全 文 ：玉竹提取物 B诱导人结肠癌 CL -187
细胞凋亡的实验研究
李尘远1 , 刘艳华1 , 李淑华1 , 潘兴瑜1 , 杨　光2 , 吕　品2
(1.锦州医学院医学生物学与遗传学教研室 , 辽宁　锦州　121000;2.辽河油田中心医院 , 辽宁　盘锦　124000)
【摘要】　目的　研究中药玉竹提取物 B (EB-PAOA)诱导人结肠癌 CL-187 细胞凋亡的作用。方法　将体外
培养的人结肠癌 CL-187 细胞与不同浓度的 EB-PAOA 共育 , 通过倒置显微镜和透射电镜对活细胞及固定染色
后的细胞进行了观察 , 确认有无凋亡细胞;通过流式细胞仪检测了 CL-187 细胞周期的变化和凋亡率。结果　
在倒置显微镜和透射电镜下 , 可见到大量具有典型特征的凋亡细胞;流式细胞仪 DNA 直方图上出现了凋亡峰 ,
凋亡率呈时间—剂量依赖性 。细胞周期分析结果显示 , G 0 G 1 期细胞减少 , S 期细胞减少 , G2 M 期细胞增多。
结论　EB-PAOA 能够诱导人结肠癌 CL-187 细胞凋亡 , 这可能是 EB-PAOA 抗肿瘤的作用机制之一。
【关键词】　玉竹提取物 B;结肠癌 CL-187 细胞;细胞凋亡
【中图分类号】　R979.1　R735.35　 【文献标识码】　A　【文章编号】　1000-5161(2003)02-0026-04
Apoptosis in Human Colon Cancer CL-187 Cells Induced by the
Extract B of Polygonatum Odoratum
LI Chen-yuan , LIU Yan-hua , LI Shu-hua , et al
(Department of Medical Biology , Jinzhou Medical College , Jinzhou 121001 China)
【Abstract】　Objective　To study the actions of the ex tract B of Polygonatum Odo ratum (EB-
PAOA)on the induction of the apoptosis in human colon cancer CL-187 cells.　Methods　Human
colon cancer CL-187 cells w ere cultured in vi tro wi th different concentration of EB-PAOA.Living
cells and dead cells were observed and detected w hether there w ere apoptotic cells w ith an inverted mi-
croscope and electronmicrograph.Apopto tic rate and cell cy cles were then detected through a f low cy-
tometer.　Results　It can be observed that large number of apoptotic cells had representat ive mor-
phological characterist ics under the inverted microscope and electronmicrograph.An apoptotic peak
appeared in DNA histog ram of the flow cytometer.The apoptotic rate of cell w as of time and dose de-
pendent.The result analysis of cell cycle indicated that the number of cells of G 0 G 1 and S period re-
duced , and the number of G2 M period increased.　Conclusions　EB-PAOA can induce the apop-
tosis of CL -187 cells , which may be one of the mechanism of EB-PAOA s anti-cancer effect.
【Key words】EB-PAOA;colon cancer CL-187 cells;apoptosis
　　肿瘤的发生不仅是由于细胞增生过度 , 亦是细
胞凋亡过少所致 。研究发现 , 在肿瘤的形成过程
中 , 细胞凋亡能力逐渐减弱。人们逐渐认识到诱导
肿瘤细胞的凋亡是治疗肿瘤的有效途径之一 。目前
临床上使用的许多抗肿瘤药物都能诱导肿瘤细胞凋
亡〔1〕。
玉竹是我国传统中药材 , 研究发现 , 玉竹提取
物 B (EB-PAOA)对肿瘤有一定的抑制作用〔2〕。
本实验旨在探讨 EB-PAOA 诱导人结肠癌 CL -
187细胞凋亡的作用 , 以便了解 EB-PAOA 的抗
肿瘤作用机理。
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锦州医学院学报
J Jinzhou Med College　2003 Apr., 24(2)
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　实验仪器
倒置显微镜:OLYMPUS , 日本。
透射电子显微镜;JEM -1200EX型 , 日本 。
超薄切片机:LKB-5型 , 日本。
流式细胞仪:EPICS -PROFILE , Ⅱ型 , 美
国。
1.1.2　主要试剂
玉竹提取物 B:锦州医学院免疫学教研室潘兴
瑜教授提供。
RNA酶 (RNase)和碘化丙啶 (PI):Sigma ,
美国 。
1.1.3　人结肠癌 CL-187细胞株:购自北京大学
医学部肿瘤研究所 , 实验均采用对数生长期 CL -
187细胞 。
1.2　实验方法
1.2.1　倒置显微镜下观察 EB-PAOA对 CL -187
细胞形态的影响
将CL-187细胞接种在 24孔板中 , 每孔数量
为5×104 , 培养 24h , 换培养液 , 对照组细胞用
RPM I 1640继续培养 , 实验组细胞加入含有不同
浓度的 EB-PAOA的培养基 , 于培养后每 4h观察
细胞形态变化。
1.2.2　透射电子显微镜观察凋亡细胞
(1)分别取实验组浓度为 1:500 的 EB -
PAOA作用 8h的细胞和相应的对照组细胞 , 常规
消化后 , 收集于离心管中 , 离心 (800 ～ 1000)
rpm×10min , 取出离心管中的细胞团并将其投入
含预冷的 2.5%戊二醛磷酸缓冲液的小瓶内 , 4℃
固定 12h。
(2)0.2M 磷酸缓冲液洗 15min共 3次。
(3)1% (10g L)锇酸固定 3h , 再用 0.2M
磷酸缓冲液洗 15min共 3次 。
(4)乙醇脱水:50%、 70%、 90%各 15min ,
100%15min共 3次 。
(5)环氧树脂 Epon刻 812包埋 , 放入 37℃温
箱中 1h后置于 60℃, 烤 24h , 然后将 Epon小片置
入含有 Easlman910的 Epon胶囊中 (细胞面朝上),
待包埋剂硬化后 , 用玻璃刀把选定区修好 , 制成电
镜切片团块 , 在超薄切片机切片。
(6)醋酸铀-柠檬酸铅双重染色;透射电镜观
察 (加速电压 80KV)。
1.2.3　流式细胞仪检测凋亡峰和细胞周期
将浓度为 5×104 ml的结肠癌 CL -187细胞悬
液培养 24h。3个实验组细胞分别加入不同浓度的
EB-PAOA , 浓度 (V V)依次为 1:1500 、 1:
1000和 1:500 , 对照组细胞不加药。在加药后的
第 4h 、 8h 和 16h , 各组分别取 3瓶培养细胞进行
检测。
(1)每瓶收集 1×106 细胞 , 用 2ml 1640培养
基制成单细胞悬液 。
(2)离心 1000rpm×5min , 弃上清液。
(3)用 70%预冷的冰乙醇 (-20℃)吹打成
单细胞悬液 , -20℃保存 (24h以上)。
(4)样品离心 1000rpm×5min , 弃上清液。
(5)3ml PBS重悬 5 ～ 10min , 离心弃 PBS 。
(6)1ml含 RNase 的 PI 染液染色 , 4℃避光
30min。
(7)染色后的样品用流式细胞仪检测细胞凋亡
率并进行细胞周期分析 , 数据行统计学分析。流式
细胞仪检测条件为:5W 氩离子激光 , 功率
300mW , 激光波长 488nm , 590nm 长通滤片 ,
SPSS 分析软件 , 低于 G 1 期 DNA含量的细胞判断
为凋亡细胞 。
1.2.4　所有数据均用 Excel统计软件处理。
2　结　　果
2.1　倒置显微镜下观察 EB-PAOA 作用后的 CL
-187细胞形态变化
如图 1所示 , 倒置显微镜下 , 用 EB-PAOA
处理后的细胞变圆 、变小 , 细胞空泡化 , 细胞膜皱
缩发泡 , 符合凋亡细胞特征 。随用药浓度加大 , 培
养时间延长 , 凋亡细胞数目逐渐增多 。
正常对照组细胞大部分形状不变 , 随培养时间
延长 , 可见少量凋亡细胞。
2.2　透射电子显微镜观察凋亡细胞结果
EB-PAOA1 :500作用 8h 的细胞经透射电镜
观察 ,可见凋亡细胞典型形态学特征 ,参见图 2 。可
见 CL-187细胞皱缩 ,染色质固缩 ,呈颗粒 、块状 ,
浓聚于核膜边缘 ,核仁消失 ,胞浆内有大量空泡形
成 ,细胞表面突起 ,似出芽现象 ,与周围细胞分离 。
对照组细胞经透射电镜观察 , 可见癌细胞形态
不规则 , 常染色质及核仁突出 , 核内染色质分布均
匀 , 胞浆内见丰富的线粒体 、粗面内质网及高尔基
体 , 部分癌细胞胞浆内见粘液颗粒。细胞微绒毛多
而粗大 , 核大而浆少 , 核浆比例大。
27李尘远 ,等.玉竹提取物 B诱导人结肠癌 CL-187细胞凋亡的实验研究
　　图 1　EB-PAOA 诱导 CL-187 细胞凋亡的光镜照片
(400×)
图 A:实验组细胞　图 B:对照组细胞;a 胞质空泡化;b胞
膜空泡
　　图 2　EB-PAOA 诱导结肠癌 CL-187 细胞
凋亡的电镜照片 (8000×)
图 A　实验组细胞:a 染色质浓聚于核膜边缘;b 核膜发生皱
褶 , 核浆比例变小;c胞质产生大量空泡
图 B　对照组细胞:a 染色质分布均匀;b核浆比例大;c核仁明显
2.3　流式细胞仪分析结果　图 3为流式细胞仪测
DNA含量直方图 , 可见用药组细胞在二倍体峰
(箭头 1所示)前出现亚二倍体峰 , 即凋亡峰 (Ap
峰 , 箭头 2所示)。本实验通过计数凋亡细胞数目
得出凋亡率 , 结果见图 4 。结果表明 , 随着 EB -
PAOA共育 4h时 , 细胞凋亡比率为 11.2%, 共育
16h时 , 凋亡率达到 34.7;1:500EB-PAOA与
培养细胞共育16h后 , CL-187细胞凋亡的比率达
到 72.2%, 与空白对照组相比 , 实验组细胞凋亡
率均具有显著性差异 (P<0.01)。
细胞周期的分析结果见表 1。结果显示 , 随
EB-PAOA 浓度提高和共育时间延长 , CL -187
细胞出现 G0 G1 期细胞逐渐减少 , S 期细胞减少 ,
G2 M 期细胞增多的现象 , 出现了 G 2 M 期阻滞。
　
图 3　流式细胞仪对 CL-187 细胞检测的 DNA 直方图及细胞周期分析
图 A:对照组　图B:1:500 (V V)的 EB-PAOA 作用 4h
28 锦州医学院学报　2003 年 4 月 , 24(2)
表 1　CL-187 细胞周期各期细胞比率 (%)
浓度
(V V)
4h
0 1:1500 1:1000 1:500
8h
0 1:1500 1:1000 1:1500
16h
0 1:500 1:1000 1:500
G 0 G 1 70.3±2.2 60.3±1.7 55.7±1.8 52.4±1.8 68.2±2.4 59.8±2.3 46.8±2.1 40.1±1.7 67.6±1.5 52.4±2.1 40.1±2.2 38.5±1.5
S 19.6±1.7 17.6±1.1 17.5±1.7 12.7±1.6 18.1±1.5 15.8±1.2 11.7±1.1 9.7±1.2 16.9±1.8 12.7±1.4 9.7±1.2 8.9±0.9
G2 M 10.1±2.5 22.1±2.4 26.8±2.6 34.9±2.1 13.7±2.0 24.4±2.7 41.5±2.7 50.2±2.4 15.5±1.9 34.9±2.5 50.2±3.0 52.6±2.3
　Treatment group vs cont rol group.P<0.01
图 4　EB-PAOA诱导各组 CL-187细胞的凋亡比率
3　讨　　论
近年来随着对细胞凋亡机制的深入研究 , 发现
目前临床上常用的大多数抗肿瘤药物都具有诱导细
胞凋亡的作用 , 诱导凋亡是其抗肿瘤的主要机制之
一。许多中药也具有诱导癌细胞凋亡的作用 , 如人
参皂苷可诱导直肠癌细胞凋亡〔3〕 , 中药丹参根部的
乙醇提取物-丹参酮 ⅡA 可诱导 HL -60细胞凋
亡〔4〕等等。
玉竹 (polygonatum odoratum varpluriflorum
ohwi)是属于百合科 、 黄精属的中草药 。味甘平 ,
性微寒 , 含有多糖 、 单糖 、生物碱 、 菸酸等成份 ,
具有养阴润燥 、 扶正固本的作用。现代研究发现 ,
玉竹提取物 B (EB-PAOA)对肿瘤细胞株 CEM
的增殖具有显著的抑制作用 , 对 S-180移植小鼠
足垫所形成的移植瘤有明显的抑制作用 , 对 S -
180腹腔移植的荷瘤鼠可延长其存活期〔2〕。但是 ,
EB-PAOA抗肿瘤的作用机制尚不清楚 。
本实验形态学检测结果显示 , EB -PAOA 作
用于人结肠癌 CL -187 细胞后 , 出现了大量的凋
亡细胞 。另外 , 流式细胞仪 (FCM)是检测细胞
凋亡有效而灵敏的方法 , 为观察凋亡提供了新的手
段〔5〕 , FCM 的检测说明了 CL -187 细胞随 EB-
PAOA的浓度增大及共育时间的延长 , 凋亡率逐渐
增加。而且 , EB-PAOA主要是作用于G 2 M 期细
胞 , 使G 0 G1 期和 S 期细胞减少 , 抑制细胞增殖 ,
阻止细胞由 G2 期向 M 期 , M 期向 G1 的进程 , 干
扰正常的有丝分裂。结果表明 , EB-PAOA 能够
诱导结肠癌 CL-187细胞株的凋亡 , 同其它抗癌
中药一样 , 诱导凋亡可能是 EB-PAOA 抑制肿瘤
细胞的机制之一 。本实验为开发玉竹提取物 B
(EB-PAOA)成为新型抗肿瘤药物提供了理论依
据 。
参　考　文　献
[ 1] 　粟俭.药物诱导的肿瘤细胞凋亡研究进展 , 国外医学·肿瘤
学分册 , 1995 , 22 (1):7～ 9.
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用.中国免疫学杂志 , 2000 , 16 (7):460.
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察.中国中西医结合杂志 , 2001 , 21 (4):260～ 261.
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凋亡.癌症 , 1998 , 17 (3):164～ 166.
[ 5] 　Telford WG , King LE , Pamela JF.Rapid quant itation of apop-
tosis in pure and heterogeneous cell popolat ions using f low cy-
tomet ry 〔J〕 .J Immunol Mehods , 1994 , 172 (1):1～ 16.
收稿日期:2003-01-19
29李尘远 ,等.玉竹提取物 B诱导人结肠癌 CL-187细胞凋亡的实验研究