全 文 ：越橘花药愈伤组织诱导的影响因子
游来秋 , 李晓艳 , 张志东 , 李亚东 , 吴 　林 , 刘海广
吉林农业大学园艺学院 ,长春 130118
摘　要:以越橘品种“北卫”为试验材料 , 研究了激素 、材料采集时间 、花冠状态 、光照 、培养基 pH 对愈伤组织
诱导的影响。结果表明:花药愈伤组织诱导适宜用WPM+BA 0.5 mg/L+2 , 4-D 1.0 mg/ L固体培养基;盛花期
取花冠长宽比为 2∶1 花蕾的花药为最佳培养材料;黑暗条件有助于越橘花药愈伤组织的产生 , 其花药愈伤组
织诱导率可达 56.67%;pH 4.98～ 5.50 花药愈伤组织诱导率无显著差异。
关键词:越橘;花药培养;愈伤组织
中图分类号:S663.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2009)05-0528-04
Influencing Factors of Callus Induction on Blueberry Anther in Vitro
YOU Lai-qiu , LI Xiao-yan , ZHANG Zhi-dong , LI Ya-dong , WU Lin , LIU Hai-guang
College of Horticulture , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China
Abstract:Effects of hormone , florescence , corolla state , light and pH value on inducing callus of “Pa-
triot” blueberry anther in vitro were studied.The results showed that:WPM +BA 0.5 mg/L+2 , 4-D
1.0 mg/L medium was most suitable for anther callus induction.Corolla with 2∶1 of length and width
during full flowering stage was the best period for sample collection.Culture under darkness condition
promoted the callus induction of blueberry anther , with an induction rate of 56.67%.There were no ob-
vious differences in callus induction rate when medium pH value varied from 4.98 to 5.50.
Key words:blueberry;anther culture;callus
　　越橘(Vaccinium)为多年生落叶或常绿灌木 ,
属小浆果类果树 。越橘果实中含有其他果品中少
有的特殊成分以及丰富的矿质元素 ,是目前具有
较高经济价值和广阔开发前景的果树树种之
一[ 1-2] 。自 1964年[ 3]首次从离体培养的毛叶蔓陀
罗花药中获得单倍体植株以来 ,花药及花粉培养
成为获得单倍体植株的新途径 。但是由花药直接
再生植株很困难 ,而胚性愈伤组织是获得单倍体
花粉植株的最佳途径 。目前已在苹果[ 4] 、草莓[ 5] 、
柑橘[ 5]等多种果树上通过花药胚性愈伤组织获得
单倍体植株 ,但是关于越橘花药培养的研究未见
报道 。本试验探讨了越橘花药愈伤组织诱导的最
佳培养条件 ,旨在为进一步通过花药愈伤组织获
得越橘单倍体植株奠定基础 ,同时为加速越橘育
种进程提供技术支撑 。
1　材料与方法
1.1　材料
以越橘品种“北卫”(Patriot)为试验材料 ,其花
药取自吉林农业大学小浆果园 。
1.2　方法
取材时间选择在晴天的上午 9:00 ,采集花药
后立刻带到实验室。先用流水冲洗整个花蕾
5 min ,然后用洗衣粉溶液浸泡 5 min ,再用流水冲
洗 20 min。立即在超净工作台上用 0.1%升汞处
理8 min ,无菌水冲洗 3 遍。用无菌滤纸吸干水

通讯作者
基金项目:公益性行业科研专项(nyhyzx07-028 , 2006-G25),吉林省科技发展重点项目(20075013)
作者简介:游来秋 ,女 ,硕士 ,研究方向:果树组织培养。
收稿日期:2008-12-20　　修回日期:2009-02-24
吉林农业大学学报　2009 ,31(5):528 ～ 531 ,537 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
分 ,剥出花药 ,去除花丝 ,并将一个花蕾的 10个花
药接种在一个培养瓶中。除了不同花状态试验
外 ,所有试验均采集长宽比为 2∶1的花蕾 ,剥取花
药接 种 在 改良 的 WPM + BA 0.5 mg/L +
2 ,4-D 1.0 mg/L的培养基中 , 琼脂 6 g/L , 蔗糖
30 g/L ,pH 5.4。光照强度为 2 000 lx ,光周期为
16 h光照/8 h黑暗 ,培养温度为(23±2)℃。
1.3　试验设计
1.3.1　植物激素对花药愈伤组织诱导的影响试
验　愈伤组织诱导的植物激素种类与质量浓度按
以下设计:BA(0.5 , 1.0 , 1.5 , 2.0 mg/L)与 2 ,4-D
(1.0 ,2.0 ,3.0 mg/L)的不同组合;BA (2.0 mg/L)
与 NAA(1.0 mg/L)组合;ZT (1.0 , 2.0 , 3.0 ,
4.0 mg/L)处 理 以 及 CPPU (1.0 , 2.0 , 3.0 ,
4.0 mg/L)处理。每个处理接种 5瓶 ,2次重复。
1.3.2　花状态与取材时间对花药愈伤组织诱导
的影响试验　花状态设 5个水平 ,即在同一株丛
的同一花序上 ,按花蕾的长宽比分别为 1∶1 、2∶1 、
3∶1以及花半开放 、全开放 5 种状态取样。每个
处理接种 3瓶 ,2次重复。
取样时间设 4个水平 ,即在同龄树上 ,从初花
期开始 ,分别于初花期后第3 ,7 ,11 ,15 d取样 。每
个处理接种3瓶 ,2次重复 。
1.3.3　光照对花药愈伤组织诱导的影响　将花
药接种到诱导培养基上后 ,分别置于正常光照和
黑暗 2 种培养条件下 。每个处理接种 3瓶 , 2次
重复 。
1.3.4　培养基 pH 对花药愈伤组织诱导的影响
试验　将花药接种到不同 pH 的诱导培养基上。
共设 7个处理 ,即每升培养基中分别加入 1 mol/L
盐酸溶液 0.50 , 0.55 , 0.60 , 0.65 , 0.70 , 0.75 ,
0.80 mL ,调整后培养基的 pH(25℃条件下)分别
为 5.91 , 5.73 , 5.65 , 5.50 , 5.49 , 4.98 , 4.21。每个
处理接种 3瓶 ,2次重复。
1.4　数据统计与分析方法
接种 14 d 后起 ,每 2 d观察 1次花药愈伤组
织的发生情况 ,包括发生时间 、发生部位 、颜色和
质地等 , 40 d后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织
诱导率=[(产生愈伤组织的花药数(枚)/接种存
活的花药数] ×100%。应用 DPS数据处理系统分
析统计数据。
2　结果与分析
2.1　激素种类 、浓度对愈伤组织形成的影响
不同的植物激素对越橘花药愈伤组织的诱导
和再生作用效果差异很大(表 1)。本试验通过改
良的WPM 培养基中添加 BA 和 2 ,4-D的组合均
能诱导“北卫”花药产生愈伤组织 ,其中激素组合
BA 0.5 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L 诱导效果最好 ,诱
导率 达到 13.7%, 且显 著高 于其 他组 合。
BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L 组合也能诱导出愈
伤组织 ,但诱导率较低 ,仅有 3.8%。试验中 ZT
(1.0 , 2.0 , 3.0 , 4.0 mg/L)和 CPPU(1.0 , 2.0 , 3.0 ,
4.0 mg/L)各处理均没有诱导出花药愈伤组织。
表 1　植物激素对“北卫”花药愈伤组织诱导的影响
Table 1.Effect of different hormones on blueberry Patroit anthers callus induction
激素
Hormone
接种花药数
No.of anthers
cultured
污染数
No.of pollution
污染率/ %
Rate of
pollution
愈伤组织
No.of calli
f ormed
诱导率/ %
Induction
frequency
分化率/ %
Regeneration
frequency
BA 0.5 mg/ L+2 , 4-D 1.0 mg/ L 100 20 20 11 13.7a 0
BA 1.0 mg/ L+2 , 4-D 2.0 mg/ L 100 10 10 2 2.2cd 0
BA 1.5 mg/ L+2 , 4-D 3.0 mg/ L 100 20 20 7 8.8b 0
BA 2.0 mg/ L+2 , 4-D 2.0 mg/ L 100 40 40 0 0d 0
BA 2.0 mg/ L+NAA 1.0 mg/L 100 20 20 3 3.8c 0
2.2　取材时间与花冠状态对愈伤组织形成的影
响
从初花期开始第 3 d至第 15 d采集长宽比为
2∶1的花蕾 ,取出花药接种在诱导培养基上。从
花药接种到开始产生愈伤组织的时间是 21 ～ 23 d
(表 2)。不同采样时期的花药其愈伤组织诱导率
存在一定差异 ,其中第 7 d和第 11 d 采集的花药
愈伤组 织诱 导率 较 高 , 分 别为 23.33%和
21.67%,二者之间没有显著差异 ,且显著高于第
3 d 和第 15 d 。第 3 d和第 15 d采集的花药愈伤
组织诱导率较低 ,分别为 16.67%和 15.00%,且
二者之间没有显著差异。田间观察显示第 7 d至
529游来秋等:越橘花药愈伤组织诱导的影响因子
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
第11 d正值“北卫”开始进入盛花期 ,此时多数花
发育良好 。较高的花药愈伤组织诱导率也说明这
一时期是采集花药的比较理想时期 。诱导出的花
药愈伤组织呈现淡黄色或黄白色。
表 2　不同取材时间对“北卫”愈伤组织形成的影响
Table 2.Effect of different time on Patriot callus formation
初花后时间/ d
Time from the first florescence
接种花药数
No.of anthers cultured 形成愈伤组织的花药数No.of anthers with callus 形成愈伤组织所需时间/ dTime of callus formation 愈伤组织诱导率/ %Callus induction frequency
3 97 10 21 16.67b
7 116 14 21 23.33a
11 97 13 23 21.67a
15 114 9 22 15.00b
　　表 3结果表明 ,不同发育阶段的花药产生愈
伤组织的能力不同。当花蕾长宽比为 1∶1时愈伤
组织诱导率较低(13.33%),此时花药呈新鲜的黄
绿色 ,瘦弱 ,易破 ,花药较难剥离;花蕾长宽比为2∶
1时 ,花药呈现淡黄色 ,饱满 ,愈伤组织诱导率最
高(35%);花蕾长宽比为 3∶1时 ,花药呈现黄白
色 ,质地坚硬 ,花丝部分呈现褐色 ,花丝极易剥离 ,
诱导率为 26.67%;当花为半开放状态时 ,花药大
部分呈现黄褐色 ,花丝萎蔫 ,愈伤组织诱导率下降
到10%;当花全开放时 ,花药呈黄褐色 ,花丝枯
死 ,花药干扁 ,没有诱导出愈伤组织 。这说明随着
花蕾长宽比的增加和花的开放 ,花药逐渐发育成
熟 ,产生愈伤组织能力逐渐降低。所有处理的花
药愈伤组织开始发生时间没有明显差异 ,均在接
种后第23 ～ 24 d发生。但是花蕾长宽比为2∶1时
愈伤组织的诱导率显著高于其他处理。
表 3　不同花状态对“北卫”愈伤组织形成的影响
Table 3.Effect of different corolla states on Patriot callus formation
花状态(花长∶宽)
Corolla state(length:width) 接种花药数No.of anthers cultured 形成愈伤组织的花药数No.of anthers with callus 形成愈伤组织所需时间/ dTime of callus formation 愈伤组织诱导率/ %Callus induction frequency
(1∶1) 60 8 23 13.33c
(2∶1) 60 21 23 35.00a
(3∶1) 60 16 24 26.67b
花冠半开放 Semi-bloom 60 6 24 10.00d
花冠全开放 Full-bloom 60 0 0e
2.3　光照或暗培养对愈伤组织形成的影响
试验结果显示(表 4),黑暗条件有利于花药
愈伤组织产生 。在光照 16 h/黑暗 8 h 的条件下
培养的诱导率为 40%,而在黑暗条件下培养愈伤
组织诱导率显著高于光照 16 h/黑暗 8 h处理 ,达
到56.67%。但是不同处理对愈伤组织开始发生
时间没有显著影响。
表 4　光照对“北卫”花药愈伤组织形成的影响
Table 4.Effect of illumination on Patriot anther callus formation
处理
Treatment
接种花药数
No.of anthers cultured 形成愈伤组织的花药数No.of anthers with callus 愈伤组织形成时间/dTime of callus formation 愈伤组织诱导率/ %Callus induction frequency
光照 16 h/黑暗 8 h
Illumination
16 h/ darkness 8 h 60 24 25 40.00
b
黑暗
Darkness
60 34 26 56.67a
530　　　吉林农业大学学报　2009年 10月
Journal of Jilin Agricultural University 2009 , October
2.4　培养基 pH对花药愈伤组织形成的影响
越橘为喜酸性植物 ,土壤最适 pH 4.2 ～ 5.2。
越橘茎段组培快速繁殖配制WPM 培养基时要调
整pH值为 5.4。本试验在培养基高压灭菌前 ,设
置了 7个 pH值处理。表 5结果显示 ,在 pH 5.50
时愈伤组织诱导率最高 , 达到 34%, 但是与
pH 4.89以及 pH 5.49处理无显著差异 ,而与其他
处理差异显著 。因此 ,认为 pH 4.89 ～ 5.50为花
药愈伤组织诱导的最适 pH 值。当 pH 达到 5.91
时 ,花药愈伤组织诱导率最低(22.89%),显著低
于其他处理 ,说明高 pH 值不适于花药愈伤组织
的诱导。
表 5　pH对“北卫”花药愈伤组织形成的影响
Table 5.Effect of different pH value on Patriot anther callus
formation
处理号
No.of
treatment
pH(25℃)
愈伤组织诱导率/ %
Callus induction
frequency
1 5.91 22.89e
2 5.73 30.26cd
3 5.65 29.31d
4 5.50 34.00a
5 5.49 32.12abc
6 4.98 33.56ab
7 4.21 31.23bcd
3　讨　论
关于适宜培养越橘的植物生长调节物质有过
相关研究报道。通常单独添加细胞分裂素类物质
ZT 、2ip 、CPPU 、TDZ 对越橘的茎段增殖 、叶片愈伤
组织或不定芽诱导具有良好作用。马怀宇等[ 7]在
高丛越橘离体叶片再生植株研究中认为添加细胞
分裂素ZT 、CPPU对越橘离体再生效果最好 , TDZ
和2ip只对个别品种的再生有效果 ,而 BA对越橘
离体叶片再生没有效果。在本试验中添加 ZT 、
CPPU的诱导培养基中未见有花药愈伤的分化(表
1)。这说明同一植物的不同器官对植物激素的敏
感性不同。“北卫”花药在WPM+BA 0.5 mg/L+
2 , 4-D 1.0 mg/L 培养基上诱导率达 13.7%～
56.67%(表 1 , 表 4), 在 BA 2.0 mg/L +NAA
1.0 mg/L 培养基上诱导率为3.8%,而在加入ZT 、
CPPU的诱导培养基上未见有花药愈伤的分化 ,说
明2 ,4-D和 NAA等生长素在愈伤组织的增殖过
程中起着重要作用。该结果与在苜蓿[ 8] 、落叶
松[ 9]和荔枝[ 10]等植物上的研究结果相一致。但
越橘花药在添加 ZT 、CPPU 的诱导培养基上未见
有花药愈伤的产生 ,是否与培养基中没有添加生
长素类物质有关尚需进一步研究。越橘雄蕊非常
小 ,并且花丝不能剥离干净 ,这些都可能会影响花
药愈伤组织的正常形成 ,从而造成诱导产生愈伤
组织的时间比较长 。在荔枝 、黑穗醋栗等植物花
药培养中也有同样的情况出现[ 11-13] 。
花药取材时期与愈伤组织发生能力之间有密
切关系 。一般 10月中旬采集处于盛花期的枇杷
花药 ,培养后较易获得愈伤组织[ 14] 。而采用百合
早期开花的花药进行培养更易诱导出愈伤组
织[ 15] 。在本试验中采用“北卫”盛花期(7 ～ 11 d)
花药的愈伤组织诱导效果更好 。此外 ,采用长宽
比为 2∶1的花蕾其花药愈伤组织诱导率最高 ,这
与李晓艳[ 16] 的研究结果相一致。因此可以初步
确定 ,诱导越橘花药愈伤组织最佳时期和材料是
在盛花期采集花冠长宽比为 2∶1花蕾的花药 。
在花药愈伤组织诱导培养过程中是否需要光
照 、需要的光照强度与植物种类有关。草莓[ 17]和
西瓜[ 18]花药培养在正常光照条件下能诱导出大
量的愈伤组织 ,而有的树种花药在脱分化诱导愈
伤组织阶段并不需要较强的光照 。例如葡萄[ 19]
花药在黑暗条件下诱导培养有利于花粉愈伤组织
或胚状体的形成 。本试验中 ,越橘花药在有光照
(2 000 lx ,16 h光照/8 h黑暗)或黑暗条件下均能
诱导愈伤组织形成 ,说明黑暗条件不是越橘花药
脱分化诱导愈伤组织的必要条件 ,但在黑暗条件
下更有利于愈伤组织诱导 。然而光照条件的有无
对越橘花药愈伤组织再分化是否有影响尚待进一
步研究。
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吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University