全 文 ：第 32 卷 第 4 期 西 南 林 业 大 学 学 报 Vol． 32 No． 4
2012 年 8 月 JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITY Aug． 2012
收稿日期:2011 － 12 － 21
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(RISF6155)资助。
第 1 作者:李翠云(1986—) ，女，硕士生。研究方向:树木抗逆分子生物学。E-mail:licuiyun1213@ 126． com。
通信作者:卓仁英(1969—) ，男，博士，研究员。研究方向:树木抗逆分子生物学。E-mail:zhuory@ gmail． com。
doi:10． 3969 / j． issn． 2095 － 1914． 2012． 04． 007
海滨木槿叶片蛋白质双向电泳体系的建立
李翠云1，2，3 姜彦成1 乔桂荣2，3 刘明英2，3 蒋 晶2，3 卓仁英2，3
(1．新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046;2．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400;
3．中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091)
摘要:为建立一套适合海滨木槿叶片蛋白质组学分析的双向电泳体系，以海滨木槿无性系叶片为材
料，分别采用裂解液法、三氯乙酸 －丙酮沉淀法、改良酚抽法分离纯化蛋白质，选用 24 cm pH 3 ～10
的 IPG胶条，并对不同上样量、等电聚焦程序、平衡时间等电泳条件进行优化。结果表明:采用改良
酚抽法提取蛋白质，上样量为每 IPG胶条 1 000 μg，总聚焦功率 90 kV·h，平衡时间 15 min，胶体考
马斯亮蓝染色，可得到蛋白质点数目多、分辨率高的双向电泳图谱。重复性试验结果显示，该体系
具有很好的稳定性及可重复性，可满足海滨木槿蛋白质组学研究的要求。
关键词:海滨木槿;耐盐;蛋白质;双向电泳
中图分类号:S718． 46 文献标志码:A 文章编号:2095 － 1914(2012)04 － 0030 － 06
Establishment of 2-D PAGE System for Leaf Protein of
Hibiscus hamabo
LI Cui-yun1，2，3，JIANG Yan-cheng1，QIAO Gui-rong2，3，LIU Ming-ying2，3，JIANG Jing2，3，ZHUO Ren-ying2，3
(1． College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi Xinjiang 830046，China;2． Research Institute of Subtropical Forestry，
Chinese Academy of Forestry，Fuyang Zhejiang 311400，China;3． National Key Lab of Tree Genetics and Breeding，
Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China)
Abstract:To establish a two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE)system for leaf pro-
teomic analysis of Hibiscus hamabo，three methods including lysis-buffer method，TCA-acetone precipitation meth-
od，and the improved phenol extraction method were applied for leaf protein isolation and purification，and the key
technologies of electrophoresis including the sample loading quantity，isoelectric focusing conditions，equilibrium
time were optimized by taking 24 cm pH 3-10 immobilized pH gradient(IPG)strips． The results indicated that the
reproducible 2-D gel with more spots and high resolution electrophoresis diagram could be obtained by using the im-
proved phenol extraction method，with 1 000 μg of loading protein sample per IPG strip，90 kV·h isoelectric focu-
sing (IEF)time，15 min of equilibrium time and staining with colloidal coomassie brilliant blue as the most suit-
able treatment conditions． The results of repetitive experiments showed that this electrophoresis system was stable
and reproducible，which could meet the demand for the proteomics research on H． hamabo．
Key words:Hibiscus hamabo ;salt tolerant;protein;two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis
(2-D PAGE)
海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb． et Zucc．)系
锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus )小乔木或灌
木，原产日本、朝鲜和我国浙江舟山、宁波等沿海
一带［1］，为浙江省珍稀濒危植物［2］。俞慈英等［3］
研究了海滨木槿的引种驯化及开发利用前景。王
秀丽等［4］从生理生化、离子含量及叶片解剖结构 3
方面对海滨木槿的耐盐性进行了研究，发现其对
滨海盐碱地的适应性很强，可以在 pH 8． 6、含盐量
高达 1. 5%的滨海沙土上生长，属典型的盐生植
物，为海岸防潮林的优良树种。目前，国内外对海
滨木槿的研究主要集中于驯化、形态及生理生化
等方面［3 － 6］，对其耐盐分子机制方面的研究则
较少。
蛋白质组学是后基因组时代生命科学的重要
研究手段［7］。通过蛋白质组学的研究，对植物在逆
境胁迫响应中变化的相关蛋白进行定量和定性分
析，寻找抗逆相关基因，对了解植物逆境生理分子
机制以及植物抗逆性育种有着十分重要的意义［8］。
双向电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量将各
种蛋白质分离，具有较高的分辨率和灵敏度，在一
个试验中能分离几千个蛋白［9］。由此可见，蛋白质
组分析是研究海滨木槿耐盐分子机制更为有效和
直接的手段。本文旨在探索一种高效的海滨木槿
叶片蛋白质提取方法，构建适合于海滨木槿叶片蛋
白的双向电泳试验体系，为开展其比较蛋白质组学
研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料来源
于杭州湾湿地生态站采集早春发芽前的海滨
木槿无性系插条，选取 1 年生无病虫害、健壮的枝
条，剪成长 10 cm的小段，每段有 3 ～ 5 个芽，扦插于
V(珍珠岩)∶ V(泥炭土)∶ V(蛭石)= 1 ∶ 1 ∶ 1 的基质
中，生根后选取健康状况良好、长势均一的扦插苗
盆栽，置于中国林业科学研究院亚热带林业研究所
实验大棚内供试。待盆栽扦插苗生长到 40 cm 以
上，取新梢第 2 ～ 4 片完全展开的健康叶片进行试
验，所取材料用液氮冷冻后置于 － 80 ℃下保存。
1． 2 仪器和试剂
Ettan IPGphor Ⅲ等电聚焦系统，Manifold 胶条
槽，Immobiline DryStrip 泡胀盘，Ettan DALT six 电泳
系统，电源 Electrophoresis Power Supply EPS 601，
MultiTemp III 循环冷却系统，ImageScannerⅡ扫描
仪，ImageMaster 2D platinum 6． 0 分析软件，均购自
GE Healthcare。
24 cm线性 IPG胶条(pH 3 ～ 10)、尿素、载体两
性电解质和碘乙酰胺购自 GE Healthcare;丙烯酰胺
(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸钠
(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇(β － Me)、聚
乙烯基吡咯烷酮(PVPP)、三羟甲基氨基甲烷
(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris 饱和酚、聚乙二
醇辛基苯基醚(Triton X － 100)、过硫酸铵(APS)和
N，N，N，N －四甲基二乙胺(TEMED)等购自生工
生物工程(上海)有限公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、
CHAPS，考马斯亮兰 CBB G －250 和甘氨酸购自 Sig-
ma;蔗糖、三氯乙酸、丙酮、乙酸铵、乙酸、甲醇、乙
醇、磷酸、甘油、硫酸、硫酸铵均为分析纯，购自生工
生物工程(上海)有限公司。所有溶液均用 18． 2
MΩ·cm的超纯水配制。
1． 3 双向电泳
1． 3． 1 蛋白质样品制备方法 由于极端环境下的
植物材料组织中富含多糖、多酚、色素、有机酸等次
生代谢产物和蛋白酶以及大量盐分，所以其蛋白质
提取较其他植物更为困难，本研究比较了裂解液
法、三氯乙酸(TCA)－ 丙酮沉淀法、改良酚抽法分
离纯化蛋白质，并对总蛋白的提取效果进行比较。
1)裂解液法。参照王玉琪等［10］的方法，并作
了一定改进。取新鲜叶片 0． 5 g加 0． 05 g PVPP及 1
mL 40 mmol /L Tris置预冷研钵中加液氮充分研磨，
加入 5 mL 裂解液(9． 8 mol /L 尿素、2% CHAPS、50
mmol /L DTT) ，继续研磨至匀浆，转移至离心管中，
10 800 r /min，离心 10 min;取上清液加 5 倍体积预冷
的丙酮，－ 20 ℃静置 3 h以上，4 ℃，10 800 r /min，离
心 20 min，弃上清液;沉淀用含 0． 07% β －巯基乙醇
的预冷丙酮洗涤 2 次，室温干燥后置于 － 80 ℃下
保存。
2)三氯乙酸(TCA)－丙酮沉淀法。参照 Car-
pentier等［11］的方法，并作了一定改进。取新鲜叶片
0． 5 g 加 0． 05 g PVPP 置预冷研钵中加液氮充分研
磨，转至离心管中，加 20 mL － 20 ℃预冷的含 10%
TCA、0． 07% β －巯基乙醇的丙酮，涡混 5 min，－ 20
℃沉淀过夜;4 ℃，10 800 r /min，离心 30 min，弃上清
液;沉淀用含 0． 07% β －巯基乙醇的预冷丙酮洗涤
2 次，室温干燥后置– 80 ℃下保存。
3)酚抽法。参照王旭初等［12］的方法，并作了
一定改进。取新鲜叶片 0． 5 g 加 0． 05 g PVPP 置预
13第 4 期 李翠云等:海滨木槿叶片蛋白质双向电泳体系的建立
冷研钵中加液氮充分研磨成粉末，加 10 mL 4 ℃预
冷的蛋白质提取液(300 mmol /L Tris，50 mmol /L
EDTA － Na2，50 mmol /L borax，50 mmol /L维生素 C，
1% Triton X － 100，2% β － Me，0． 7 mol /L 蔗糖，
1 mmol /L PMSF) ，继续研磨至匀浆，转移至离心管，
4 ℃，10 800 r /min离心 30 min;取上清液加等体积的
Tris －酚(pH 8． 0)漩涡 10 min，静置后 4 ℃，10 800
r /min离心 30 min;取上层酚相加 5 倍体积的预冷乙
酸铵饱和甲醇，－ 20 ℃静置 2 h 以上，4 ℃，10 800
r /min，离心 20 min;沉淀用预冷丙酮(80% 丙酮，
0. 5% β －巯基乙醇)洗 2 遍，每次 15 min;室温干燥
后置 － 80 ℃下保存。
1． 3． 2 上样量 上样量的确定是获得优质双向电
泳图谱的前提。本试验第一向电泳采用 24 cm、pH
为 3 ～ 10 的线性 IPG 胶条，上样体积 450 μL，每个
IPG胶条蛋白上样量设置 800、1 000、1 200 μg 3 个
梯度，比较不同上样量条件下 2 － DE 图谱的染色效
果，确 定 最 佳 上 样 量。蛋 白 质 定 量 采 用
Bradford法［13］。
1． 3． 3 等电聚焦 IEF 关系到 2 － DE 结果的分辨
率及重复性，本试验采用 Immobiline DryStrip 泡胀盘
进行水化，所以等电聚焦程序不需要设置水化步
骤。试验总聚焦功率 90 kV· h，聚焦程序［14］见
表 1。
表 1 24 cm固定化胶条等电聚焦程序
步骤 升压模式 状态 电压 /V 时间 /h 功率 /(kV·h)
1 快速 除盐 500 1 0． 5
2 快速 除盐 1 000 3 3． 0
3 快速 除盐 3 000 4 12． 0
4 线性 升压 8 000 2 16． 0
5 快速 等电聚焦 8 000 9 72． 0
6 快速 保持 500 2 1． 0
1． 3． 4 胶条平衡 等电聚焦结束后立即进行胶条
两步平衡，设置 2 × 10、2 × 15、2 × 20 min共 3 个时间
梯度。
1． 3． 5 第二向 SDS － PAGE 垂直电泳 使用 Ettan
DALTsix电泳系统，12. 5% 的丙烯酰胺均一凝胶，采
用可重复的电泳参数，恒功率模式:5 W，45 min;
15 W，6 h。染料前沿距凝胶底部 1 mm时停止电泳。
外部循环水浴温度控制在 15 ℃。
1． 4 考马斯亮蓝染色
电泳完毕后进行 Neuhoff 胶体考马斯染色［15］。
之所以使用胶体染色的方法，是因为其完全与质谱
兼容，灵敏度高，可检测低至 100 ng的蛋白点［16］。
1． 5 图像采集和数据分析
采用 Image ScannerⅡ光学扫描仪扫描凝胶，分
辨率设置为 300 dpi。蛋白点的检测和凝胶匹配分
析用 ImageMaster 2D platinum 6. 0 双向电泳分析软
件来完成，并对自动检定的蛋白点加以人工校对。
1． 6 试验重复性分析
双向电泳的重复性是蛋白质组技术平台的关
键指标之一［17］。为了验证所建立的双向电泳体系
的检测效果，选取 6 株苗高及地径基本一致的 1 年
生海滨木槿无性系扦插植株，分别提取蛋白并进行
蛋白定量，按照建立的试验体系进行双向电泳。借
助专业凝胶图像分析软件 ImageMaster 2D platinum
6. 0 对双向电泳凝胶图谱中蛋白斑点的基本参数和
信息进行分析。重复性指标包括蛋白斑点匹配率、
蛋白斑点数、蛋白量的变异程度等。
2 结果与分析
2． 1 蛋白质提取方法的优化
通过双向电泳分析比较裂解液法、三氯乙酸 －
丙酮沉淀法、改良酚抽法所提蛋白的质量，结果见
图 1。
a．裂解液法 b．三氯乙酸 －丙酮沉淀法 c．改良酚抽法
图 1 海滨木槿叶片总蛋白不同提取方法比较
23 西 南 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
如图 1 所示，直接裂解法操作简单，但样品杂质
多，不适合提取次生代谢产物含量高的植物样品;
TCA －丙酮沉淀法同样杂质去除不干净，所得蛋白
损失较多;改良酚抽法所得 2 － DE 图谱背景清晰，
蛋白点不弥散，有较强的去除杂质的能力。
3 种方法所得图谱在蛋白点的数目上也存在差
异，检测到的蛋白点数见表 2。
表 2 不同方法提取蛋白效果比较
方法
蛋白产量 /
(mg·g － 1)
2 － DE图谱中检测到
的蛋白点数
裂解液法 92． 40 ± 1． 65 701 ± 12
TCA －丙酮沉淀法 68． 00 ± 1． 23 526 ± 16
改良酚抽法 128． 70 ± 1． 96 1 257 ± 22
由表 2 可知，改良酚抽法所得蛋白点较多。原
因在于海滨木槿是一种非常耐盐碱的木本植物，其
体内含有色素、多酚、多糖、有机酸等多种次生代谢
产物以及大量盐分，而盐离子的存在会严重干扰等
电聚焦的进行［18］。改良酚抽法可以较好地提取海
滨木槿叶片蛋白，并去除其中的盐离子。TCA －丙
酮沉淀法往往会使 TCA 清除不尽，造成蛋白复溶
困难［19］。
2． 2 上样量的优化
要得到良好的双向电泳结果，适当的蛋白质
上样量是绝对重要的。对 800、1 000、1 200 μg 3
种蛋白质上样量的 2 － DE 图谱进行比较，其所得
蛋白点数分别为:893、1 198、1 207 个(图 2)。上
样量低，则低丰度蛋白显示不清或不显示导致无
法检测，蛋白点数较少;上样量过高，会造成蛋白
点重叠无法有效分离，高丰度蛋白会出现横纹。
对于 pH 3 ～ 10 的 IPG 胶条，当上样量从 800 μg
增加至 1 000 μg 时分辨率有所提高，蛋白点数也
明显增加，低上样量时未检测到的蛋白点可以明
显的被检测到(放大区域 b 中的蛋白点 1) ;当上
样量从 1 000 μg 增加至 1 200 μg 时，蛋白点没有
明显增多，而且高丰度蛋白形成重叠，蛋白点融
合，不能有效分离成单个蛋白点(放大区域 c 中
的蛋白点 2)。
a． 800 μg上样量;b． 1 000 μg上样量;c． 1 200 μg上样量(下图为区域放大图谱，箭头标记为蛋白点的分离情况)
图 2 不同上样量图谱比较
2． 3 聚焦时间
试验所采用的等电聚焦程序能够顺利升至高
电压进行等电聚焦，达到所需的总聚焦功率为
90 kV·h，并有缓慢的升压步骤，有利于除盐除杂。
2． 4 胶条平衡时间的优化
不同平衡时间的 2 － DE图谱见图 3。
从图 3 可看出:平衡时间不足(2 × 10 min)会
导致平衡不充分，SDS 未与蛋白质充分结合，影响
蛋白分离效果;平衡时间过长(2 × 20 min)会出现
蛋白质斑点扩散现象，引起蛋白丢失。最佳平衡
时间为 2 × 15 min，可得到蛋白点多且清晰的 2 －
DE 图谱。
33第 4 期 李翠云等:海滨木槿叶片蛋白质双向电泳体系的建立
a．两步平衡时间 2 × 10 min;b．两步平衡时间 2 × 15 min;c．两步平衡时间 2 × 20 min(下图为区域放大图谱)
图 3 不同平衡时间的 2 － DE图谱
2． 5 双向电泳的重复性
6 株生长基本一致的海滨木槿无性系扦插植
株，分别提取蛋白，所得到的蛋白样品按照建立的
试验体系进行双向电泳，获得了 6 张 2 － DE 图谱。
蛋白斑点匹配时主要依靠计算机自动匹配，选其中
的 1 块胶 A做参考胶，凝胶之间蛋白质斑点的匹配
率平均为(86. 14 ± 7． 7)%，总蛋白斑点数的相对标
准差为 4. 31%。选取不同批次的 2 块凝胶从匹配
的蛋白点中随机抽取 100 个点分析蛋白量的变异程
度，结果表明，相对含量的相关系数为 0． 897 3，说明
试验偏差较小，可重复性高。
3 讨 论
要得到良好的双向电泳结果，样本制备是关
键。在设计样本制备方案时，必须要尽可能地分离
更多的蛋白质，获得清晰可重复的蛋白图谱［20］。海
滨木槿为典型的盐生植物，组织中多糖、多酚、盐等
次生代谢产物含量很高，能否除去这些物质直接影
响双向电泳的效果。改良酚抽法可有效去除样品
中的可溶性杂质，酚是蛋白质的良好溶剂，在样品
制备过程中，蛋白质和脂类溶于酚相，盐、核酸、多
酚和多糖等可溶性物质进入水相，从而得以分
离［21］。改良酚抽法可很好地提取海滨木槿蛋白并
能有效去除样品中的盐离子，保证了等电聚焦的顺
利进行。
很少有人对不同蛋白提取方法与质谱兼容性
进行测试，最近，Inder 等［22］报道了与蛋白质质谱分
析相兼容的植物蛋白提取方法研究，分别用 TCA －
丙酮沉淀法、酚抽法、直接裂解液法、Tris － HCl 提取
法提取蛋白质，二维凝胶电泳分离，质谱分析。数
据表明，TCA －丙酮沉淀法和酚抽法优于其他 2 种
测试方法。这些结果进一步证明了改良酚抽法不
仅可以得到高质量的蛋白样品，还为以后的质谱分
析和蛋白质鉴定提供了保证。
第一向等电聚焦采用 24 cm、pH 3 ～ 10 的线性
IPG胶条，不仅提高了分辨率，而且使蛋白在胶条上
更加均匀地分布，可以较清晰地纵览总蛋白的分
布。双向电泳的最佳上样量受多种因素的影响，影
响因素如材料的复杂程度、IPG胶条的长度和 pH 范
围、凝胶染色方法等［23］，因此，最佳上样量必须通过
实践经验决定。在重复性试验中未匹配的蛋白也
主要集中在表达量相对较低的蛋白上，对于一些低
丰度的蛋白，随着上样量的增加，其检出率也增加。
但是上样量过高会出现共迁移现象，即不同的蛋白
质出现于 2 － DE 胶的相同位置［24］，使 2 － DE 的分
辨率降低，选择 1 000 μg 的上样量既可使检测到的
蛋白质数目尽可能多，又尽量避免了蛋白质点的共
迁移。
综上所述，本文采用改良酚抽法、1 000 μg 的上
样量、总聚焦功率 90 kV·h、平衡时间 2 × 15 min、
胶体考马斯染色可得到背景干净，蛋白点清晰，横、
纵条纹较少的高质量 2 － DE 图谱，为海滨木槿蛋白
质组学研究奠定了基础，对其他盐生植物蛋白质双
向电泳也有借鉴意义。
43 西 南 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
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(责任编辑 张 坤)
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