全 文 ：越橘品种的 ISSR鉴定及其亲缘关系分析
於　虹 , 顾　姻 , 贺善安 , 姜燕琴
江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园), 南京 210014
摘　要:利用 ISSR分子标记对由北美引种到南京的 7个南高丛越橘品种(Vaccinium darrowi×V.corymbosum)、
9 个南高丛越橘实生选择系和 12 个兔眼越橘(V.ashei)品种共 28份材料进行分子鉴别和亲缘关系分析。 10
个引物共扩增出 98条谱带 , 其中 37 条为多态性条带 ,多态率为 37.8%。利用其中 8 个引物扩增的 17 条多态
带可以区分 19个品种和 9 个实生选择系。利用 POPGENE1.31 软件进行了 Nei′s 遗传距离计算 , 利用 UPGMA
法构建了聚类树状图。聚类结果将各类群单独聚成一大类 , 证实了它们的亲缘关系。同时显示实生选择系间
的遗传差异相对较大 ,其中 7 个与南高丛越橘品种聚为一类 ,而其余 2 个与兔眼越橘品种聚为另一大类。但
是在同一类群内各品种间的遗传关系与谱系数据不完全相吻合 , 表明本试验所用的 ISSR 引物不足以用来估
算兔眼越橘品种间的遗传关系。
关键词:越橘;品种鉴定;亲缘关系;ISSR
中图分类号:S663.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2009)05-0512-04
Identification of Blueberry Cultivars and Evaluation of Their Genetic Re-
lationship by ISSR Technique
YU Hong , GU Yin , HE Shan-an , JIANG Yan-qin
Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences of J iangsu Province , Nanjing 210014 , China
Abstract:Seven southern highbush blueberry cultivars (Vaccinium darrowi ×V.corymbosum), 9
promising selections from southern highbush blueberry seedlings , and 12 rabbiteye blueberry cultivars
(V.ashi), total 28 samples were examined with ISSR technique to construct DNA fingerprinting table to
identify these genotypes and evaluate their genetic relationship.A total of 98 bands were obtained through
10 primers , of which 37 , 37.8%, were polymorphic.17 polymorphic bands amplified from 8 premiers
were chosen to construct a DNA fingerprinting table to distinguish genotypes.POPGENE1.31 software
was used to calculate the Nei′s genetic distance and a dendrogram was constructed based on UPGMA
cluster analysis.Clusters were grouped out separately as expected.It also indicated that the genetic dis-
tances among promising selections were relatively higher than those of cultivars.Among the 9 selections ,
7 were grouped in highbush blueberry and the other 2 were included in rabbiteye blueberry group.How-
ever , estimation of relative genetic distance between cultivars(genotypes)within 1 group did not agree
well with known pedigree data and , thus , it indicated that ISSR data obtained by primers used in this
study did not accurately assess the genetic relationship of cultivars within one group.
Key words:blueberry;cultivar identification;genetic relationship;ISSR
通讯作者
基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-028 , 2006-G25),科学技术部成果推广项目(04efn215300275),南京市 2009
年第一批科技发展计划项目(200901018)
作者简介:於　虹 ,女 ,博士 ,研究员 ,主要从事小浆果栽培 、育种与生物技术研究。
收稿日期:2008-12-20　　修回日期:2009-02-28
吉林农业大学学报　2009 ,31(5):512 ～ 515 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
DOI :10.13327/j .j jlau.2009.05.018
　　种质资源的快速鉴定和亲缘关系分析是进行
资源利用和品种改良的前提和基础 。近年来分子
标记技术在果树种质鉴定 、亲缘关系分析和育种
材料早期选择等方面的应用发展较快。由于越橘
属植物的大多数种和品种为异花授粉 ,近交和自
交会引起坐果率下降 、果实偏小 、延迟成熟[ 1-2] ,因
此 ,对越橘品种遗传基础的了解和品种间亲缘关
系的确定 ,对栽培时授粉品种的选择等具有指导
意义。Myneni等利用 RAPD标记分析了 4个兔眼
越橘自然选择系和由这 4个自然选择系杂交选育
出的 15个品种间的遗传关系 ,结果表明由遗传距
离所显示的亲缘关系与谱系数据相吻合 ,同时显
示出该 15个品种有近交的趋势[ 3] 。Levi等利用
17个 RAPD引物和 7个 ISSR引物对 15个高丛越
橘 、2个兔眼越橘和 1 个南方矮丛越橘品种进行
了品种鉴别和遗传关系分析 ,结果表明利用 15个
RAPD引物和 3个 ISSR引物可以将所检测品种区
分开来 ,聚类分析结果将 3个类群品种分别聚为
一类 ,但是高丛越橘品种间的聚类结果与已知的
谱系数据不完全一致[ 4] 。为了加快越橘育种进
程 ,本研究选择在中国南方栽培的 12个兔眼越橘
品种 、7个南高丛越橘品种和 9 个笔者等选育的
南高丛越橘的实生选择系 ,利用 ISSR标记进行了
遗传分析 ,以期找出适宜作为品种鉴定标记的 IS-
SR引物 ,并检测这些引物是否能正确评价本试验
所用的品种和实生选择系间的亲缘关系 。
1　材料与方法
本研究所用植物材料共 28份 ,其中 12份为
美国引进在南京种植的兔眼越橘品种 , 7份为美
国引进在南京种植的南高丛越橘品种 , 9份为美
国引进南高丛越橘品种的实生选择系(表1)。
表 1　用于 ISSR分析的越橘材料
Table1.Materials of blueberry cultivars and selections used
for ISSR analysis
编号
No. 类型Group 品种Cult ivar
1 Sunshine
2 O′neal
3 Mistry
4 南高丛越橘 Coville
5 Ozarkblue
6 Revei lle
7 Star
续表 1
编号
No. 类型Group 品种Cultivar
8 NJ1
9 NJ2
10 NJ3
11 NJ4
12 南高丛越橘实生选择系 NJ5
13 NJ6
14 NJ7
15 NJ8
16 NJ9
17 Bluebelle
18 Baldwin
19 Choice
20 Woodard
21 Premier
22 Climax
23 兔眼越橘 Brightwell
24 Tifblue
25 Centurion
26 Gardenblue
27 Delite
28 Powderblue
新鲜叶片采集后用蒸馏水清洗 、擦干 ,并用硅
胶干燥保存。采用改良的 CTAB法[ 5]提取叶片基
因组 DNA 。模板 DNA 经紫外分光光度计测定
OD260及OD280值以检测 DNA纯度和浓度 。ISSR引
物根据加拿大 British Columbia大学公布的序列设
计 ,由上海申友生物技术有限公司合成 。从 96个
引物中筛选出 10个扩增条带较多 、信号强 、背景
清晰的引物用于 ISSR-PCR反应 ,变性温度根据
引物的 Tm 值变化1 ～ 3℃。 ISSR-PCR扩增反应
在PE-9600 PCR仪上进行 。反应条件经过比较
和优化确定。25 μL 的 PCR反应液包括模板约
60 ng , 0.3 μmol/L 引物 , 1 U Taq 酶 , 10 倍 Buffer
缓冲液 2.5 μL , 1.5 mmol/L MgCl2 , 0.25 mmol/L
dNTPs。PCR扩增条件:94℃预变性 5 min;94℃变
性 45 s ,52 ～ 55℃复性 1 min ,72℃延伸 1.5 min;45
个循环;循环结束后 72℃延伸 7 min。PCR产物在
含有 EB 的 2.0%琼脂糖凝胶中电泳 ,以 100 bp
Marker(GeneRuler100 ladder ,Fermentas UAB , Inc.)
作为标准分子量对照 ,经 EPSON(Japan)紫外自动
成像仪照相并保存图像。
电泳图谱中每一扩增条带代表引物的一对结
合位点 ,且视为有效的分子标记。同一引物的扩
增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源
性 ,依据Marker判读电泳图谱中扩增条带的有无
513於　虹等:越橘品种的 ISSR鉴定及其亲缘关系分析
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
及其分子量大小 ,将电泳图谱中有带记作“1” ,无
带记作“ 0” ,建立 0/1 数据矩阵 。应用 POPGENE
1.31软件计算多态位点百分率和 Nei′s遗传距
离。利用NTSYSpc 2.10软件进行个体 UPGMA聚
类图的构建。
2　结果与讨论
2.1　引物筛选和 ISSR多态性
由表 2可见 ,10个引物在 28份供试样品中共
扩增出 98条清晰谱带 ,其中 37条为多态性条带 ,
多态位点百分率为 37.8%。不同引物的扩增产
物呈现的多态性水平有较大差异 。其中 ,多态性
最高的为 66.7%,低的只有 14.3%。利用本试验
所用的 8个引物中扩增的 17条多态带可以将 19
个品种和 9个实生选择系区分开来(表 2)。
表 2　10个具有多态性的 ISSR引物
Table 2.10 ISSR primers with polymorphic bands
引物编号及序列
Code and sequence of primers
扩增条带数
No.of amplified bands 多态性条带数No.of polymorphic bands 多态率/ %Percentage of polymorphic bands
UBC806(TA)8G 9 3 33.3
UBC810(GA)8T 8 2 25.0
UBC831(AT)8YA 8 4 50.0
UBC842(GA)8YG 8 5 62.5
UBC846(CA)8RT 7 1 14.3
UBC853(TC)8RT 8 5 62.5
UBC859(TG)8RC 8 3 37.5
UBC860(TG)8RA 8 4 50.0
UBC873(GACA)4 6 2 33.3
UBC881(GGGGT)3 12 8 66.7
合计 Total 98 37 37.8
2.2　越橘品种间 ISSR聚类分析结果
本试验结果表明 ,19个品种和 9个实生选择
系间的遗传距离为 0.050 0 ～ 0.329 2 。其中南高
丛越橘品种间的遗传距离为 0.076 0 ～ 0.172 6 ,平
均为 0.084 0;实生选择系间的遗传距离为
0.050 0 ～ 0.232 3 ,平均为 0.101 3;兔眼越橘品种
间的遗传距离为 0.012 3 ～ 0.202 0 ,平均为 0.086。
这一结果表明南高丛越橘和兔眼越橘品种间的平
均遗传距离相似 ,而实生选择系间的遗传距离较
大 ,这种实生后代的分离现象 ,可为新品种选育提
供更多的选择机会。
现有越橘推广品种均是按照果实大小 、果色 、
风味 、生长势 、丰产和早熟特性等目标选育出来
的[ 3] 。兔眼越橘是由 5个四倍体种杂交而成的六
倍体种 ,通过谱系分析已知 ,大部分的兔眼越橘推
广品种实际上只包含了 4 个自然选系 ———
“Ethel” 、“Clara” 、“Myers”和“Black Giant”的遗传基
础[ 6] 。南高丛越橘的亲本主要是北高丛越橘(V.
corybosum)和常绿越橘(V.darrowii),另外还包含
一些二倍体 、四倍体和六倍体的野生种和兔眼越
橘等的种质资源 ,为 4倍体种(4n=4x=24)[ 7] 。
近交有利于人工选择时使需要的基因性状集
中到一个基因型中 ,但也会使品种的遗传基础比
较狭窄 ,相互间有比较近的亲缘关系 。本试验利
用 ISSR标记的遗传分析结果也反映了各个类群
的品种间亲缘关系比较近的趋势 ,所以在今后的
育种中应引入更多的野生种质资源 。我们在育种
计划中利用自由授粉种子进行实生选择也不失为
一种值得采用的方法 。
UPGMA聚类分析首先将所有品种分为两大
支 ,第一大支包括所有供试的南高丛越橘品种和
7个实生选择系 ,第二大支包括所有供试的兔眼
越橘品种和 2个实生选择系(NJ8和NJ9)(图 1)。
第一大支中南高丛越橘品种聚为一分支 ,实生选
择系聚为另一分支。第二大支中NJ8与所有的兔
眼越橘品种聚为一分支 ,NJ9 另外形成一分支。
514　　　吉林农业大学学报　2009年 10月
Journal of Jilin Agricultural University 2009 , October
聚类分析所划分的大类群与经典的分类学观点很
相符 ,说明对于越橘来说 , ISSR标记是一种相当
有效的品种类群归类技术。但是 ,每一个类群内
各品种间的遗传关系的分析与已知的谱系结果不
能很好地吻合 。如在兔眼越橘品种中 ,来自相同
父母本(“Ethel” דCallaway”)的“Bluebelle”与“Cli-
max”的遗传距离为 0.1440 ,而“Climax”与父母本
为“Tifblue”和“Homebell”的“Premier”遗传距离却
更小 ,为 0.0629。这说明本试验所用的 ISSR引物
不能用来准确估算兔眼越橘品种间的遗传关系。
Levi等[ 4]也认为利用 RAPD和 ISSR引物所做出的
高丛越橘品种间的聚类结果与已知的谱系数据不
完全一致 。但也有试验证明利用 RAPD标记所评
估的兔眼越橘品种间的遗传关系与谱系数据一
致[ 3] 。这可能与 RAPD和 ISSR技术的局限性有
关 ,也可能与越橘品种的遗传背景有关 ,需要进行
更多的试验来验证。
图 1　28个越橘材料的 UPGMA聚类图
Fig.1.UPGMA dendrogram of 28 blueberry materials
　　值得注意的是 ,在聚类图中兔眼越橘品种果
实成熟期[ 8]相近的首先聚为一小分支。这一现象
似乎值得进一步对成熟期不同的更多品种作 IS-
SR分析 ,以探讨 ISSR标记是否可以用来指示选
育品种的成熟期 。
参考文献:
[ 1] 　Morrow E B.Some effects of cross-pollination versus self-pollination
in the cultivated blueberry[ J] .Proc Amer Soc Hortic Sci , 1943, 42:
469-472.
[ 2] 　Rabaey A , Luby J.Fruit set in half-high blueberry genotypes follow-
ing self and cross pol lination[ J] .Fruit Var J , 1988 , 42(4):126-
129.
[ 3] 　Aruna M , Ozias-Akins P , Austin M E , et al.Genetic relatedness a-
mong rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei)cultivars determined
by DNA amplification using single primers of arbitrary sequence
[ J] .Genome , 1993 ,36:971-977.
[ 4] 　Levi A , Rowland L J.Identifying blueberry cultivars and evaluating
their genetic relationships using randomly Amplif ied Polymorphic
DNA (RAPD) and Simple Sequence Repeat-(SSR-) anchored
Primers[ J] .J Amer Soc Hort Sci , 1997 , 122(1):74-78.
[ 5] 　Doyle J J.DNA Protocols for Plants-CTAB Total DNA Isolation
[M] ∥Hewitt G M , Johnston A.Molecular Techniques in Taxono-
my.Berlin:Springer-Verlage , 1991:283-293.
[ 6] 　Lyrene P M.Recurrent selection in breeding rabbiteye blueberries
(Vaccinium ashei Reade)[ J] .Euphytica , 1981 , 30:505-511.
[ 7] 　Lyrene P M.Low-chill highbush blueberries[ J] .Fruit Var J , 1990 ,
44:82-86.
515於　虹等:越橘品种的 ISSR鉴定及其亲缘关系分析
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University