全 文 ：　第 26卷 第 2期
2005 年 3 月
武汉大学学报 (医学版)
Medical Journal o f Wuhan Unive rsity
Vol. 26 No. 2
Mar , 2005
作者简介:上官海娟 ,女 , 1979～ ,医学硕士生 ,主要从事高血压心肌肥厚研究
通讯作者:徐江 ,男 , 1959～ ,副教授 ,主要从事高血压心肌肥厚的研究
当归对心肌梗塞后心肌细胞凋亡
及凋亡相关基因的影响
上官海娟1 　徐　江1 　汤剑青1 　赵艳峰1 　官洪山2
1武汉大学医学院生理学系　武汉　430071
2武汉大学中南医院综合医疗科　武汉　430071)
摘要　目的:探讨当归对大鼠心肌梗塞后梗塞灶边缘区心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。方法:雄
性Wista r大鼠随机分为假手术组(Sham 组)、心梗组(MI 组)、当归干预组(MI+Angelica 组)。经结扎大鼠冠状动
脉左前降支制备心肌梗塞模型 , MI+Angelica 组于造模 24 h 后 , 每日每只大鼠腹腔注射 50%当归注射液 3. 5～ 4. 0
ml(含生药量 1. 75 ～ 2 g), MI 组和 Sham 组注射同等剂量的生理盐水 , 术后 1 , 2 , 3 , 4 周处死动物。分别采用
TUNEL 染色及免疫组织化学法检测心肌细胞凋亡数 、心肌细胞凋亡加速基因 Bax 和凋亡抑制基因 Bcl-2 的蛋白
表达水平。结果:① MI 组和 MI+Angelica组梗塞灶边缘区均有心肌细胞凋亡;但 MI+Angelica 组心肌细胞凋亡
数明显低于 MI组(P< 0. 01);②与 Sham 组相比 , MI组和 M I+Angelica组 Bax 和 Bcl-2 基因的蛋白表达均明显
升高 ,加入当归干预后 , 进一步增加 Bcl-2 基因的表达(与 MI组比 , P<0. 01),明显抑制 Bax 基因的表达(与 MI 组
比 , P<0. 01)。结论:心肌梗塞后梗塞灶边缘区有大量的心肌细胞凋亡 ,当归通过上调凋亡抑制基因 Bcl-2 和下调
凋亡加速基因 Bax的表达 , 而抑制该区的心肌细胞凋亡 , 进而减少梗塞灶边缘区心肌细胞的坏死 , 有助于心肌梗
塞的治疗和预防心肌梗塞后并发症的发生。
关键词　当归;心肌梗塞;细胞凋亡;Bax 基因;Bcl-2 基因
中图分类号　R543. 3+1　文献标识码　A　文章编号　1671-8852(2005)02-0172-04
Effects of Angelica on Myocardial Apoptosis and Expression
of Apoptosis-Associated Genes after Myocardial Infarction
Shangguan Haijuan , Xu Jiang , Tang Jianqing , et al
Dept. o f Physiolog y , School of Med icine , Wuhan University , Wuhan , 430071 China
Abstract
Objective:To inve stig ate the effects of Angelica on myocardial apopto sis and the expression
of apoptosis-associa ted genes in the infarct bo rder zone in rats w ith myocardial infarction (MI).
Methods:Male Wistar rats w ere divided into three g roups as Sham , MI and M I + Angelica
group. M I w as induced by ligating the lef t ante rio r descending co rona ry ar tery. Af te r 24 hours ,
the M I +Angelica g roup we re t reated w ith Angelica daily (2 g per rat , i. p.)while the Sham and
MI group w ere t rea ted wi th placebo (saline , i. p. ). Rats w ere sacrificed at day 7 , 14 , 21 and 28
af ter operation. Myocardial apopto sis and protein expression of Bax and Bcl-2 genes were detected
by TUNEL staining and immunohistochemistry . Results:① There w ere apoptotic myocy tes in
the infarct border zone in M I and M I+Angelica g roups , and the number of apoptot ic myocy te s
were decreased signi ficant ly in MI+A ngelica group compared w ith that in M I g roup (P <0. 01).
DOI牶牨牥牣牨牬牨牳牳牤j牣牨牰牱牨牠牳牳牭牪牣牪牥牥牭牣牥牪牣牥牨牨
　第 2 期 上官海娟 , 等.当归对心肌梗塞后心肌细胞凋亡及凋亡相关基因的影响
②Posi tive expression o f Bax and Bcl-2 genes w as markedly increased in the MI group and MI+
Angelica g roup compared wi th that in Sham group. Angelica significant ly inhibited expression of
the Bax gene (P < 0. 01) and signif icant ly upg raded Bcl-2 gene expression (P < 0. 01).
Conclusion:Myocy te apopto sis and expression of Bax and Bcl-2 genes are signif icantly increased
in rat hearts wi th M I. Angelica injection has a beneficial ef fect on t rea tment of M I because of i t s
dow nregulation of Bax gene expression and its upregulation of Bcl-2 gene expression.
Key Words　A ngelica;Myocardial Infarction;Apoptosis;Bax Gene;Bcl-2 Gene
　　传统观点认为 ,急性心肌梗塞时心肌细胞的死
亡形式是坏死 ,可最近的研究证实鼠 、兔和人类心肌
细胞在经历长时间的缺血后 , 出现明显的凋亡特
征[ 1] ,坏死是随后发生的 。细胞凋亡不仅存在于梗
塞灶中心 ,也存在于梗塞灶边缘区和远处的存活心
肌[ 2] 。凋亡的发生发展受多种基因调控 ,其中凋亡
加速基因 Bax 和凋亡抑制基因 Bcl-2被认为与细胞
凋亡密切相关[ 3] 。随着传统医学的发展 ,中药在心
血管疾病的防治中的作用越来越受到重视 ,现代医
学已证实当归不仅是一种钙拮抗剂 ,而且具有清除
氧自由基 、改善微循环 、保护缺血缺氧心肌细胞的作
用。但其对心肌梗塞后梗塞灶边缘区(Border
Zone s)的心肌细胞凋亡是否有影响 ,其影响是否与
凋亡相关基因 Bcl-2和 Bax 有关尚不清楚。本实验
旨在了解心肌细胞凋亡 、凋亡相关基因 Bcl-2和 Bax
在心梗发展过程中的改变及其当归的干预作用 ,从
而为临床上治疗心肌梗塞提供新的理论依据 。
1　材料与方法
1. 1　试剂和仪器　当归注射液由武汉大学中南医
院提供;凋亡原位末端标记检测试剂盒购自 Roche
Company;抗 Bax 单克隆抗体和抗Bcl-2单克隆抗体
购于北京中山生物技术有限公司;HX-200动物呼吸
机:成都泰盟科技有限公司;HPIAS-1000 型图像分
析系统:同济千屏影像工程公司。
1. 2　心肌梗塞模型的制备和分组　选用雄性Wist-
a r大鼠 ,体重 200 ～ 250 g(武汉大学实验动物中心提
供)。按我们报道的方法[ 4] 制备心肌梗塞模型 ,简言
之:3%戊巴比妥 (40 mg kg - 1)腹腔内麻醉动物
后 、经口气管插管 , 固定后接呼吸机。在第四肋间
逐层打开胸腔 、心包 ,暴露心脏 ,用 7-0 丝线结扎冠
状动脉左前降支 。结扎后心电图 Ⅱ导联 S T 段显著
抬高 ,左室前壁颜色变白 ,然后使肺充分膨胀排除胸
腔气体并逐层关胸。假手术组则仅穿线不结扎。动
物随机分为假手术组(Sham 组)、心肌梗塞组 (M I
组)、当归干预组(M I+Angelica 组)。MI+Angelica
组于造模 24 h后每只每日腹腔注射 50%当归注射
液 3. 5 ～ 4 m l(含生药量 1. 75 ～ 2 g),Sham 组和 M I
组注射同等剂量的生理盐水 。
1. 3　心肌组织切片制备　各组均于术后 1 , 2 , 3 , 4
周处死动物 ,取出心脏 , 0. 85%氯化钠液冲洗 , 10%
甲醛固定 24 h ,常规石蜡包埋 ,于心肌梗塞灶边缘
(梗塞灶周围 1 mm 内)沿左室轴线连续切数张
4 mm厚的切片 ,作苏木精-伊红染色 ,并行细胞凋亡
及 Bcl-2 、Bax 基因蛋白表达检测。
1. 4　心肌细胞凋亡原位末端标记检测(TDT-media-
ted dUTP Nick End Labeling , TUNEL)法 　从各组
取 6张切片 ,按试剂盒说明书操作 。①固定 、包埋切
片;②脱蜡;③消化膜蛋白及核蛋白;④加反应混
合物;⑤加入抗荧光抗体;⑥加入底物(底物混合
液:45μl NBT +35μl X-Phosphate , 溶于 10 ml缓冲
液中 , pH 8. 1 , 现配现用)显色 10 min。 ⑦复染封
片。每张切片在 400倍高倍视野 ,随机数 5个不同视
野的凋亡细胞数及细胞总数 ,计算凋亡细胞占总细胞
数的百分率为凋亡系数(Apoptotic Coefficiences)。
1. 5　心肌细胞中 Bax 、Bcl-2蛋白表达的免疫组化检
测及半定量分析　每组取 5 张石蜡切片 。主要步
骤:①二甲苯脱蜡 ,切片入水;②3 %H 2O 2水孵育 5
min ,消除内源性过氧化酶活性 , 蒸馏水清洗;③将
切片放入 0. 01 mo l(pH 6. 0)枸橼酸缓冲液中 ,置微
波炉内修复抗原 15 min;④PBS浸泡 5 min ,正常山
羊血清 37 ℃孵育 10 min ,每张切片滴加 1∶100的
Bax或 Bcl-2抗体 ,置湿盒 37 ℃孵育 30 min , PBS
漂洗 ,滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作
液 , 37 ℃孵育 15 min , PBS 漂洗 ,滴加 DAB显色剂
(过氧化酶基质3 mg+3%H2O2 12 m l+PBS 2 ml),
显微镜下观察到显色 , 水冲洗;⑤苏木精复染并拍
片。每标本测定 5张切片 ,每张切片随机选取 6个
视野 , 以视野数为单位 , 每组共 30 个视野 , 用
HAIPS-1000高清晰彩色病理图像测量系统进行测
量 ,选取 OD值(平均光密度)为半定量参数 ,测定
Bcl-2和 Bax 蛋白的表达。
173
武汉大学学报(医学版) 第 26 卷
1. 6　统计学方法　数据用均数±标准差( x±s)表
示 ,用 SPSS 6. 0软件进行统计学处理 , 组间比较用
方差分析 ,两组间比较用 q检验 , P<0. 05为差异有
显著性。
2　结果
2. 1　心肌组织的病理学改变　Sham 组各时点心肌
着色均匀 ,横纹排列整齐 ,胞膜完整 ,境界清晰 ,显示
正常心肌细胞形态;M I 组各时点心肌着色不均 ,细
胞界限不清 ,横纹消失 ,部分细胞核溶解 ,浑浊肿胀
细胞数目增多 ,并有小坏死灶征象 ,且随着时间的推
移 ,变性和坏死加重;M I+Angelica 组各时点心肌
着色相对均匀 ,排列较完整 ,浑浊肿胀细胞数较同时
点 MI 组减少 ,无小坏死灶 。
2. 2　TUNEL染色　光镜下凋亡的心肌细胞细胞核
为深浅不一的棕褐色 ,细胞轮廓清楚;正常细胞核呈
蓝色 ,坏死区细胞结构模糊不清。心肌梗塞灶边缘
区心肌细胞凋亡情况如下:Sham 组无心肌细胞凋亡
征象 ,MI+Angelica组和 MI 组均有心肌细胞凋亡 ,
且可见凋亡小体(见插页1 , 图1)。心肌细胞凋亡水
平在 M I后 1周时最高 ,并随着时间的延长而明显降
低 (与前一时点相比 P<0. 01);M I+Angelica 组梗
塞灶边缘心肌细胞凋亡均较同时点 M I 组明显降低
(P<0. 01)(见图 2)。
图 2　心肌梗塞组和当归干预组凋亡系数的比较
*与前一时点相比 , P< 0. 01;与同一时点 MI 组相比 , ﹟ P <
0. 01
2. 3 　Bax 和 Bcl-2 基因蛋白表达及图像分析 　
(表 1 、表 2)
表 1　心肌梗塞组和当归干预组 Bcl-2 OD值的比较(n=6 , x±s)
Bcl-2 1周 2周 3周 4周
心肌梗塞组 0. 117±0. 016 0. 104±0. 029 0. 102±0. 0312 0. 092±0. 014
当归干预组 0. 132±0. 087# 0. 124±0. 024# 0. 133±0. 079# 0. 143±0. 063#
　　　　　　　　#与同一时点的 MI 组相比 , P< 0. 01
表 2　心肌梗塞组和当归干预组 BaxOD值的比较(n=6 , x±s)
Bax 1周 2周 3周 4周
心肌梗塞组 0. 127±0. 072 0. 138±0. 016* 0. 173±0051* 0. 228±0. 055 *
当归干预组 0. 101±0. 083# 0. 124±0. 024*# 0. 143±0. 021*# 0. 167±0. 054*#
　　　　　　　　#与同一时点的 MI 组比较 , P< 0. 01;*与同组的前一时点相比 , P< 0. 05
　　光镜下 ,表达 Bcl-2 、Bax 蛋白的心肌细胞胞浆
内含棕黄色颗粒 , Sham 组无 Bcl-2 、Bax 蛋白阳性
表达 ,与假手术组相比 , MI 组和 M I +Angelica 组
Bcl-2 、Bax 蛋白阳性表达均增强 , 且 MI +A ngelica
组Bcl-2的表达较 MI 组明显增强 ,Bax 的表达较 M I
组明显减弱(见插页 1 , 图 3 、图 4)。M I 组边缘区
Bcl-2 OD值随时间的延长逐渐减少 , Bax OD 值随
时间延长呈明显增加趋势(与前一时点相比 , P <
0. 05)。与同时点 MI 组相比 ,M I+A ngelica组 , Bcl-
2 OD值上升(P <0. 01)(表 1), Bax OD值明显下
降 (P<0. 01)(表 2)。
3　讨论
当归是祖国传统的活血化瘀药 ,具有增加组织
血流量 ,降低氧耗 ,促进核酸 、蛋白质合成 ,改善心肌
供氧 ,缓解急性心肌缺血 ,保护缺血心肌的作用[ 5] 。
心肌细胞在经历长时间(>6 h)的缺血后 ,其梗塞灶
的中心区域主要是细胞坏死 ,伴有心肌细胞的凋亡
存在 ,而梗塞灶的边缘区则心肌细胞凋亡占显著地
位[ 2] 。本实验显示 ,MI 后梗塞灶边缘区有心肌细胞
凋亡 ,M I+Angelica 组该区的心肌细胞凋亡数均较
同时点的 M I组减少 ,提示当归可抑制梗塞灶边缘
区的心肌细胞凋亡 。
凋亡是一种受基因控制的细胞自身的程序性死
亡。其激发与抑制受多种基因调控 ,其中 Bax 基因
促进凋亡 ,Bcl-2基因抑制凋亡[ 3] 。正常情况下 ,Bcl-
2在心肌中不表达 , Bax 仅有弱表达。本实验发现 ,
M I后 1 周梗塞灶边缘区 Bcl-2表达增加 ,推测在心
肌细胞受到缺血损伤时 , Bcl-2立即启动 ,其基因产
物的表达可抑制或逆转细胞凋亡的发生 ,从而保护
174
　第 2 期 上官海娟 , 等.当归对心肌梗塞后心肌细胞凋亡及凋亡相关基因的影响
心梗早期阶段的存活细胞。同时还发现 , MI 组和
MI+Angelica 组不同时点心肌细胞内 Bax 蛋白表
达与心肌细胞凋亡数变化相一致 , Bcl-2蛋白表达与
心肌细胞凋亡数变化呈相反趋势 ,且 MI+A ngelica
组的 Bax 蛋白表达量和心肌细胞凋亡数显著低于
MI 组 ,Bcl-2蛋白表达量高于 MI 组 ,提示当归通过
上调 Bcl-2基因和下调 Bax 基因而抑制心肌细胞凋
亡。
Bcl-2蛋白表达增加致 Bax /Bcl-2比值下降则抑
制凋亡使细胞存活 ,反之 , Bax 蛋白过量表达最终使
细胞死亡[ 6] 。本实验显示 M I组和 M I+A ngelica组
不同时点心肌细胞内 Bax 蛋白表达与 Bcl-2蛋白表
达之间均呈相反趋势 ,且该趋势在 MI+Angelica 组
更明显。提示 MI 后心肌细胞的凋亡由Bax 和Bcl-2
共同调节 ,当归通过下调 Bax 和上调 Bcl-2显著降低
Bax /Bcl-2比值 ,抑制心肌细胞凋亡。Bcl-2除通过
和 Bax 形成异源二聚体来终止细胞凋亡外 ,其可能
的机制尚有:①防止受损的 DNA 激活凋亡的诱导
基因(如 P53)[ 6] ;②直接抗氧化作用或抑制氧自由
基的产生[ 7] ;③ 干扰凋亡细胞中穿越内质网膜的
Ca2+外流[ 8] ;④抑制线粒体释放细胞色素 C 和凋亡
诱导因子(apoptosis-inducing facto r , AIF)[ 9 , 10] 。综
上所述 ,心肌梗塞后 ,梗塞灶边缘区存在大量的心肌
细胞凋亡 ,且与 Bcl-2 / Bax 基因表达密切相关 ,当归
通过上调凋亡抑制基因 Bcl-2 和下调凋亡加速基因
Bax 的表达 , 而抑制该区的心肌细胞凋亡 , 进而减
少梗塞灶边缘区心肌细胞的坏死 , 有助于心肌梗塞
的治疗和预防心肌梗塞后并发症的发生 。
参考文献
1　Krijnen PAJ , Nijmeier R , Meije r CJL , et al. Apopto sis
is in myocardial ischemia and infar ction. J Clin Pa tho l ,
2002 , 55:801
2　Cheng Wei , Kajstura J , James A , e t al. P rog rammed
myocy te cell death affects the viable myocardium after in-
far ction in rats. Expe rimental Cell Research , 1996 , 226:
316
3　Yamamura T , Otani H , Nakao Y , e t al. IGF-1 differ ential-
ly regulates Bcl-xl and Bax and confers myocardial pro tec-
tion in the ra t heart. Am J Phy siol Hear t Circ Physio l ,
2001 , 280:H1 191
4　Xu J , Car reter o OA , Liu YH , et al. Role of AT2 recep-
to rs in the cardiopr otective effect o f AT1 antagonists in
mice. Hypertension , 2002 , 40(3):244
5　于敏 ,刘彬 ,刘桂霞 , 等.浅谈当归的临床应用. 长春中医
学院学报 , 1995 , 11(2):60
6　Olitv ai ZN , Milliman CL , Krosmeyer SJ. Bcl-2 heter-
modime rizes in viv o with a conse rved homolo g , Bax , that
accele rate prog rammed cell death. Cell , 1993 , 74:609
7　Armin H aunstetter , Seig o Izumo. Apopto sis:Basic
mechanisms and implica tions fo r ca rdiova scular disease.
Circ Res , 1998 , 82:1 111
8　S teuer H. Mechanisms and gene s of cellular Suicide. Sci-
ence , 1995 , 267:1 445
9　Susin S A , Zamzami N , Castedo M , et al. Bcl-2 inhibits
the mitochordrial release of an apopto genic protease. J
Exp Med , 1996 , 184:1 331
10 Rosse T , Oliv eier R , Monney L , et al. Bcl-2 P ro long s cell
surv iva l after Bax-induced release o f cy tochrome. Nature ,
1998 , 319:496
(2004-10-23收稿)
编辑　张　峻
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