全 文 ：第 40卷　第 6期 厦门大学学报 (自然科学版 ) Vo l. 40　 No. 6
　 2001年 11月 Journal o f Xiamen Univ ersi ty ( Natural Science) Nov. 2001　
文章编号: 0438-0479( 2001) 06-1289-06
杜氏藻种间关系 RAPD分析
收稿日期: 2000-09-11
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目 ( C96004)
作者简介: 张会永 ( 1977- ) ,男 ,硕士研究生 .
通讯联系人: 刘广发
张会永 ,刘广发 ,林慧馨 ,谭　静
(厦门大学生命科学学院 ,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,福建 厦门　 361005)
摘要: 利用随机扩增多态性 DN A( RAPD)技术对 7株杜氏藻 ,即: D . salina、D . bardaw il、D .minu -
ta、D . bioculata、D . parva、D . peircei和 D . primolecta进行了遗传多态性分析 .用 30个 10聚随机引
物进行多态性扩增和筛选 ,其中 23个引物 ( 76. 67% )可获得清晰的多态性条带 .选择其中能够得到
清晰、重复性良好的 18个引物共扩增产生 150条可区分的 DNA条带 .根据种间 Nei遗传相似系数
计算分析 ,构建杜氏藻属部分种的聚类分析图 .分析结果表明: D. salina、D . bardaw il和 D .minuta
聚为一类 ,D. bioculata、D . parva、D . peircei和 D . primolecta聚为另一类 .由于两类之间存在较远的
亲缘关系 ,把这两类杜氏藻称为两个种可能更合适 .
关键词: 杜氏藻 ; RAPD;聚类分析
中图分类号: Q 949. 21 文献标识码: A　　　　　　　　　　　　　　　
杜氏藻 (Dunal iella sp. )又称盐藻 ,是一类极端耐盐的单细胞真核绿藻 ,属于真绿藻纲、杜
氏藻目、杜氏藻科、杜氏藻属 [1 ] .有些杜氏藻能够耐受环境中 NaCl浓度在 0. 05%～ 39. 4%之
间的变化 ,可以在 pH 5. 5～ 9. 5的范围内生存 ,是较好的研究渗透胁迫的生物模型 [ 2, 3] .但杜氏
藻天然地缺乏纤维素外壁 ,其质膜外仅包裹着一层薄而富有弹性的糖蛋白外被 ,而且在不同环
境中其细胞形态变化较大 ,因此难以从形态学上对它们进行分类 . 1990年 , J. G. K. Williams
等首先建立随机扩增多态性 DNA( RAPD)技术 ,随后该技术在生物遗传多样性和生物系统演
化的研究上得到广泛应用 ,大大促进了生物种间、品种间不同基因组的鉴定、分类以及遗传和
进化等方面的研究 [4～ 6 ] .本文选用 7株杜氏藻 ,利用 RAPD方法对其进行分析 ,以期从生物的
遗传本质 DNA入手 ,为杜氏藻的鉴定与分类归属问题提供分子生物学借鉴 .
1　材料和方法
1. 1　 7株供试杜氏藻学名
见表 1.
1. 2　培养方法
以 Ben-Amotz的人工海水 (含 NaCl 1. 5 mo l /L) [7 ]在 60μE· M- 2· S- 1光照下将杜氏藻
培养至指数生长中期 ,不时摇动 .在上述培养基中加入 1. 5%的琼脂即成为杜氏藻固体培养
基 .
表 1　供试杜氏藻名称、代号及来源
Tab. 1　 The names and sources of the species of Dunaliella inv estig ated
杜氏藻 D . salina D . bardaw il D .minuta D .bioculata D . parva D. peircei D. primolecta
代　号 1 2 3 4 5 6 7
　　　　注: D . bardaw il系以色列 M. Ginzburg博士惠赠 ,其它 6株杜氏藻均购自青岛海洋大学 .
1. 3　藻种纯化
用以下两种方法对杜氏藻进行纯化:
( 1)将藻液进行一定稀释后涂抹在固体培养基表面 ,经 10～ 14 d藻长出后 ,挑出单藻落
扩大纯培养 ; ( 2) 在上述培养液中加入庆大霉素达终浓度 0. 16 mg /ml,以杀灭可能伴生的嗜
盐细菌 .一周后将上述藻液涂布于盐细菌培养基上 ,恒温 30℃培养至少 3 d,检验除菌效果 .
1. 4　主要试剂
Taq酶、 10聚寡核苷酸随机引物、 dN TPs均购自上海生工生物工程技术服务有限公司 .本
实验共使用 30种引物 ,其中扩增条带清晰的 18个引物的代号和核苷酸序列见表 2.
1. 5　杜氏藻 DN A的提取
参照肖顺元等 [ 8 ]的方法进行 .
1. 6　 PCR扩增及电泳检测
PCR反应体系为 25μl ,其中含有 MgCl2 2. 0 mmol /L, dN T Ps 0. 1 mmol /L , Taq酶 1单
位 ,随机引物 30 ng和模板 DNA 25 ng ,混匀后滴加石蜡油 .在 PE480型扩增仪上进行 PCR扩
增 .反应程序为 94℃变性 1 min, 36℃退火 1 min, 72℃延伸 2 min, 40个循环 .最后一个循环
结束后再经 72℃延伸 7 min.将扩增产物在含有 EB的 1. 5%琼脂糖凝胶中电泳 ,在凝胶成像
系统上观察并作记录 .
1. 7　遗传相似性系数的计算及聚类分析
以“有”或“无”的方式记录可重复扩增的 DNA带 (包括强带和弱带 ) .根据 Nei和 Li的方
法计算样品间的简单遗传相似系数 I[ 9 ] ,利用 N EIGHBOR程序建立聚类分析树状图 .
2　结果与分析
2. 1　藻种纯化效果
7株杜氏藻经上述两项纯化和除菌措施后 ,各藻株的细胞大小、形态比较均匀一致 ;在盐
细菌培养基上培养多日未发现有菌长出 .以上结果说明各藻株的纯化效果很好 ,从而保证了能
够从各藻中提取到单一种质的 DNA,这是进行杜氏藻 RAPD扩增的前提和基础 .
2. 2　 DN A随机扩增和多态性分析
利用 30种随机引物进行 DNA多态性扩增 .其中 5种引物 ( 16. 67% )产生不清晰和无法
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　图 1　引物 S105 RAPD扩增图谱 (实验材料
代号见表 1, M为分子量标记 )
　 Fig . 1 　 RAPD pro file genera ted by
prime rs S105. The codes a re
the same listed in Tab. 1. M ,
molecular marke rs)
检测的产物 , 2种引物 ( 6. 67% )产生单一的带 ; 23种
引物 ( 76. 67% )能产生多态性条带 .引物 S105的扩增
结果见图 1.
从图 1可以看出 ,以引物 S105扩增后可以把 7株
杜氏藻区分为两类 ,即 D. salina , D. bardawil和 D.
minuta成为一类 ,另 4株杜氏藻聚为一类 .在第一类
中 , D. salina和 D. bardawil更为接近 ;在第二类中
D. bioculata和 D. parva相似 , D. peircei和 D. pri-
molecta几乎无异 .
遴选条带清晰、重复性良好的 18个引物进行正
式扩增 ,实验共检测到 150个位点 (表 2) ,这些 DNA
条带的分子量在 200～ 2 300 bp之间 .在 150个条带
中 ,有 13条存在于参试的全部 ( 7株 )杜氏藻中 , 137
条为多态性带 .这相当于比较了 7份供试材料的 150
个位点 ,其中 137个呈多态性 .
2. 3　遗传相似性系数的计算 ,遗传关系和聚
类结果
将每个引物中迁移率相同的带视为同源位点 ,以此处理得到 1 /0数据矩阵 ,从而获得供试
材料间的遗传相似系数 (表 3) .
2. 4　根据 Nij相似系数作出的聚类分析结果
用 PHY LIP3. 5c软件中的 UPGMA法对相似性系数进行聚类分析 ,得到聚类图 (图 2) .
上述聚类结果验证了图 1所示的可以将 7种杜氏藻划分为两类的观点 .其中 , D. salina和
D.bardawil的相似系数达到 0. 904, D. peircei和 D. primolecta的相似系数更高达 0. 964,说
明它们彼此之间的遗传学距离是非常近的 .
表 2　引物及其序列和扩增结果
Tab. 2　 A list o f primer s, their sequences and the amplifica tion results
引物 序列 总扩增带数 多态性扩增带数 引物 序列 总扩增带数多态性扩增带数
S23 AGTCAGCCAC 9 8 S125 CCGAAT TCCC 8 8
S80 ACTTCGCCAA 7 7 S126 GGGAAT TCGG 7 6
S101 GGTCGGAGAA 6 6 S127 CCGAT ATCCC 6 6
S105 AGTCGTCCCC 11 11 S128 GGGAT ATCGG 5 5
S115 AATGGCGCAG 8 7 S129 CCAAGCTTCC 11 11
S116 TC TCAGCTGG 8 7 S130 GGAAGCTTGG 11 10
S118 GAATCGGCCA 8 6 S131 T TGGTACCCC 8 8
S123 CC TGATCACC 9 7 S132 GGCTGCAGAA 8 7
S124 GGTGATCAGG 10 9 S142 GGTGCGGGAA 10 8
总计 18 150 137
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表 3　 7个杜氏藻种间 Nei相似系数
Tab. 3　 The Nei coefficients of simila rity in seven species o f the genus Dunalilla
藻 种 D . salina D . bardaw il D .minute D .bioculata D . parva D. peircei D. primolecta
D .salina 1. 000
D .bardawil 0. 904 1. 000
D .minuta 0. 759 0. 694 1. 000
D .bioculata 0. 290 0. 288 0. 329 1. 000
D . parva 0. 261 0. 279 0. 287 0. 857 1. 000
D . peircei 0. 237 0. 266 0. 246 0. 814 0. 880 1. 000
D . primolecta 0. 214 0. 268 0. 267 0. 803 0. 854 0. 964 1. 000
　图 2　用 Nei相似性系数聚类分析产生的杜氏藻属部分种的树状
分支图
　 Fig. 2　 A dendrog ram o f seven species o f the genus Dunaliella
using Nei’ s coefficients of simila rity
3　讨　论
杜氏藻为单细胞绿藻 ,除了
细胞前端具两根等长的鞭毛 ,后
端可见淀粉核外 ,缺乏其它可识
别的明显标志 ,而且细胞形态和
大小随环境条件的变更会发生明
显的变化 ,因此对它们的鉴定和
分类一直存在较大的分歧与困
难 .起初科学家以细胞形态作为
藻种鉴定的主要依据 ,导致出现
不少似是而非的藻种 . 1982年
Loeblich建议根据杜氏藻中类胡
萝卜素合成量的多少作为该藻鉴
定的重要特征 [ 7 ] .他认为 ,任何杜氏藻 ,只要在特定的条件下胞内类胡萝卜素与叶绿素的比值
大于 6∶ 1即可认定为盐生杜氏藻 (D. sal ina ) .但是从我们的实验来看 ,杜氏藻细胞形态和胞
内生化组成这两项标准都会随外环境的变更而改变 ,从而使人怀疑该准则的可靠性 .我们曾尝
试利用核型分析方法作为杜氏藻的鉴定与分类的依据 [10 ] .不过由于杜氏藻的染色体很小 ,最
大的染色体仅 1. 6μm,最小的染色体接近光学显微镜的分辨极限 ,因此观察计数杜氏藻的染
色体非常困难 ,不仅容易产生误差 ,而且实验工作量大 ,似难以此作为杜氏藻鉴定与分类的主
要标准 .因此迄今为止杜氏藻的物种鉴定和分类工作尚缺乏一个能为多数科学家接受的标准 .
以 DNA分析技术为基础的系统进化、分类学研究的不断发展 ,为深入进行杜氏藻鉴定和
分类问题提供了新的手段 .基于各物种遗传物质比较稳定的特性 ,本文对 7株杜氏藻的总
DNA进行 RAPD扩增 ,共产生 150条 RAPD扩增带 ,即从 150个位点对它们进行了检测 ,这
种优点是形态学特征、细胞学特征和 RFLP分析法所无法比拟的 .按照目前通行的 Lane &
Wang提出的观点 [11 ] ,只要生物与生物之间的遗传相似系数达到 0. 90以上 ,一般都可以认为
同属一个物种 ;系数在 0. 67～ 0. 90之间可视为种间变种 ;系数小于 0. 67则考虑以属内之不同
物种看待 .据此 ,我们认为 ,应将 D . salina和 D. bardawil归入同一个种 ,而 D. minuta则可视
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为它们的变种 (遗传相似系数 0. 694～ 0. 759) .其实在以色列藻类学家 A. Ben-Amo tz 80年代
命名一株杜氏藻为 D. bardawil (巴氏杜氏藻 )后 ,澳大利亚科学家 Borowi tzka就在 1990年提
出异议 ,认为无论从细胞大小、形态还是合成和积累 β -胡萝卜素的能力看 , D. bardawil都和
D. salina非常相似 .我们的实验也证实了他的观点 .同理 , D. peircei和 D. primolecta的遗传
相似系数高达 0. 964,它们之间几乎无异 .而它们与 D. parva和 D. bioculata的遗传相似系数
在 0. 803～ 0. 880区间 ,依据以上规则 ,可将它们作为变种对待 .
总而言之 ,通过本文的探讨 , 7株杜氏藻可以被明显地区分为两类 ,D. sal ina、D. bardawil
和 D.minuta为一类 , D. peircei、D. primolecta、D. parva和 D .bioculata为另一类 .根据这两类
杜氏藻的遗传相似系数仅在 0. 214～ 0. 329之间的实验结果以及它们合成 β -胡萝卜素能力的
显著差异 [12 ] ,本文认为 ,与其把这些杜氏藻当成 7个种 ,倒不如认定它们只是 2个种以及若干
变种更为合适 .由于杜氏藻为单倍体生物 [10 ] ,它们出现较多的突变种也在情理之中 .最后或许
可以说 ,本研究为杜氏藻的鉴定和分类提供了一种崭新的手段 .如果能够选择更多的引物进行
RAPD研究 ,则可能从中选出若干种引物作为杜氏藻藻种进行 RAPD鉴定、分类的依据 ,并在
此基础上建立比较准确可靠的杜氏藻分子鉴定、分类系统 .
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·1293·第 6期　　　　　　　　　　　　　张会永等: 杜氏藻种间关系 RAPD分析
RAPD Analysis in the Genus Dunaliella ( Chlorophy te)
ZHANG Hui-yong, LIU Guang-fa, LIN Hui-xin, T AN Jing
( The Key Lab. of Minist ry of Edu. fo r Cell Bio. and Tumour Cell engineering ,
Schoo l of Life Sci. , Xiamen Univ. , Xiamen 361005, China)
Abstract: Seven species o f Dunal iella were analy zed by using random amplified po lymo r-
phic DN A ( RAPD) techniques. Thirty decamer oligonucleo tide random primers have been
used fo r polymorphic selection. Of the 30 primers, 23 ( 76. 67% ) w ere found to produce
polymo rphic products. A total of 150 distinctiv e bands amplified f rom 18 primers w ere se-
lected fo r further Nei’ s simi lari ty co ef ficients analysis and to const ruct dendrog ram by using
U PGM A in PHLIPS prog rams. The resul ts mentioned above showed that: D. salina, D.bar-
dawil and D.minuta were clustered into one g roup, while D .bioculata , D. parva, D. peircei
and D. primolecta were clustered in ano ther one. Because o f finding fa r aw ay rela tionship be-
tw een the tw o g roups of Dunaliel la, as our opinion, it may be mo re reasonable fo r regarding
the tw o g roups as tw o species.
Key words: RAPD; Dunal iella; cluster analysis
·1294· 厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2001年