有抗脂质过氧化
作用。
当归水煮提取物成分复杂 ,其抗脂质过氧化作用的机制目前
不是很清楚 ,可能与其中的有效成分(如:当归多糖 , 阿魏酸等)
能增加超氧化物歧化酶(SOD)活性 , 减少内源程序性 SOD的消
耗 , 有效地清除超氧自由基 , 减少脂质过氧化反应 , 从而降低
MDA的水平 [ 11] 。这可能也是当归拮抗 Aβ25-35引起的 α3, α7亚
单位蛋白质表达降低的机制之一。另外 , 有研究显示 , 以当归作
为主要药材之一的当归芍药散能够抑制 Aβ 聚集和形成纤维
[ 12] ,从而降低 Aβ 的毒性作用。 这可能是当归拮抗 Aβ 25-35引起α3, α7亚单位蛋白质表达降低的另一条途径。总之当归正是通
过多靶点 、多途径发挥其抗 Aβ 细胞毒性的作用。
综上所述 , 当归水煮提取物能对抗 Aβ 引起的尼古丁受体
α3和 α7亚单位蛋白质表达降低 , 对抗 Aβ 导致的细胞毒性作
用及脂质过氧化 , 在 AD的中药治疗中可能有一定疗效。 当然 ,
当归水煮提取物成分复杂 , 本研究又是体外实验 , 要了解其中
抗 Aβ 的确切成分及其抗 Aβ 的确切机制以及在体内复杂的代
谢环境中这些成分是否具有同样的抗 Aβ 作用 , 还需进一步
研究。
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