全 文 ：生 物 工 程
2014年第2期
Vol . 35 , No . 02 , 2014
复合酶解法协同超声波法提取山楂中
总黄酮的工艺条件优化
高文秀，杨艳艳，赵文卓，耿晓娇
（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林 132022）
摘 要：采用复合酶解法协同超声波法提取山楂中总黄酮。通过单因素和正交实验对工艺进行优化，优化后条件为：
复合酶量（3%纤维素酶和4%果胶酶），酶解pH为6，酶解温度为60℃，酶解时间为1.5h，乙醇浓度为70%，料液比为
1∶40g/mL，40℃超声提取30min。在此条件下的总黄酮提取量为85.5mg/g。相对超声波提取总黄酮提高了46.1%，比单纤
维素酶酶解辅助超声波法提取总黄酮量提高了27.6%。
关键词：山楂，总黄酮，复合酶，超声波提取
Optimization of composite enzymatic hydrolysis assisted ultrasonic for
extraction of favonoids compounds from hawthorn
GAO Wen-xiu，YANG Yan-yan，ZHAO Wen-zhuo，GENG Xiao-jiao
（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China）
Abstract：Total flavonoids from hawthorn were extracted by composite enzyme hydrolysis synergism ultrasonic.
Optimized the extraction conditions of flavonoids with single factor experiment and orthogonal test，the optimal
conditions of the single factor of was composite enzyme concentration：3% cellulose and 4% pectinase，pH6，
enzymolysis temperature：60℃，enzymolysis time：1.5h，ethanol concentration：70%，solid-liquid ratio：1∶40g/mL.
40℃ ultrasonic extract 30min，results showed that quantity of extract total flavonoids was 85.5mg/g under such
conditions，comparing with ultrasonic extraction，the extraction ratio by enzymatic hydrolysis synergism ultrasonic
was 46.1% higher，and 27.6% higher than enzymactic hydrolysis method.
Key words：hawthorn；total flavonoids；co-enzyme；ultrasonic extraction
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2014）02-0175-05
收稿日期：2013－05－21
作者简介：高文秀（1982-），女，硕士研究生，讲师，主要从事药物化学
及材料化学方面的研究。
山楂属蔷薇科植物，具有较高的保健和药用价
值。山楂果中含有黄酮类化合物、山楂酸、熊果酸、果
胶、有机酸、糖类以及氨基酸等30多种重要化合物。
其中黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗
肿瘤、抗糖尿病等多种药理及保健作用[1-2]。目前，对
山楂中总黄酮的提取多采用热回流法[3-4]、醇提法[5]、
超声法[6]、酶解法[7-8]，然而采用复合酶解辅以超声法
提取山楂果实中总黄酮的方法未见报道。
山楂果实中细胞壁的主要成分是果胶和纤维
素。利用果胶酶可以使细胞间的果胶质降解，把细胞
从组织内分离出来，纤维素酶可以将纤维素水解成
水溶性糖，使细胞壁水解破裂[9-10]。因此，对山楂进行
酶解预处理有利于细胞中黄酮类化合物的溶出。而
超声波振动可引起细胞内物质运动，使细胞浆流动、
细胞振荡，从而使细胞壁变薄。利于溶剂与植物细
胞内部的相互渗透，增加了有效成分在溶剂中的溶
解[6，9]。本研究通过单因素实验和正交实验探讨复合
酶酶解法协同超声波法提取山楂中黄酮的最佳工
艺，为提取山楂中黄酮提供了科学依据，为其综合利
用提供初步的工艺参数。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山楂 采于吉林省吉林市龙潭区；槲皮素 纯
度≥98%，科翔生物；纤维素酶（15000U/g）、果胶酶
（50U/g） 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、
三氯化铝 天津市大茂化学试剂厂，均为分析纯。
722N型紫外-可见分光光度计 上海欣茂仪器
有限公司；KQ-250B型数控超声仪 昆山市超声仪
器有限公司；FA2004N型电子天平 上海精密科学
仪器有限公司；DHG-9075A型电热鼓风干燥箱 上
海一恒科技有限公司；80-1型离心机 江苏金坛市
正基仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 山楂原料预处理 山楂洗净，切块，晒干，粉
碎，过80目筛，120℃干燥60min，备用。
1.2.2 标准曲线的绘制[11]
1.2.2.1 最大吸收波长的确定 精密称取干燥至恒重
的槲皮素标准品适量，用无水乙醇溶解配成120μg/mL
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2014年第2期
的溶液，精密量取此溶液4.0mL，置25mL容量瓶中，
精密加入5％三氯化铝8.0mL，加无水乙醇定容，摇匀
放置10min。另取25mL容量瓶，精密加入5％三氯化铝
8.0mL，加无水乙醇溶液至刻度，以此为空白，在波长
300～500nm之间进行扫描，确定槲皮素对照品溶液
的最大吸收波长为458nm，以此波长为测定波长。
1.2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的
槲皮素标准品适量，用无水乙醇溶解配成120g/mL的
溶液，精密吸取该溶液的1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、
12.0mL，分置25mL容量瓶中，各精密加入5％三氯化
铝的乙醇溶液8.0mL，加无水乙醇定容，摇匀放置
10min，另取一个25mL容量瓶，精密加入5％三氯化铝
的乙醇溶液8.0mL，用无水乙醇定容至刻度，以此为
空白，在458nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
求得标准曲线方程：y=0.0107x-0.0057，R2=0.9992，
故槲皮素标准品在4.8～57.6μg/mL范围内呈线性关系
良好。
1.2.3 总黄酮含量的测定 分别称取1.00g山楂粉，
置于带冷凝管的圆底瓶中，分别改变酶量、pH、乙醇
浓度、酶解温度、料液比、酶解时间，进行单因素实
验。反应结束后，置40KHz，250W超声仪中40℃处理
30min，超声两次后离心分离，将总黄酮的粗提取液
全部转移至100mL容量瓶中，加入无水乙醇溶液定
容，摇匀后作为待测样品溶液。精密量取2mL待测液
置于25mL量瓶中，用紫外—可见分光光度计在458nm
处测吸光度，然后对照标准曲线求得总黄酮浓度，最
后按照下列公式计算总黄酮提取量（mg/g）。
总黄酮提取量=[总黄酮浓度（μg/mL）×25（mL）×
100（mL）]/[2（mL）×1（g）]
1.2.4 单因素实验
1.2.4.1 纤维素酶量对总黄酮提取量的影响 加入
纤维素酶量分别为2%、3%、4%、5%、6%，70%的乙醇
溶液40mL，pH为5，50℃提取2h。反应结束后处理方
法同1.2.3。
1.2.4.2 果胶酶量对总黄酮提取量的影响 加入果
胶酶量分别为2%、3%、4%、5%、6%，70%的乙醇溶液
40mL，pH为5，50℃提取2h。反应结束后处理方法同
1.2.3。
1.2.4.3 复合酶量对总黄酮提取量的影响 加入复
合酶量分别为3%+5%、3%+4%、3%+3%、2%+5%、2%
+4%纤维素酶和果胶酶，70%的乙醇溶液40mL，pH为
5，50℃提取2h。反应结束后处理方法同1.2.3。
1.2.4.4 pH对总黄酮提取量的影响 加入复合酶量
3%纤维素酶和4%果胶酶，70%的乙醇溶液40mL，pH
分别为3、4、5、6、7，50℃提取2h。反应结束后处理方
法同1.2.3。
1.2.4.5 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响 加入复
合酶量3%纤维素酶和4%果胶酶，分别加入50%、
60%、70%、80%、90%的乙醇溶液40mL，pH为6，50℃
提取2h。反应结束后处理方法同1.2.3。
1.2.4.6 酶解温度对总黄酮提取量的影响 加入复
合酶量3%纤维素酶和4%果胶酶，70%的乙醇溶液
40mL，pH为6，分别30、40、50、60、70℃提取2h。反应
结束后处理方法同1.2.3。
1.2.4.7 料液比对总黄酮提取量的影响 加入复合
酶量3%纤维素酶和4%果胶酶，70%的乙醇溶液20、
30、40、50、60mL，pH为6，60℃提取2h。反应结束后处
理方法同1.2.3。
1.2.4.8 酶解时间对总黄酮提取量的影响 加入复
合酶量3%纤维素酶和4%果胶酶，70%的乙醇溶液
40mL，pH为6，60℃提取1、1.5、2、2.5、3h。反应结束后
处理方法同1.2.3。
1.2.5 正交实验设计 通过分析单因素实验，选取
对黄酮提取量影响大的工艺条件：纤维素酶量和果
胶酶量（A）、料液比（B）、时间（C）、酶解温度（D）。并
采用紫外-可见分光光度法对山楂样品中总黄酮的
含量进行测定，以此为指标进行比较分析，故以L9（34）
正交实验设计，见表1。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验结果
2.1.1 纤维素酶量对总黄酮提取量的影响 由图1
可知纤维素酶量在2%～3%时，随酶量增加总黄酮提
取量增大，当酶量约3%时，总黄酮提取量最大为
56.9mg/g。超过3%后总黄酮提取量不再增加，所以纤
维素酶量3%为宜。
2.1.2 果胶酶量对总黄酮提取量的影响 由图2可
知果胶酶量在2%～5%时，随着酶量增加总黄酮的提
取量随之增大，当酶量约为5%时，总黄酮提取量最
大为53.7mg/g。当酶量超过5%，随着酶量的增加总黄
酮提取量反而下降，这是因为过量的酶附着在山楂
的表面，从而影响黄酮类化合物的溶出，所以果胶酶
量选择5%为宜。
2.1.3 复合酶量对总黄酮提取量的影响 由图3可
知复合酶作用于山楂时，最佳组合为纤维素酶3%和
水平
因素
A 复合酶量
（%）
B 料液比
（g/mL）
C 时间
（h）
D 温度
（℃）
1 3.5+4 1∶30 1.0 50
2 3+4 1∶40 1.5 60
3 2.5+4 1∶50 2.0 70
表1 正交实验因素及水平表
Table 1 Factors and levels in ortbogonal array design
图1 纤维素酶量对总黄酮提取量的影响
Fig.1 Effect of cellulose amount on the content of total favonoids
2 3 4 5 6
纤维素酶量（%）
60
55
50
45
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
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图2 果胶酶量对总黄酮提取量的影响
Fig.2 Effect of pectinase amount on the content of
total favonoids
2 3 4 5 6
果胶酶量（%）
55
50
45
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
图3 复合酶量对总黄酮提取量的影响
Fig.3 Effect of composite enzyme amount on the content of
total favonoids
3+5 3+4 3+3 2+5 2+4
复合酶量（%）
65
60
55
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
图5 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响
Fig.5 Effect of ethanol concentration on the content of
total favonoids
50 60 70 80 90
乙醇浓度（%）
70
65
60
55
50
45
40
35
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
图6 酶解温度对总黄酮提取量的影响
Fig.6 Effect of enzymolysis temperature on the content of
total favonoids
30 40 50 60 70
酶解温度（℃）
75
70
65
60
55
50
45
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
果胶酶4%，得到总黄酮的最佳提取量为64.5mg/g，所
以复合酶的最佳组合为3%纤维素酶和4%果胶酶。
2.1.4 pH对总黄酮提取量的影响 由图4可知当pH
在3～6之间时，随着pH的升高总黄酮提取量随之增
大，当pH为6时，总黄酮的提取含量最大；pH超过6
后，随着pH的升高酶活性降低，总黄酮提取量反而下
降，所以pH选择6为宜。
2.1.5 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响 由图5可
知当乙醇浓度在50%～70%之间时，随着乙醇浓度的
增大总黄酮提取量随之增大，当乙醇浓度为70%时，
总黄酮的提取量最高为66.7mg/g，所以乙醇溶液浓度
选择70%。
2.1.6 酶解温度对总黄酮提取量的影响 由图6可
知当酶解温度在30～60℃之间时，随着酶解温度的升
高总黄酮提取量随之增大，总黄酮提取量最高为
74.3mg/g，但酶解温度超过60℃时，酶活性降低或部
分失活，总黄酮提取量下降，所以温度60℃为宜。
2.1.7 料液比对总黄酮提取量的影响 由图7可知
当乙醇体积在20～40mL时，随乙醇溶液体积的增大总
黄酮提取量随之增大，当乙醇溶液体积为40mL（即
料液比为1∶40）时，总黄酮的提取量最大为74.5mg/g，
但乙醇溶液体积超过40mL时，总黄酮含量反而下
降，同时增加溶剂体积消耗。所以乙醇溶液体积选择
40mL为宜，即料液比为1∶40。
2.1.8 酶解时间对总黄酮提取量的影响 由图8可
知当酶解时间在1～1.5h之间时，随着酶解时间的延
长总黄酮提取量随之增大，当酶解时间为1.5h时，总
图4 pH对总黄酮提取量的影响
Fig.4 Effect of pH on the content of total favonoids
3 4 5 6 7
pH
70
65
60
55
50
45
40
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
图7 料液比对总黄酮提取量的影响
Fig.7 Effect of solid to liquid ratio on the content of
total favonoids
1∶20 1∶30 1∶40 1∶50 1∶60
料液比（g/mL）
80
70
60
50
40
30
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
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黄酮提取量最大为87.5mg/g；但时间超过1.5h时，随
着时间的延长总黄酮提取量不再增加，这是因为时
间延长使得提取的杂质增多，所以酶解时间选择
1.5h为宜。
2.2 正交实验结果与分析
通过正交实验方法，确定影响山楂中总黄酮提
取放入主次因素及相互关系。实验结果及统计分析
见表2和表3。
由表3可知，各因素显著性依次为：D（温度）＞A
（酶量）＞B（料液比）＞C（时间）。方差分析结果表明，
酶解温度具有显著性影响，其次为复合酶量、料液
比、酶解时间影响不显著。因此山楂总黄酮较理想的
提取工艺方案是A2B2C2D2，即3%纤维素酶和4%果胶
酶，pH为6，40倍量70%乙醇，60℃酶解提取1.5h。
2.3 验证实验数据分析
以正交实验所确定的水平组合A2B2C2D2的实验
条件平行做3组验证实验，实验结果为85.5、85.6、
85.5mg/g。山楂中总黄酮平均提取含量为85.5mg/g。
2.4 提取方法对比实验
本研究采用复合酶协同超声波法提取山楂中总
黄酮，总黄酮提取量相比同条件下单独使用纤维素
酶提取法高27.6%；比单超声波提取法高46.1%。综合
上述分析，从得率和工艺条件可知，复合酶解法得率
较高，工艺相对简单，条件较温和，能够满足工业化
大生产的要求。
3 结论
本研究探索了复合酶解法协同超声波法提取山
楂中总黄酮的工艺条件优化，采用单因素实验和正
交实验考察了复合酶量、料液比、pH、酶解温度、酶解
时间等条件并对其进行优化。研究表明最佳提取条
件为：3%纤维素酶和4%果胶酶，pH为6，酶解温度为
60℃，酶解时间为1.5h，乙醇浓度为70%，料液比为
1∶40g/mL。相对纤维素酶解法提取的总黄酮含量提高
了27.6%，比单超声波法提取的总黄酮含量高46.1%。
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图8 酶解时间对总黄酮提取量的影响
Fig.8 Effect of enzymolysis time on the content of
total favonoids
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
酶解时间（h）
90
85
80
75
70
65
60
55
总
黄
酮
提
取
量
（
m
g/
g）
实验号 A B C D 总黄酮提取量
（mg/g）
1 1 1 1 1 73.80
2 1 2 2 2 85.13
3 1 3 3 3 59.54
4 2 1 2 3 63.17
5 2 2 3 1 79.05
6 2 3 1 2 83.03
7 3 1 3 2 78.12
8 3 2 1 3 60.13
9 3 3 2 1 70.41
K1 218.82 215.08 216.95 223.26
K2 225.25 224.66 219.05 246.62
K3 208.66 212.98 216.72 182.84
k1 72.823 71.697 72.320 74.420
k2 75.083 74.770 72.903 82.093
k3 69.553 70.993 72.237 60.947
R 5.53 3.19 0.70 21.26
表2 正交实验结果表
Table 2 Results of orthogonal test
黄酮提取方法 吸光度 黄酮提取量（mg/g）
复合酶解法协同超声波法 0.726 85.5
单超声波法提取黄酮 0.389 46.1
纤维素酶解法辅助超声波法 0.524 61.9
表4 提取工艺对总黄酮提取量的影响
Table 4 Influence of extraction technologies on the content of
total favonoids
（下转第182页）
表3 正交实验方差分析表
Table 3 The ANOVA of orthogonal design
因素 SS Df S F比 F临界值 显著性
A 46.381 2 23.191 58.562 19.000 *
B 24.203 2 12.102 30.559 19.000 *
C 0.792 2 0.396 1.000 19.000
D 687.592 2 343.796 868.172 19.000 *
注：F比>F临界值，具有显著性。
178
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滴定酸度的变化趋势与其他文献中相关研究所呈现
的趋势相似[10]。
2.5 林蛙油营养酸奶贮藏期内物理指标的变化
林蛙油营养酸奶在4℃条件下贮藏1、7、14、21d
的持水性、硬度和粘度的变化如图3、图4所示。
图3中，林蛙油酸奶的持水性在第1周内变化明
显（p＜0.05），随后变化减弱。这说明，在第一周内，随
着酸奶酸度和pH的大幅度变化，对酸奶凝胶的网状
结构影响较大，结构中包裹的水分大量析出。而后，
随着酸奶内乳酸菌活力的减弱，酸奶酸度指标变化
减少，对酸奶凝胶的网状结构影响减小，持水力变化
缓慢减弱。
在图4中，贮藏期内林蛙油酸奶的粘度随着贮藏
时间的增加先提高，至第二周后有所下降，这是由于
贮藏期间随着成品酸奶pH的降低，有利于酸奶凝胶
的形成，但随着时间的增加，酸奶的贮藏稳定性有所
减弱，酸奶凝胶有所破坏，乳清析出现象明显，致使
粘度有所下降[11]。与粘度有所不同，贮藏期内林蛙油
酸奶的硬度随着时间的变化逐渐增大。这说明，随
着贮藏时间的增加，林蛙油酸奶的凝胶强度并没有
减弱。
3 结论
本文确定了一种营养丰富的林蛙油酸奶配方，
并对其营养成分及在4℃贮藏21d的乳酸菌总数、pH、
滴定酸度、持水性、粘度及硬度变化进行了研究。结
果表明：林蛙油营养酸奶的最佳配方为林蛙油干品
的添加量为0.5%、脱脂乳粉为5.5%、蔗糖为6%；该林
蛙油营养酸奶风味宜人、口感细腻、酸甜适中、营养
丰富，在21d贮藏内保持着良好的稳定性，除脂肪含
量较低外，其他指标均符合国家相关要求。该林蛙油
营养酸奶的研制丰富了林蛙油及酸奶的品种，具有
一定的商业推广价值和市场前景。
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图3 林蛙油酸奶贮藏期内持水性的变化
Fig.3 Changes in holding water capability of
samples during storage
0 7 14 21
80
75
70
65
持
水
性
贮藏时间（d）
图4 林蛙油酸奶贮藏期内粘度和硬度的变化
Fig.4 Changes in viscosity and hardness of
samples during storage
0 7 14 21
8
7
6
5
4
3
粘
度
（
Pa
·
s）
粘度
贮藏时间（d）
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
硬
度
（
×1
00
g）
硬度
（上接第178页）
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