全 文 ：收稿日期:2007-01-31;修回日期:2007-03-29
基金项目:四川省杰出青年基金(05ZQ026-029)
作者简介:李世林(1982-),男,硕士 ,主要从事分子生物学及转基因植物研究.
通讯作者:曹毅.E-mail:caoyi -01@163.com
文章编号:　0490-6756(2008)02-0409-04
根癌农杆菌介导的盐生杜氏藻 DsNRT2基因
转化紫花苜蓿的初步研究
李世林 ,杨　舸 , 易秀莉 ,马　根 ,马小珍 ,李　音 ,曹　毅
(四川大学生命科学学院四川省生物信息与代谢工程共享实验平台 ,成都 610065)
摘　要:利用根癌农杆菌介导法进行紫花苜蓿遗传转化研究.将从抗逆生物盐生杜氏藻中克
隆得到的 DsNRT2(编码硝酸盐转运蛋白)导入紫花苜蓿“中苜一号”中 ,在含 50 mg/L 的卡那
霉素的培养基上获得再生苗 35 株 ,经 PCR和 Southern 杂交鉴定 , 得到 7 株阳性苗 ,表明
DsNRT2基因已整合到苜蓿的基因组中.
关键词:紫花苜蓿;DsNRT2基因;转基因植株
中图分类号:Q78　　　文献标识码:A
Transformation of alfalfa(Medicago sativa L.)by agrobacterium-mediated
process with DsNRT2 gene from Dunaliella salina
LI Shi-Lin , Y ANG Ge , Y I Xiu-Li , MA Gen , MA Xiao-Zhen , LI Y in , CAO Y i
(Sichuan Public Experiment Platfo rm o f Bioinfo rmatics and Metabolic Engineering ,
College of Life Sciences , Sichuan University , Chengdu 610065 , China)
Abstract:Alfalfa cultivar ZhongM uYiHao w as transformed w ith DsNRT2 gene from Dunaliella Salina via
Agrobacterium-mediated process.35 regenerated alfalfa plants w ere obtained on the culture medium with 50
mg/ L Kanamycin and 7 putat ive t ransgenic plants were obtained by PCR amplif ication analysis.Southern blot
analy sis has confirmed that DsN RT2 gene w as already integrated into the genome of alfalfa.
Key words:Medicago sativa L., DsNRT2 gene , t ransgenic plants
1　引　言
紫花苜蓿(Medicago sativa L .)富含蛋白质 、
多种维生素和矿物质 ,是多种家畜喜食的优质饲草
饲料 ,素有“牧草之王”的美称 ,是世界上种植面积
最大 ,应用最广泛的多年生豆科牧草 ,种植面积达
3500万 hm2[ 1-3] .自 1986年首例由农杆菌介导的
苜蓿转化获得成功以来 ,苜蓿的转基因研究取得了
很大的进展[ 4-7] .
本试验室通过同源克隆从耐盐生物盐生杜氏
藻(Dunaliel la salina)中克隆到一条硝酸盐转运蛋
白基因 ,试验表明:杜氏藻中该基因的表达和对硝
酸盐的吸收效率都随 NaCl浓度的增加而增强;结
合生物信息学分析 ,该基因是一条高亲和型硝酸盐
转运蛋白基因(DsN RT2).利用根癌农杆菌介导
法 ,把该基因导入紫花苜蓿“中苜一号”中 ,拟通过
基因工程的方法提高苜蓿在高盐条件下对硝酸盐
的吸收利用率 ,为苜蓿抗逆育种研究奠定一定的基
础.
2008年 4月 　
第 45卷第 2期　
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Apr.2008
Vol.45　No.2
2　材料与方法
2.1　实验材料
供试品种为紫花苜蓿 “中苜一号” , 种子经
0.1%升汞消毒处理后获得无菌苗;根癌农杆菌菌
株为 EHA105 ,植物表达载体 pCAMBIA2301G(含
CaMV35 S启动子和 GUS 基因)均由本实验室保
存.实验用培养基如表 1.
2.2　实验方法
2.2.1　载体的构建　从盐生杜氏藻中克隆得到的
DsN RT2基因 ,经测序正确之后 ,利用 BamH Ⅰ酶
切 , 胶回收 , 同时把载体 pCAMBIA2301G 也用
BamH Ⅰ酶切并回收 12 kb左右的片段 ,然后将两
者都经 S1 核酸酶平端化后 ,再用 DNA Ligation
Ki t Ver.2试剂盒进行连接得到表达载体 pCAM-
BIA2301G-DsNRT2(图 1).
表 1　植物培养基主要成分(mg/ L)
Tab.1　The culture medium of plants
成分 UM1 UM2 UM3 MS0
基本成分 UM UM UM MS
KT
2 , 4-D
羧卞青霉素
卡那霉素
蔗糖
植物凝胶＊
pH 值
0.25
2
———
———
30 , 000
2 , 500
5.8
0.25
2
250
50
30 , 000
2 , 500
5.8
———
250
50
20 , 000
2 , 500
5.8
———
———
250
50
30 , 000
2 , 500
5.8
植物凝胶可用 7 g/ L琼脂代替 ,在液体培养基中不加入植物
凝胶
图 1　载体 pCAMBIA2301G-DsNRT2 的构建图
F ig.1　The structure of expression vector w ith DsNRT2
2.2.2　根癌农杆菌的转化和培养　利用冻融法把
以上构建好的载体转入根癌农杆菌感受态细胞中 ,
涂布于固体培养基上(LB+利福平(40 mg/L)+链
霉素(25 mg/ L)+卡那霉素(75 mg/ L)),挑取单菌
落 ,在 2 mL 农杆菌液体培养基中 , 28 ℃培养过夜 ,
取 1 mL 以上培养物 ,加入 50 mL农杆菌液体培养
基中 ,28 ℃培养至 OD600 =1.0 ,将 50 mL 农杆菌
液经 3500 ～ 4000 r/min 离心 8 min收集菌体 ,用
UM1液体培养基重悬 , 28 ℃继续培养 3 ～ 4 h ,至
OD600=0.5.
2.2.3　紫花苜蓿的遗传转化及转化株的筛选　参
照Hanh Trinh 等[ 8]的方法有所改动 ,取苜蓿无菌
苗新长出的叶片 , 用剪刀将叶片剪出伤口后放在
UM1培养基上(防止脱水),将以上得到的叶片放
入上述农杆菌培养液中 ,在 190 r/min , 28 ℃摇床
上共培养 10 min 后 ,用无菌滤纸吸去叶片上的多
余菌液 ,置于铺有一层无菌滤纸的 UM1 培养基
上 ,用封口膜封好培养皿 , 25 ℃,于暗处共培养约
60 h ,之后依次用无菌水 、含 500 mg/ L 羧卞青霉素
的无菌水和用含 500 mg/ L羧卞青霉素的 UM1将
叶片表面农杆菌洗掉 ,然后用无菌滤纸吸干水分
后 ,放在 UM2培养基上 ,叶片边缘轻压入培养基
中 ,用封口膜封好培养皿 ,暗处培养 ,待再生芽长至
2 ～ 3 cm 时 ,切下转至 UM3培养基中生根培养 ,之
后转至无激素的 MS0培养基中继代培养 ,得到苜
蓿转化株 ,而非转化株则在含有 50 mg/L 卡拉霉
素的培养基上逐渐死亡.
2.2.4　苜蓿转化株的分子检测　随机取转化株的
叶片 ,经液氮充分研磨后 ,按 CTAB法提取 DNA 、
酚-氯仿抽提 、乙醇沉淀等步骤提取植物的总
DNA ,然后利用此作为模板进行 PCR检测转化株;
提取转化株的总 DNA 经 Hind Ⅲ酶完全酶切后 ,
进行琼脂糖凝胶电泳 ,然后把 DNA转移到尼龙膜
上 ,利用胶回收的 PCR片段作为探针 ,使用 Roche
公司的地高辛 DNA标记及杂交试剂盒 ,按照试剂
盒说明书进行 Southern杂交.
图 2　PCR检测 pCAMBIA2301G-DsNRT2
转化的农杆菌
Fig.2　PCR identification of transgenic alfalfa
M:Marker;1-6:随机挑选的单菌落
410 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
3　结果与分析
3.1　根癌农杆菌转化子的获得
在转化平板上随机挑取 6 个单菌落 , 28 ℃培
养 ,以特异引物进行 PCR检测 , PCR产物电泳结
果(图 2),1 、2 、4菌落扩增出一条特异的带且大小
一致 , 表明这些菌落均为转化子 ,质粒 pCAMBI-
A2301G-DsN RT2已转入农杆菌中.
3.2　苜蓿转化株的获得
共培养 60 h以后 ,将其转入 UM2诱导培养基
中诱导愈伤组织.叶片转入 UM2培养基中约 4 d
以后可以观察到叶盘明显长大变厚(图 3 A),叶盘
边缘开始出现愈伤组织 ,一周以后 ,整个叶盘都长
出愈伤组织 ,好的愈伤组织为乳白色固状(图 3B);
愈伤组织生长大约四周后可看到在有的愈伤组织
的表面长出一些绿色的点状胚状体产生(图 3C),
从愈伤组织到胚状体的几率大约为 40%,再过两
周后有的胚状体长出再生芽(图 3D),有的胚状体
则褐化 ,而胚状体到长出再生芽几率为 45%;待再
生芽长到 2 ～ 3 cm 时 ,将芽同其芽的底部少量的愈
伤切下转至 UM3培养基中诱导成再生苗(图 3E ,
F),过大约一周后再生苗开始生根(图 3G),生根率
大约为 50%.这时共得到无菌苗 35棵(图 3H).
图 3　农杆菌介导转基因苜蓿再生植株的形成
Fig.3　The process of transformant development
A:共培养后的叶片;B:四周诱导出愈伤组织;C:愈伤组织诱导出胚状体;D:诱导出再生芽;
E:再生芽切下放到 UM 2上;F:再生苗;G:再生苗生根;H:转基因苗
3.3　分子检测
用特异引物对得到的 35株转化株进行 PCR
扩增验证 ,有 7株检测到了特异性条带为 PCR阳
性苗 ,部分转化株的 PCR电泳结果(图 4),转化效
率为 20%左右.从 PCR检测出的 PCR阳性苗中选
了 1和 12号 ,杂交结果(图 5)显示阴性苗无杂交
条带产生 ,阳性对照有明显的杂交条带 , 1号样品
也有较明显的杂交条带 ,而 12号样品的杂交条带
信号较弱 ,可能是由于外源 DNA整合到植物基因
组中的拷贝数低 ,且地高辛标记杂交的灵敏度低造
成的.从以上结果可以看出 , 盐生杜氏藻的
DsN RT2基因已整合到 1和 12号苗的基因组了.
图 4　部分转基因苜蓿 PCR结果
Fig.4　The PCR result of some transgenic plants
1 , 2 , 5 , 8 , 11 , 12 , 15 , 22 , 30:转基因苗;
阴:非转化株;M :Marker
411第 2期 李世林等:根癌农杆菌介导的盐生杜氏藻 DsNRT2基因转化紫花苜蓿的初步研究 　
图 5　Southern 杂交结果
Fig.5　Southern blo tting
M:Marker;阳:以 pCAMBIA2301G-DsNRT2为阳性对照;
阴:以未转基因苗为阴性对照;1 、12:转基因苗
4　讨　论
在载体的构建中 ,现普遍用的是 35S启动子 ,
它能使外源基因在植物的各个部位都表达 ,但大多
数基因都存在功能定位 ,外源基因在植物体内表达
会产生许多没有功能的蛋白质 ,可能会影响植物的
正常生理代谢.植物中对硝酸盐的吸取是通过根部
细胞上的硝酸盐转运蛋白 ,下一步拟用根部特异性
表达的 rolD启动子替换组成型的 35S 启动子 ,将
DsN RT2定点转入苜蓿的根部细胞中表达 ,将不会
影响植物其它性状的改变 ,有利于对该基因功能的
研究并更能发挥该基因的功能.而对该转基因植株
的一些功能鉴定 ,如该转基因牧草的产量和质量 ,
硝酸盐的利用效率 ,抗逆性等正在通过相应的实验
验证.
参考文献:
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[ 8] 　T rinh H , Barker D , Ratet P.Module 2 Regeneration
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http://w ww .isv.cnrs-gif.fr/ emb001/ manuels/ pdf/
module2.pdf
[责任编辑:白林含]
412 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷