全 文 ：钙调素参与拟南芥根细胞增殖及幼苗对
外源脱落酸的敏感性反应过程 *
程玉豆 ** 韩书云 ** 赵军峰 高英杰 孙大业 崔素娟 ***
(河北师范大学生命科学学院，河北省分子细胞生物学重点实验室，石家庄 050016)
摘要 钙调素作为真核细胞的重要信号蛋白，在真核生物正常及逆境条件下的生长发育中发挥着重要作用．研究报道钙调素
可促进离体培养的高等动植物细胞的增殖，但有关钙调素蛋白在植物体内的细胞增殖功能尚未见报道．特别是拟南芥基因组
中存在 7个编码经典钙调素亚型的基因，多数编码基因的功能有待进一步探究．首先借助常用的钙调素拮抗剂W7进行药理
学实验，结果表明，野生型拟南芥幼苗根的生长受到了明显的抑制，根尖分生区的面积变小、细胞数目明显减少，根尖分生
区中细胞分裂标记基因 CYCB1;1的表达受到了明显抑制，这表明在根尖分生区 W7可能通过对活性钙调素的抑制作用影响
了根尖分生区域的细胞增殖，而根尖分生区正常的细胞增殖需要一定量活性钙调素蛋白的存在．脱落酸(ABA)是植物逆境下
的重要激素，在植物种子萌发及幼苗生长发育中发挥着重要作用，W7存在下的拟南芥幼苗对 ABA的敏感性下降．借助反
向遗传学手段获得了拟南芥中三个编码典型钙调素蛋白基因的三重缺失突变体 cam234，蛋白质印迹结果表明三重缺失突变
体中钙调素蛋白的含量明显降低．相同培养条件下与野生型相比，三重突变体幼苗根长变短，并且幼苗对 ABA敏感性也表
现下降趋势，暗示着这三个基因编码的钙调素蛋白可能参与了根分生区域细胞增殖过程及幼苗对脱落酸的敏感性反应，讨论
了钙调素的细胞增殖功能及与幼苗对脱落酸的敏感性反应间的关系．
关键词 钙调素拮抗剂W7，脱落酸(ABA)，拟南芥，根尖，细胞增殖，钙调素 cam234三重突变体
学科分类号 Q291 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2010.00441
生物化学与生物物理进展
Progress in Biochemistry and Biophysics
2011, 38(1): 36~45
www.pibb.ac.cn
研究报告Research Papers
* 国家重大科学研究计划项目课题(2006CB910605),教育部新世纪
优秀人才支持计划(NCET-06-0256)和河北省自然科学杰出青年项目
(C2009001516)资助项目.
**共同第一作者.
***通讯联系人.
Tel: 0311-86269144, E-mail: cuisujuan@263.net
收稿日期：2010-08-25，接受日期：2010-11-09
Ca2+作为第二信使，在植物生长和发育过程中
发挥重要的作用．许多环境刺激均能够引起胞内钙
离子浓度的变化，如热、风、冷、光、触摸、伤
害、盐胁迫等都能引起胞内钙离子浓度的升高[1-4].
这些报道暗示着 Ca2+可能参与并调节了细胞的许
多基本生命活动．Ca2+信号产生后，需要被下游的
受体识别并传递，目前已报道的 Ca2+受体主要有
钙依赖蛋白激酶 (Ca2+-dependent protein kinases，
CDPKs 或 CPKs)，钙调磷酸酶 B 亚基样蛋白
(calcinurium B-like，CBLs)，钙调素 (calmodulins，
CaMs)和钙调素样蛋白(CaM-like，CMLs)，其中动
物 CaM自 20世纪 60年代末被发现以来，一直是
人们关注的热点信号蛋白，主要从钙调素蛋白的结
构、生化特性、结合蛋白的检测及功能等方面进行
了一系列的研究[5-7]．
与酵母和动物中钙调素编码基因数量较少不
同，模式植物拟南芥(Arabidopsis theliana)基因组中
存在着 7个典型的 CaM编码基因(AtCaM1～7)，这
7个基因所编码的钙调素蛋白被分为 4个亚型[8-11]，
4个亚型 CaM在氨基酸序列上高度保守，相互间
仅有 1～5个氨基酸的差异，与人类中的 CaM蛋白
相比，氨基酸一致率可达到 90%左右．此外，拟
南芥中还存在着约 50 种 CMLs 基因，这些 CMLs
蛋白均至少含有一个预测的 EF手型钙离子结合结
构域，氨基酸序列上与典型的 CaM相比约有 16%
的一致性 [12]．拟南芥中拥有如此众多的 CaMs 及
CMLs暗示着它们的重要性及在功能上可能存在着
程玉豆, 等：钙调素参与拟南芥根细胞增殖及幼苗对外源脱落酸的敏感性反应过程2011; 38 (1)
冗余性，解析这些基因及编码蛋白的功能是一种挑
战，同时也有助于认识植物多样钙调素基因及蛋白
质亚型的生物学意义．
在动物中，钙调素能通过与多种细胞增殖相关
的生长因子、激素相互作用来调控细胞增殖[13]，当
老鼠 C127 细胞超表达 CaM 时，细胞迅速增殖，
而降低 CaM表达时，细胞增殖减缓[14]．在植物中，
一些 CaM 结合蛋白陆续被报道参与了细胞增
殖，如 DRL1在拟南芥分生组织活性及器官的生长
发育中发挥着重要功能 [15]，衣藻中的驱动蛋白样
(kinesin-like)钙调素结合蛋白在细胞分裂过程中发
挥着重要的作用[16]．我室早期研究表明外源钙调素
能够促进白芷悬浮细胞的增殖、原生质体细胞壁再
生及细胞分裂 [17-19]以及促进花粉萌发和花粉管伸
长[20]．然而这些结果多来源于体外实验，由于酵母
及动物中钙调素缺失突变往往造成个体不能存活，
对钙调素在动物个体水平的研究很难开展，植物由
于钙调素多个基因的存在，对一个或少数钙调素基
因的缺失突变的研究还刚刚开始，只有少数钙调素
基因的功能有文献报道，但有关哪些钙调素基因
参与植物个体生长发育中的细胞增殖过程尚未见
报道．
脱落酸(abscisic acid，ABA)是非常重要的植物
激素，调控着植物的逆境反应和生长发育．研究报
道表明，Ca2+信号参与了 ABA信号转导途径，三
类 Ca2+结合蛋白 CPKs、CBLs、CMLs中的某些成
员参与了 ABA 信号转导途径．当超表达 CPK32
时，拟南芥表现出对 ABA 的超敏感性 [21]，CPK3
和 CPK6参与了 ABA对气孔运动的调节[22]，CPK4
和 CPK11作为蛋白激酶，通过磷酸化 ABA信号途
径中的转录因子 ABF1和 ABF4来实现对 ABA信
号途径的调控[23]．cbl1突变体对外源 ABA不敏感，
而 cbl9突变体对外源 ABA敏感，进一步研究证实
CBL1 和 CBL9 能够与 CIPK3 相互作用来完成
ABA反应[24]．最近 CML家族的两个成员 CML9、
CML24被证实也参与了 ABA反应途径，CML9突
变后，拟南芥幼苗表现出对 ABA的超敏感性[25]．
当 CML24 表达下调时，拟南芥植株对 ABA 不敏
感[26]．然而作为发现最早、研究报道最多的一类重
要的 Ca2+受体蛋白——钙调素，目前还未见报道
其是否参与了 ABA信号转导途径及 ABA反应．
我们首先观察了在含有钙调素拮抗剂的培养基
上拟南芥幼苗根的生长、细胞分裂及 ABA反应的
变化，同时筛选鉴定了钙调素不同编码基因的拟南
芥缺失突变体，遗传杂交得到了三重缺失突变体，
观察了正常及 ABA处理下的表型变化，旨在揭示
钙调素基因或编码钙调素蛋白亚型在植物个体水平
上的细胞增殖、正常及逆境生长发育中的作用．
1 材料与方法
1．1 植物材料
拟南芥 col-0生态型野生型种子由我室保存．
转 CYCB1;1::GUS基因的拟南芥种子由中国农业大
学巩志忠教授馈赠．拟南芥 T-DNA插入种子购于
美国俄亥俄州立大学的 ABRC(http://abrc.osu.edu)
或欧洲的 NASC(http://arabidopsis.info)种子中心．
1．2 拟南芥种子的消毒及萌发
拟南芥种子经 75%乙醇表面消毒 30 s，无菌水
洗 3次后，播种在 1/2 MS固体培养基(1/2×MS盐
和维生素，1.5%蔗糖，0.8%琼脂粉，KOH 调 pH
至 5.8)上，4℃黑暗处理 3天后水平置于光照培养
箱中，在 22℃，16 h光照(光强 130 μmol/(m2·s))及
8 h黑暗的光周期条件下培养，数码相机拍照并计
算子叶变绿的速率．
1．3 拟南芥幼苗的培养及根长测量
拟南芥种子经消毒及 4℃暗中处理 3 天后，
分别点种于 MS 固体或含不同量药剂的液体培
养基中，光照培养箱 22℃， 16 h 光照 (光强
130 μmol/(m2·s))及 8h黑暗的光周期条件下竖直或
55 r/min 摇荡培养，5～6 天后利用直尺或 Motic
Images 2000软件测量根长，每种株系至少测量 30
个样本．
1．4 根尖细胞的显微观察
取 1．2，1．3方法中不同处理条件生长 5～6天
的幼苗，将其分别放于载玻片上，滴加 50 μl根透
明液(3 ml纯水，8 g水合氯醛，1 ml甘油，避光搅
拌 1～4 h)，盖上盖玻片，室温放置过夜，倒置显微
镜(日本尼康公司，型号 TE2000-U)下 DIC物镜观
察, Nikon ACT-1软件记录图像, Motic Images 2000
软件测量根分生区的面积及统计单位视野面积的细
胞总数，每种处理样本至少测量 30个．
1．5 蛋白质电泳及免疫印迹
取 1/2MS培养基上生长 6 天的拟南芥整株幼
苗(seedling)或分别取子叶(cotyledon)、根(root)，置
液氮中研磨，加样品缓冲液后混匀，12 000 g离心
5 min，进行 12%非连续 SDS-PAGE后，电 转移
至 PVDF膜(密理博公司)，5%脱脂奶粉 37℃封闭
1～2 h，加入我室自制的抗钙调素血清(1∶2 000
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生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2011; 38 (1)
Fig． 1 W7 inhibited the growth of Arabidopsis root
(a) The picture of seedlings in 1/2 MS liquid medium supplemented
with or without 100 μmol/L W7, W5 at 5 days after germination. (b)
Measurement of root length of seedlings as mentioned in (a). The data
and error bars represent the x ± s (n ≥ 30, at least two independent
experiments, ***P < 0.001).
稀释)室温孵育过夜，洗膜，转入碱性磷酸酶标记
的二抗(1∶500稀释，中杉金桥公司)中室温孵育 1 h,
洗膜后，加碱性磷酸酶底物显色，采用 microtek
scanmaker i800扫描仪记录图片．
1．6 转基因植株 GUS染色
转 CYCB1;1启动子与 β-葡糖醛酸酶(GUS)融
合基因(CYCB1;1::GUS)拟南芥幼苗的 GUS染色参
照 Jefferson等方法[27]．首先配置 X-gluc母液(100 mg
X-gluc 溶于 5 ml DMF)和基液 (50 mmol/L PBS，
pH7.0，10 mmol/L EDTA-2Na，0.1% Triton X-100，
0.5 mmol/L 铁氢化钾，0.5 mmol/L 亚铁氢化钾 )，
用时将母液与基液按 1∶19的体积比混合成染色使
用液．将在有或无钙调素拮抗剂存在的 1/2 MS培
养液中培养 5天的拟南芥幼苗分别置于上述染色使
用液中，室温染色过夜，透明后，显微照相．
1．7 RT-PCR
总 RNA 的提取参照 Trizol reagent (Invitrogen
公司 )试剂盒提供的方法，利用两步 RT-PCR 法
(TaKaRa公司)对野生型(col-0)及突变体进行转录本
的鉴定．AtCaM2 (At2g41110)转录本扩增所用引物
为：上游引物 FP, 5′ CCCTTTTTCTCCAATCAC-
AG 3′ ,下游引物 RP, 5′ CAATCCTCACTTAGCCA-
TCATAAC 3′ ,扩增片段大小为 494 bp．AtCaM3
(At3g56800)转录本扩增所用引物为：FP，5′ TTT-
CCAGCAGAGACACTTTTTC 3′，RP，5′ CGCGA-
ACTAGACCAAGGTTAC 3′， 扩增片段大小为
1 399 bp．AtCaM4 (At1g66410)转录本扩增所用引
物为：FP, 5′ GGCTCAAATCAAACCCAAGAC 3′，
RP, 5′ CCAAAGAAACGAGAAGAAGAAGC 3′，
扩 增 片 段 大 小 为 583 bp． 内 参 对 照 ACTIN
(At2g37620)转录本扩增所用引物为：FP, 5′ AGG-
CACCTCTTAACCCTAAAGC 3′，RP, 5′ GGACA-
ACGGAATCTCTCAGC 3′，扩增片段大小为 454 bp,
引物合成自上海生工生物技术公司(www.sangon.
com)．
2 结 果
2．1 W7抑制拟南芥幼苗根的生长
在拟南芥中，7个典型的 CaM基因以及 50个
CML 基因已被克隆，这些基因编码的 CaM 及
CML蛋白在功能上可能存在着冗余性，因此借助
单个基因的突变体可能较难观测到明显的表型
变化，因此我们借助了钙调素蛋白的拮抗剂 W7
(N- (6-aminohexyl)-5-chloro- 1-naphthalenesulfonamide),
W7是一种小分子可跨膜的化学药剂，常被用于特
异性地抑制钙调素蛋白活性的实验中，而W7结构
类似物W5对钙调素蛋白活性无影响．在含有一定
量W7药剂的固体培养基上，拟南芥幼苗根的生长
受到了明显抑制，进而采用液体培养这一有利于药
剂施加的培养方式，观察了在W7存在条件下，拟
南芥幼苗根的生长情况(图 1a)．在液体培养体系中
振摇培养 5天时，无外加其他任何药剂的正常培养
液中，拟南芥幼苗的根长平均为(3.99±0.25) mm；
外加 100 μmol/L 的 W5 处理时，根长平均为
(4.15±0.27) mm，与正常培养液培养的幼苗根长相
比差异不显著；外加同样浓度的W7时，根的长度
减少到 (0.52±0.02) mm，只有 W5 处理对照组的
12.5%左右，差异极显著(图 1b)．统计分析表明
W7处理条件下，根的生长受到显著抑制．
2．2 W7抑制根分生组织细胞增殖
根生长受抑制可能由下面的原因造成：一是根
分生区细胞的分裂能力降低，造成细胞数目减少，
根生长受抑制；二是根分生区的细胞分裂活动正
常，但根伸长区细胞的伸长生长受抑制；三是前两
个原因同时存在造成的．为了确定哪种原因影响了
W7对根生长的抑制，我们对液体培养生长 5天的
拟南芥幼苗的根部进行了水合氯醛透明化处理，并
进行了显微镜观察(图 2a)及根分生区的面积及细胞
1/2 MS 1/2 MS+W5 1/2 MS+W7(a)
(b)
0.5
0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
1/2 MS 1/2 MS+W5 1/2 MS+W7
***R
oo
tl
en
gt
h/
m
m
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2．3 W7 抑制细胞分裂标记基因 CYCB1;1在根分
生组织的表达
根据前人文献报道，得到细胞周期素 B1;1启动
子融合 β- 葡萄糖醛酸酶报告基因(CYCB1;1::GUS)
的拟南芥转基因株系，通过 GUS报告基因的化学
底物显色，可以很方便地检测到细胞是否处于分裂
中[28]．W7处理的拟南芥幼苗根分生区面积及细胞
数目明显减小，这说明细胞的分裂活动可能受到了
抑制．为了验证这一点，采用与野生型拟南芥相同
处理条件，对 CYCB1;1::GUS融合基因的转基因拟
南芥幼苗进行了处理， GUS组织染色结果表明，
在两个对照组(图 3a, b)，CYCB1;1基因表达正常，
而用 100 μmol/L W7和另一种常用的钙调素抑制剂
三氟拉嗪(trifluoperazine, TFP)处理的幼苗根尖分生
区均未见到明显的染蓝现象，表明 CYCB1;1基因
在此区域基本上未表达或表达水平很低(图 3c, d )，
这表明 W7和 TFP处理抑制了根尖分生区的细胞
增殖．
Fig． 2 W7 inhibited the cell proliferation in root apical meristem of Arabidopsis
(a) The micrograph of seedlings root in 1/2 MS liquid medium, or supplement with 100 μmol/L W7 or W5 at 5 days after germination (DAG). Double
arrow indicated the root apical meristem (RAM). (b) and (c) The statistic of RAM area and cell number in RAM in 5-DAG seedlings in 1/2 MS liquid
medium ,or supplement with 100 μmol/L W7 or W5. The data and error bars represent the x ± s (n≥ 30, two independent experiments).
大小数目的测量统计分析(图 2b, c)．结果表明，
W7处理的拟南芥幼苗的根分生组织明显变小，与
两个对照相比，其分生区在最清晰最大的一个焦平
面的面积约为对照组的 43%(图 2b)，对该焦平面的
分生区细胞数目的统计结果显示，W7处理的拟南
芥幼苗根分生组织的细胞数目仅为两个各对照实验
组的 40%左右(图 2c)，而W7处理的幼苗分生组织
区细胞在大小上没有明显的变化(未显示数据)．表
明W7对于根伸长的抑制主要是通过抑制分生区细
胞增殖，降低了根细胞总数造成的．
1/2 MS 1/2 MS+W5 1/2 MS+W7(a)
(b)
8
6
10
1/2 MS 1/2 MS+W5 1/2 MS+W7
A
re
a
of
RA
M
/(1
03 ·
μm
2 )
12
14
16
18
20
50
0
100
1/2 MS 1/2 MS+W5 1/2 MS+W7
150
200
250
300
350
Ce
ll
nu
m
be
ri
n
RA
M
(c)
Fig． 3 The effect of W7 and TFP on the expression
of CYCB1;1 in the root meristem of Arabidopsis
transgenic ProCYCB1;1::GUS seedling by GUS stain
(a)1/2 MS liquid medium. (b) 1/2 MS liquid medium with 100 μmol/L
W5. (c) 1/2 MS liquid medium with 100 μmol/L W7. (d) 1/2 MS with
100 μmol/L TFP. Bar =100 μm.
(a) (b) (c)
(d)
50 μm 50 μm 50 μm
100 μm 100 μm
100 μm
100 μm
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2．5 拟南芥钙调素突变体筛选鉴定与表型观察
为了确定哪些钙调素基因参与了拟南芥根细胞
增殖与 ABA 反应，我们借助反向遗传学手段对
AtCaM家族多个基因的 T-DNA插入突变体进行了
筛选鉴定分析，本文只涉及其中的三个基因，即
AtCaM2、 AtCaM3、 AtCaM4 三个基因的 T-DNA
插入缺失突变体(图 5)，T-DNA分别插在了这三个
基因的第二个外显子、5′非编码区及内含子上
(图 5a)，RT-PCR检测表明得到了 cam2，cam3，和
cam4三个基因的缺失突变体(图 5b左图)，通过遗
传杂交及 RT-PCR 鉴定，我们得到了三重突变体
cam2 cam3 cam4 (简写为 cam234)，在 cam234中同
2．4 钙调素拮抗剂W7处理的拟南芥幼苗对 ABA
不敏感
我们将 col-0种子点种到含有不同浓度的 CaM
拮抗剂W7以及不同浓度顺反式混合的 ABA的 1/2
MS 固体培养基上，在长日照条件下观察了拟南
芥幼苗子叶变绿及后期生长的情况．结果表明，
150 μmol/L W7 处理的幼苗对 ABA的敏感性明显
降低，而W7结构类似物W5处理的幼苗，则与正
常培养基对照组相比没有明显不同(图 4a)．统计结
果显示，处理 10 天后，当 ABA 浓度≥2 μmol/L
时，150 μmol/L W7处理的幼苗子叶变绿速率明显
快于两个对照组(图 4b)，在 2 μmol/L ABA存在的
条件下，150 μmol/L W7处理的小苗在第 11天时，
已有约 90%子叶变绿，而对照组的小苗仅有约
40%左右(图 4c)．这暗示着被 W7 抑制的 CaM 蛋
白在幼苗对 ABA敏感性反应中可能起着重要作用.
Fig． 4 Arabidopisis seedlings with treatment of W7 had decreased sensitivity to exogenous ABA
(a) The picture of seedlings at 10th day after stratification on 1/2 MS medium supplemented with different concentrations of (±) ABA, W7, W5(with
structure similarity to W7, but no CaM-inhibitor activity). (b)The effect of exgenous ABA on the appearance of green cotyledons with or without
150 μmol/L W7. The data and error bars represent the x ± s (n ≥ 200, at least three independent experiments). : 1/2 MS; : 1/2 MS+W5;
: 1/2 MS+W7. (c) Time course of appearance of green cotyledons with 2 μmol/L (±) ABA and 150 μmol/L W7. : 1/2 MS + 2 μmol/L
ABA; : 1/2 MS+2 μmol/L ABA+W5; : 1/2 MS+2 μmol/L ABA+W7.
○ ○
□ □ △ △
□ □
△ △ ○ ○
1/2 MS 1/2 MS+W5 1/2 MS+W7(a)
ABA
(μmol/L)
0
4
25
0
1 2 3 4
c(ABA)/(μmol·L-1)
50
75
100
Th
e
ra
tio
of
gr
ee
n
co
ty
le
do
n/
%
(b) (c)
25
0
6 7
t/d
50
75
100
Th
e
ra
tio
of
gr
ee
n
co
ty
le
do
n/
%
8 9 10 11 12 135
○
□
△
○○
○
△
△
△
□
□
□ ○
□
△
△
△
△
△
△△ △
□
□
□
□
□□ □
○○
○
○
○
○○
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Fig． 5 Identification of cam234 triple mutant by RT-PCR and Western blot
(a) The structure map of AtCaM2, AtCaM3, and AtCaM4 gene. The black boxes represent exons, lines indicate introns, 5′ and 3′ untranslated regions,
and triangles indicated the T-DNA insertions．F, forward primer; R, reverse primer; (b) RT-PCR analyses to detect AtCaM2, AtCaM3, and AtCaM4
transcripts in 2-week-old wild-type (WT) and cam234 triple mutant seedlings. Actin as loading control. (c) Western blotting showing CaM protein in
seedling, cotyledon and root of wild type (WT) and cam234 mutant at 6 days after germination. Tubulin as loading control.
时缺失了 AtCaM2、AtCaM3和 AtCaM4 3个基因的
转录本(图 5b 右图 )．蛋白质印迹结果显示，在
cam234三重突变体的全苗及子叶全蛋白中，CaM
含量与野生型相比有略微下降，但根全蛋白中，
CaM含量与野生型相比有显著下降．
在正常生长条件下，与野生型材料相比，各单
突变体及双重突变体在根伸长等方面没有观察到明
显的表型差异(数据未显示)，而 cam234 三重突变
体的根长变短(图 6a)，只有野生型的 70%左右，
统计分析表明差异显著(图 6b)，根分生区面积与
野生型相比也明显变小(图 6c)．当培养基中加入
4 μmol/L顺反式(±)ABA混合物时，cam234子叶变
绿的速率要明显快于野生型(图 6d)．统计结果显
示，处理 22 天后，在 4 μmol/L ABA 存在的条件
下，cam234三重突变体幼苗有 40%子叶变绿，而
野生型幼苗仅有 20%左右(图 6e)，而各单、双重突
变体未见明显表型(数据未展示)．
Root
cam234 WT
Cotyledon
cam234 WT
Seedling
cam234 WT
AtCaM2
Actin
AtCaM3
Actin
AtCaM4
Actin
AtCaM2
AtCaM3
AtCaM4
Actin
cam234 WTcam2 WT
cam3 WT
cam4 WT
Anti-tubulin
Anti-CaM
F
AtCaM2
5′ 3′R
100 bp
cam2
(a)
(b)
(c)
AtCaM3
5′ 3′R
cam3
AtCaM4
5′ 3′R
cam4
F
F
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3 讨 论
不同的生物及非生物刺激会使细胞产生不同的
Ca2+信号，这些 Ca2+信号由下游的 Ca2+受体蛋白
接收，通过信号转导，最终引起生理反应．在植物
中，Ca2+信号的受体蛋白主要有 CDPKs、CBLs、
CaMs和 CMLs等几种[29-30]，CaM作为 Ca2+受体蛋
白在 Ca2+ 信号通路中起着非常重要的作用．
Snedden等[31]分析并总结了 CaM亚型特异性，提出
了不同的 CaM可能接收相同或不同的 Ca2+信号的
观点．随着研究的逐渐深入，CaM单基因相关的
功能陆续被报道，如我室报道 CaM3在热激信号转
导途径中起着重要的作用[32]，CaM7作为一个转录
调节因子在拟南芥幼苗的光控生长发育过程中扮演
着重要的角色[33]．这些研究暗示着 CaM在植物体
生长发育过程中存在着广泛的功能．在动物中已有
研究表明，CaM在细胞的增殖过程中发挥着重要
的功能，其通过与下游靶蛋白如 Calcineurin 和
CaMKs相互作用来完成对细胞的增殖调控[34-35]．有
关植物 CaM蛋白，或是某些特定钙调素基因编码
的蛋白质亚型，是否调控在体植物细胞的增殖尚少
见报道．我们利用反向遗传学手段，通过遗传杂交
得到了 cam234三重突变体，且三重突变体植物根
全蛋白中钙调素含量明显降低(图 5)，在正常生长
条件下，三重突变体植株根的生长受到了抑制，根
尖分生区面积减小(图 6a, b)．此外，借助 CaM蛋
白的拮抗剂W7处理使拟南芥幼苗根的生长受到明
显的抑制，幼苗根分生区面积减小，细胞数目减少
(图 1～3)，而且较高浓度的W7存在下，根分生区
细胞增殖受抑程度较高．拟南芥 cam234三重突变
体和钙调素抑制剂处理的实验数据表明，CaM2、
CaM3、CaM4编码的典型钙调素蛋白可能均参与了
根的生长及根尖分生区细胞增殖过程．
早期的研究表明，Ca2+在 ABA信号转导途径
Fig． 6 Root and cotyledon phenotypes of cam234 triple mutant
(a) The photo of wild type(WT) and cam234 triple mutant seedlings at 6 days after germination (DAG). (b) The statistics of root length of wild type
(WT) and triple mutant cam2cam3cam4 (cam234) at 6 DAG. (c) The statistic of root meristem area of WT and cam234 at 6 DAG. (d) The photos of WT
and cam234 seedlings grew in 1/2 MS mediumwith or without ABA at 10 or 20 DAG. (e) Ratio of the green cotyledons treated with different
concentrations of ABA at 20 DAG. : WT; : cam234. The data and error bars represent the x ± s (n ≥ 100 in three independent experiments,
*P < 0.05, ***P < 0.001).
□ □ ○ ○
WT cam234(a) (b) (c)
(d) (e)WT cam234
1/2 MS
at 10 DAG
1/2 MS
+ABA
at 20 DAG
2.5
0
Ro
ot
le
ng
th
/m
m
5.0
7.5
10.0
12.5
WT cam234
***
10
0
20
30
WT cam234
*
Ro
ot
m
er
ist
em
ar
ea
/(1
03 ·
μm
2 )
20
0
40
60
80
100
Ra
tio
of
gr
ee
n
co
ty
le
do
n/
%
4 8
c(ABA)/(μmol·L-1)
○
○
○□
□
□
42· ·
程玉豆, 等：钙调素参与拟南芥根细胞增殖及幼苗对外源脱落酸的敏感性反应过程2011; 38 (1)
发挥着重要的作用[36]，而 Ca2+信号的传递需要借助
于受体蛋白，研究已证实，Ca2+结合蛋白 CDPKs，
CBLs和 CMLs家族中的某些成员参与了 ABA 信
号转导途径，而作为最重要的一类 Ca2+ 结合蛋
白——CaM则未见报道．已有研究报道 CaM结合
蛋白 AtMYB2作为转录激活因子参与了 ABA信号
反应途径[37-40]．研究表明，ABA可通过抑制细胞周
期蛋白基因 CDKA和 DNA复制起始相关基因 CDT1
等的表达，阻止根尖、胚胎细胞 DNA合成和细胞
分裂．CDKA在细胞周期中起着非常重要的作用，
调控着细胞 G1/S及 G2/M的转变，CYCB1能够正
向调控 CDKA的表达，从而促进细胞的增殖 [41]．
用 CaM抑制剂W7和 TFP处理拟南芥幼苗，其根
分生组织细胞中 CYCB1表达受到明显抑制(图 3c, d),
这表明活性钙调素的存在对于根细胞的正常增殖是
必需的．当W7和 ABA同时存在时，幼苗子叶变
绿的表型呈现对 ABA的敏感性下降(图 4)，这表明
活性钙调素蛋白参与 ABA信号或反应途径．在突
变体表型观察中，cam234三重突变体对 ABA的敏
感性下降(图 6d, e)，表明 cam2，cam3，cam4三个
基因可能均参与了 ABA反应，但与 CaM拮抗剂
相比表型较弱，暗示着除上述三个基因外，可能仍
有其他 CaM基因，甚至非CaM基因参与了 ABA反
应．通过对前人及本实验研究结果分析，我们推测
ABA 可能通过 CaM 调控了拟南芥根细胞增殖，
至于详细的分子调控机制，还有待于进一步的深入
研究．
致谢 感谢巩志忠教授馈赠 CYCB1;1::GUS融合基
因的转基因种子．
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程玉豆, 等：钙调素参与拟南芥根细胞增殖及幼苗对外源脱落酸的敏感性反应过程2011; 38 (1)
Calmodulin Involved in The Cell Proliferation of Root Apical Meristem
and ABA Response in Arabidopsis*
CHENG Yu-Dou**, HAN Shu-Yun**, ZHAO Jun-Feng, Gao Ying-Jie, SUN Da-Ye, CUI Su-Juan***
(Institute of Molecular and Cell Biology, Hebei Key Laboratory of Molecular and Cellular Biology,
Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China)
Abstract Calmodulin (CaM) is an important signal protein in eukaryotes and play multiple regulatory roles in
eukaryotes development in normal and stress conditions. Previous reports showed that calmodulin could accelerate
animals and plants cell proliferation in vitro. However, there is nearly no reports on cell proliferation in vivo in
plants under normal and stress conditions. Here, calmodulin antagonist W7 inhibited the root elongation of
Arabidopsis seedlings, and the area and cell number of root apical meristem were reduced, the expression of
CYCB1;1 gene which plays a key role in cell proliferation was seriously restrained. This data indicates that
activated calmodulin is required for cell proliferation. Abscisic acid (ABA), as a key hormone mediating plant
adaptation to various environmental challenges, regulates many processes of plant growth and development, such
as seed germination and seedling growth. In the present of W7, wild type arabidopsis seedlings are insensitive to
ABA, and cam2cam3cam4 triple mutant had decreased sensitvity to ABA. The results implied that CaM might play
important role in cell proliferation of root apical meristem and involved in ABA response.
Key words CaM antagonist W7, ABA, Arabidopsis, root, cell proliferation, cam2cam3cam4 triple mutant
DOI: 10.3724/SP.J.1206.2010.00441
*This work was supported by grants from National Key Scientific Program (2006CB910600), National Education Department New Century Excellent
Teacher Project (NCET-06-0256) and Hebei Natural Science Foundation for Distinguished Young Scholar (C2009001516).
**These authors contributed equally to this work.
***Corresponding author.
Tel: 86-311-86269144, E-mail: cuisujuan@263.net
Received: August 25, 2010 Accepted: November 9, 2010
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