全 文 ：臭牡丹总黄酮对 A549细胞上皮间质转化相关蛋白的影响
〔摘要〕 目的 观察臭牡丹总黄酮对 A549 肺腺癌细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关蛋白的
影响。 方法 构建 β-catenin 真核过表达载体并转染 A549 细胞，将细胞分为空载组、β-catenin 过表达组、空载组+臭牡丹总黄酮
组、β-catenin 过表达+臭牡丹总黄酮组。 MTT 法检测不同浓度的臭牡丹总黄酮对 A549 细胞体外增殖的抑制作用。 实时定量
PCR 检测各组 β-catenin mRNA 的表达，Western Blot 检测各组 β-catenin、E-Cardherin 、Vimentin 的蛋白水平。结果 MTT 显示
A549 细胞活力随臭牡丹总黄酮浓度的增加受到明显抑制 ，IC50 为 2.1 mg/mL。 β-catenin 过表达组较空载组的 β-catenin、
Vimentin 表达均明显上调 ， E-cardherin 表达下调 。 臭牡丹总黄酮在空载组与 β-catenin 过表达组均能明显降低 β-
catenin mRNA 与蛋白水平，增加 E-cardherin 蛋白表达，略微降低 Vimentin 蛋白表达。 结论 臭牡丹总黄酮对 A549 肺癌细胞具
有一定的体外抑制增殖作用， 其抗肿瘤作用的可能机制是通过调控 EMT 的相关蛋白从而逆转 β-catenin 诱导的 EMT 现象而
起作用。
〔关键词〕 臭牡丹总黄酮;上皮间质转化; β-catenin 过表达载体;A549 细胞
〔中图分类号〕R285.5 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.003
Effect of the Total Flavonoid of Clerodendron bungei Steud on the Epithelial Mesenchvmal
Transition Related Proteins in A549 Cells
YU Na1, MA Sijing2, ZHU Kejian2*
(1. Hunan University of Chinese medicine, ChangSha, Hunan 410208, China;
2.Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410006, China)
〔Abstract〕 Objective To observe the effect of the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud (CMD) on the
epithelial mesenchvmal transition related proteins in A549 cells. Methods Building the β-catenin overexpression vector and
transfected A549 cells. The cells can be divied into empty vector group, β-catenin overexpression group, empty vector group
+ CMD group, β-catenin overexpression+CMD group. The proliferation inhibition of the total flavonoid of Clerodendron bungei
Steud with different concentrations on A549 cells in vitro was detected by MTT method. The expression of β-catenin mRNA
was determined with real -time PCR, and the protein expression of β -catenin, E -Cardherin, Vimentin was detected with
Western Blot. Results MTT showed that the A549 cells vitality were significantly inhibited with the increasing concentrations
of the CMD, the IC50 was 2.1mg/mL. Compared with the empty vector group, the expression of β-catenin and vimentin was
significantly higher, the E-cardherin was lower in β-catenin overexpression group. The total flavonoid of Clerodendron bungei
Steud can reduce the expression of β-catenin, increase the expression of E-cardherin, and slightly reduce the expression of
Vimentin protein in empty vehicle and the β-catenin overexpression groups. Conclusion the total flavonoid of Clerodendron
bungei Steud has a certain proliferation inhibition effect on A549 lung cancer cells in vitro. The possible mechanisms is that,
it can regulate some related proteins to reverse the EMT phenomenon through β-catenin cell signaling.
〔Keywords〕 the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud; the epithelial mesenchvmal transition; β-catenin expression
vector; A549 cell
余 娜 1，马思静 2，朱克俭 2*
（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006）
〔收稿日期〕2016-01-25
〔基金项目〕湖南省自然科学基金项目 (14JJ4066)。
〔作者简介〕余 娜，女，讲师，在读博士研究生，从事中药学教学与科研工作。
〔通讯作者〕* 朱克俭，男，研究员，博士研究生导师， E-mail:zkjo0731@263.net。
2016 年 5 月第 36 卷第 5 期
May． 2016 Vol． 36 No．5
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Hunan Univ． of CM10
原发性支气管肺癌是一种发生于支气管黏膜及
腺体的恶性肿瘤，属中医学“肺积”、“肺岩”、“息贲”
等范畴，其发病率和死亡率在全球以及我国均居首
位 [1-2]。 其中，肿瘤局部复发和远处转移是肿瘤病程
发生发展的主要原因，80%以上的肺癌患者确诊时
癌细胞已发生全身侵犯和转移，进入疾病晚期。 臭
牡丹性平，味辛、苦，有“祛风除湿、解毒散瘀”之功，
对多种肿瘤具有临床治疗作用，尤以肺癌为佳。 臭
牡丹对多种肿瘤细胞具有抑制作用，并有一定预防
肺癌发生及转移的作用[3-4]。
上皮间质转化 （epithelial-mesenchymal transi-
tion, EMT） 现象是肿瘤发生及远处转移的重要因
素，EMT 现象受多条信号通路、 转录因子以及生长
因子的调控 [5]。研究显示 β-catenin 在胞内稳定的高
表达是诱发 EMT 现象的重要因素， 参与肿瘤的侵
袭与转移 [6]。 本研究采用 β-catenin的真核过表达载
体转染人肺癌 A549细胞，诱导 EMT现象的发生，研
究臭牡丹总黄酮对EMT现象标志蛋白 E-Cadherin、
β-catenin、Vimentin 的影响。
1 材料
1.1 细胞
人肺腺癌细胞 A549 购于中南大学高等研究中
心细胞库。 β-catenin 质粒（pCDNA3.1+ 载体，AMP
抗性），空载体 pCDNA3.1+（AMP 抗性），由上海交通
大学金卫林教授馈赠。
1.2 药物及试剂
总 RNA 提取试剂 RNAiso Plus， 逆转录试剂
RT Master Mix Kit 均购自宝生物工程有限公司；
SYBR Green荧光染料购自 Bio-γad 公司；DEPC 水
购自碧云天生物公司；RT-PCR 引物购自 Invitrogen
公司。 引物序列：Anti-β-Catenin (D10A8)、 Anti-E-
Cadherin (24E10) Rabbit mAb、Anti-Vimentin (D21H3)
抗体均购自 cell signaling technology。 Anti-β-Actin
抗体、Western Blot 相关试剂均购自 Sigma Aldrich。
胎牛血清，DMEM 培养液， 胰酶均购自 gibco 公司。
臭牡丹总黄酮由湖南省中医药研究院附属医院中药
房提供臭牡丹生药，经湖南省中医药研究院中药研
究所提取， 总黄酮含量 51%，1 g相当于生药 30 g。
批号：20110720。
1.3 仪器
金属浴 Grant-bi 公司生产； 垂直凝胶电泳系
统、转膜系统、化学发光仪 XRS+由 BIO-RAD 公司
生产；超净工作台，细胞培养箱均由 Thermo Scien-
tific公司生产。
2 方法
2.1 细胞培养及传代
人肺癌细胞 A549 培养于含 10% 胎牛血清的
DMEM 培养基中， 置于 37 ℃，5 % CO2 环境下培
养。传代采用 0.25 %含 EDTA的胰酶消化后直接分
瓶法。
2.2 构建 β-catenin 真核表达载体转染 A549细胞
制备 1DH5α 大肠杆菌感受态， 并克隆连接有
β-catenin 目的基因片段的 pcDNA3.1 过表达载体，
经 Amp筛选后， 选出有外源序列插入的克隆测序。
将 A549细胞按 106个密度接种于 6 孔板中，待细胞
生长至 80%-90%， 使用 Lipo2000 10 uL 分别转染
空载体 pcDNA3.1 (+)/EGFP 和 β-catenin 过表达载
体，每孔质粒量 4 μg，与无血清 DMEM 混匀后加入
6 孔板，6 h 换有血清 DMEM/F12，48 h 后用荧光显
微镜观察转染效率。
2.3 细胞分组与给药
细胞共分为 4 组： 转染空载体组（pcDNA3.1），
转染空载体+臭牡丹总黄酮组（pcDNA3.1+CMD），转
染 β-Catenin 过表达组（β-Catenin），转染 β-catenin
过表达+臭牡丹总黄酮组（β-Catenin+CMD）。用无菌
蒸馏水将臭牡丹总黄酮浸膏配成浓度为 10 mg/mL
的母液，再用无血清培养基配制成 2 mg/mL 的含药
溶液。 待 A549细胞生长密度达 70%~80% 时，加入
含药溶液，置于 37 ℃，5% CO2环境下培养 48 h 后
进行后续实验。
2.4 MTT 方法检测臭牡丹总黄酮对 A549 细胞增
殖的影响
将臭牡丹总黄酮浸膏溶于无菌水中， 母液浓度
10 mg/mL。 取对数生长期的未转染的人肺腺癌
A549 细胞株，按 5 000 个/孔细胞铺于 96 孔板。 培
养 6~8 h 待细胞充分贴壁后 ， 用含 4%FBS 的
DMEM 液配成的不同浓度的臭牡丹总黄酮溶液置
换原培养液， 每孔 200 μL， 共 0、0.1、0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL 12 个浓度组 ，
每组 6 个复孔。 作用 48 h后，吸去上清，撤去药物，
加入 MTT 溶液，37 ℃，5% CO2环境下培养 4 h 后，
吸取板内溶液，加入二甲基亚砜，在 OD490 nm 处
测量各孔的吸光值。
2.5 实时定量 PCR 检测臭牡丹总黄酮对 β -
catenin mRNA 的影响
按“2.3”分组与给药的 4 组 A549 细胞经 PBS
余 娜，等 臭牡丹总黄酮对 A549 细胞上皮间质转化相关蛋白的影响第 5 期 11
n=3，ns 无显著性差异,*** 为 P<0.001
图 1 臭牡丹总黄酮对 β-catenin mRNA 的影响
2-ΔΔCT
清洗后，收集于总 RNA 提取试剂，经反复吹打破碎
后 ， 加入三氯甲烷溶液剧烈震荡混匀后 ， 静置
5 min 后离心，15 min，4 ℃；小心吸取上层澄清的
水相，加入等体积的异丙醇溶液，上下颠倒混匀 10
下，离心分离总 RNA，加入 75 %乙醇（DEPC 水配
制）清洗后，用适量的 DEPC 水溶解。定量后取一定
量 RNA， 加入适量逆转录试剂 ， 于 37 ℃转录
15 min。 反应所得 cDNA 与上下游引物 、SYBR
Green 荧光染料混匀后进行实时定量 PCR 反应。反
应程序为预变性 95 ℃ 10 min， 扩增： 95 ℃ 15 s，
60 ℃ 60 s，最大循环数40，引物序列：ACTIN-qPCR-F，
CACCATTGGCAATGAGCGGTTCACTIN -qPCR -R，
AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT，CTNNB1-qPCR-F，
CACAAGCAGAGTGCTGAAGGTG，CTNNB1 -qPCR -
R，GATTCCTGAGAGTCCAAAGACAG 。 结果采用达
到固定荧光阈值的反应循环数表示， 采用 β-actin作
为内参基因，使用 2-ΔΔCT法对结果进行分析比较。
2.6 Western blot 检测 EMT相关蛋白的表达
按 2.3分组与给药的 4组 A549细胞经裂解液破
碎后，收集总蛋白，蛋白样品与上样缓冲液混合后，
煮沸变性 5~10 min。 蛋白经 SDS-PAGE 凝胶分离，
120 V，70 min后，转移至 NC 膜；载有蛋白质条带的
膜在含有 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液中室温封闭
1 h，然后加入含有稀释一抗（Anti-β-catenin1∶5 000、
Anti-E-cadherin 1∶1 500、vimentin 1∶400，内参 An-
ti-β-actin1∶5 000），4 ℃下振荡孵育过夜，TBST 溶
液洗涤后加入含 1∶2 000 稀释的辣根过氧化物酶
（HRP）偶联抗体反应液（相应蛋白的Ⅱ抗、5%脱脂
奶粉稀释），室温中振荡孵育 1 h。洗涤后，采用 ECL
化学发光显示液曝光。
2.7 统计学方法
采用 SPSS 16.0 统计软件进行统计学分析。 计
量数据用“x±s”表示，组间比较采用单因素方差分
析，并用 Sidak法进行多重比较。 P<0.05为差异有统
计学意义。
3 结果
3.1 臭牡丹总黄酮对 A549细胞增殖的影响
臭牡丹总黄酮处理 A549 细胞 48 h 后，MTT 检
测细胞活力显示，A549 细胞活力受到明显抑制，随
着给药浓度增加，细胞成活率下降，对细胞抑制作用
增强。 其半数抑制率 IC50为 2.1 mg/mL。 见表 1。
3.2 臭牡丹总黄酮对 β-catenin mRNA 的影响
结果显示， 转染 β-catenin 过表达载体的细胞
的 β-catenin mRNA 水平明显增加，而臭牡丹总黄
酮可显著降低 β-catenin 过表达 A549 细胞内 β-
catenin 的 mRNA 水平 ， 也可降低空载组的 β-
catenin mRNA 水平，但差异无统计学意义。见图 1。
3.3 臭牡丹总黄酮对 EMT相关蛋白表达的影响
β-catenin 过表达组较空载组的 β-catenin、Vi-
mentin表达明显上调， E-cardherin 表达略有下调，
有诱导 EMT现象的倾向。臭牡丹总黄酮在空载组与
β-catenin 过表达组均能明显降低 β-catenin 表达，
增加 E-cardherin 表达， 略微降低 Vimentin 蛋白表
达，有逆转 EMT现象的倾向。 见图 2。
4 讨论
臭牡丹，性寒，具有“祛风除湿、解毒散瘀、消肿
止痛之功”，符合肺癌“化瘀解毒”的中医治疗原则。
并具有一定的的补益脾肺肾之力，可治疗肺癌肺肾
气虚所致的虚劳咳喘。 课题组曾采用淋巴瘤 Raji 细
胞与人肺腺癌 A549 细胞对臭牡丹提取物的四个不
同样品进行抗肿瘤实验，发现四个样品均有不同程
表 1 臭牡丹总黄酮各浓度组吸光度 A 值与抑制率浓度
浓度 mg/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
吸光度 1.56±0.25 1.46±0.15 1.43±0.09 1.35±0.12 1.24±0.16 1.05±0.19 0.92±0.23 0.59±0.23 0.40±0.07 0.33±0.03
生长抑制率（%） 0 6.21 8.01 13.46 20.28 32.3 40.62 61.83 73.77 78.34
（x±s，n=6）
湖南中医药大学学报 2016 年第 36 卷12
注：A.pCDNA3.1 组；B.pCDNA3.1+CMD 组；C.β-Catenin 过表
达组；D.β-Catenin 过表达+CMD 组
图 2 臭牡丹总黄酮对 EMT 相关蛋白的调控电泳图
度的体外细胞毒作用，在综合考虑以上四个组分的
抗肿瘤强度、提取工艺等因素后，最终确定臭牡丹总
黄酮为抗肿瘤有效成分之一，并对其抗肿瘤作用机
制进行研究。 臭牡丹黄酮类化合物对 Lewis 肺癌小
鼠皮下瘤及转移瘤、人肺癌细胞 A549、H460 具有一
定的抑制增殖与诱导凋亡作用[7-8]。
上皮间质转化（EMT）是指上皮细胞在特定的生
理和病理情况下，向间质细胞表型转化，同时伴随有
细胞形态与细胞功能的改变[9-10]。EMT现象中具有共
同的细胞学机制，上皮属性蛋白如 E 钙黏蛋白（E-
eadherin）、角蛋白（Keratin)表达下调，间质属性蛋白
如波形蛋白（Vimentin）、纤维连接蛋白（Fibronectin)
表达上升，β-catenin 入核，细胞骨架改变。 其中 E-
cardherin 维持着上皮细胞表型，是肿瘤侵袭转移的
抑制因子。Vimentin 蛋白是 EMT中由上皮属性转向
间质属性的重要标志物， 与肿瘤细胞的侵袭转移密
切相关。 β-catenin 一方面与 E-cardherin 结合，形成
β-eatenin ／E-cadherin 复合体， 调节细胞间粘附，维
持着上皮极性和完整性。 另一方面 β-catenin 可作
为转录激活因子，调控 EMT 相关基因的表达，促进
肿瘤的进展与转移 [11]。 在肿瘤细胞中，β-catenin 在
细胞核内聚集，胞内稳定的高表达是发生 EMT 的重
要条件。 相反，抑制 β-catenin 的表达则可逆转细胞
的 EMT现象[12]。
本研究中采用 β-catenin 过表达质粒转染 A549
细胞， 通过对相关蛋白的检测， 发现高表达的 β-
catenin 有诱导 EMT 现象的作用。 臭牡丹总黄酮对
A549细胞的体外增殖具有一定的抑制作用，随浓度
的升高抑制率增大。 臭牡丹总黄酮对 β-catenin 过
表达组的 EMT相关蛋白具有明显的调控作用，有逆
转 EMT现象的倾向，但在空载组无明显影响。 显示
其抗肿瘤的机制有可能是通过逆转 β-catenin 诱导
的 EMT现象而起作用。
参考文献：
[1] Jemal A， Bray F， Center MM， et al． Global cancer statistics[J]．
CA, Cancer J Clin， 2011，61(2)：69－90．
[2] Ferlay J， Shin HR， Bray F， et al． Estimates of worldwide bur-
den of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 [J]． Int J Cancer，
2010，127(12)：2 893－2 917．
[3] 胡 琦,朱克俭,谭小宁,等.臭牡丹总黄酮对人肝癌 HepG2 细胞增
殖作用的实验研究. 湖南中医杂志,2014,31(4):166-168.
[4] 朱克俭,张亚利,欧阳剑虹,等.保肺饮预防肺癌的临床流行病学研
究[J].中国中医药科技.1997,4(6):332-333.
[5] Riccardo F. Thomas B. Wnt/β -catenin signaling in cancer
stemness and malignant behavior [J]. Curr Opi Cell Biol,2007,19
(2):150-158.
[6] Kwonseop K， Zifan L， Elizabeth D． Direct evjdence for a role
of β -catenin/lef -1 signaling pathway in induction of EMT [J]．
Cell Bio Inter，2002,26(5)：463-476．
[7] Chen YS, Shen SC, Lin HY. Rutinoside at C7 attenuates the
apoptosis-inducing activity of flavonoids [J]. Biochem Pharmacol,
2003,66(7):1 139-1 150.
[8] HUNG Jenyu, HSU Yaling, KO Yingchin, et al. Didymin,
a dietary flavonoid glycoside from citrus fruits, induces Fas-me-
diated apoptotic pathway in human non-small-cell lung cancer
cells in vitro and in vivo[J]. Lung Cancer, 2010, 68(3):366-374.
[9] Christiansen JJ， Rajasekaran AK． Reassessing epithelial to mese
nchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion
and metastasis[J]． Cancer Res，2006，66(17)：8 319-8 326．
[10] Klymkowsky MW， Savagner P． Epithelial-mesenchymal transi-
tion：a cancer researcher’s conceptual friend and foe [J]． Am J
Pathol，2009，174(5)：1 588-1 593．
[11] Valery, Lilia, Francesc. Targeting Wnt/β -catenin pathway
in hepatocellular carcinoma treatment[J]. World Journal of Gas-
troenterology, 2016,22(2):823-832.
[12] Zhao J H， Luo Y， Jiang Y G， et a1． Knockdown of β-catenin
through shRNA cause a reversal of EMT and metastatic pheno-
types induced by HIF-1alpha [J]. Cancer Invest, 2011,29 (6)：
377-382．
（本文编辑 杨 瑛）
余 娜，等 臭牡丹总黄酮对 A549 细胞上皮间质转化相关蛋白的影响第 5 期 13